钌配合物修饰纳米硒在促进间充质干细胞成骨分化的应用

摘要

本发明属于促进间充质干细胞成骨分化技术领域，公开了一种钌配合物修饰纳米硒在促进间充质干细胞成骨分化中的应用。本发明提供钌配合物修饰纳米硒在促进间充质干细胞成骨分化的应用。本发明的纳米硒不仅能促进人脐带间充质干细胞成骨分化的作用，且由于间充质干细胞的成骨分化与成酯分化存在分化平衡，因此同时具有抑制间充质干细胞成脂分化的作用，并能有效标记间充质干细胞。本发明制备的钌配合物修饰纳米硒，制备过程无需添加其它辅助试剂、产物体系简单，产品可直接保存和使用。本发明采用的修饰剂大大减少了钌配合物修饰纳米硒的细胞毒性，并能够增加细胞的药物摄取量，减少外排，从而保证细胞内药物维持在较高水平。

说明书

技术领域

本发明属于促进间充质干细胞成骨分化技术领域，特别涉及一种钌配合物 修饰纳米硒在促进间充质干细胞成骨分化中的应用。

背景技术

随着人类寿命延长及汽车代步，骨质疏松症、骨质疏松性骨折等骨疾病已 成为严重的全球性公共健康问题。骨疾病的产生是骨代谢中骨形成和骨吸收失 去平衡的表现。骨重建的大致过程是：骨吸收→骨形成→骨静止→骨吸收，这 样一个循环往复。成骨细胞(Osteoblast，OB)和破骨细胞(Osteoclast，OC) 是骨重建中维持骨形态和大小的两种主要细胞。OB来源于间充质干细胞，能 促进骨形成，分泌大量骨胶原、骨基质等细胞因子从而启动骨形成，同时这些 因子将OC偶联起来以控制OC的增殖、成熟及活化。促进间充质干细胞成骨 细胞分化，实现骨形成再生，是防止或治疗因骨含量减少而引起的骨疾病的一 个治疗机会，在骨组织工程中吸引了特别的关注。

脐带间充质干细胞自新生儿脐带分离获取，来源丰富，取材方便、简单， 对新生儿及产妇无任何副作用。脐带免疫系统处于原始阶段，免疫原性低，降 低了细胞治疗后的移植排斥反应。此外，脐带源干细胞更为原始，增殖分化能 力强，可用于骨组织工程或造血系统的治疗，在间充质干细胞的临床应用中具 有广阔的发展前景。目前临床上应用于促进骨形成的骨形成剂主要包括两类， 氟化物和甲状旁腺激素。然而，氟化物的毒性虽小，但长期大量使用可导致骨 硬化，骨强度下降；甲状旁腺激素小剂量间歇给药是能促进骨形成，但大剂量 持续给药则抑制成骨细胞活性。这些问题使其临床应用受到限制。

近年来，寻求高效、无毒，无副作用，具有生物相容性的促进骨形成的药 物，是干细胞应用于骨组织工程治疗骨疾病的一大关键。其中纳米药物基于其 优越性能：小尺寸效应，可实现高效的细胞吸收性；大比表面积，可载带多个 功能基团或活性中心；便于生物降解或吸收等，纳米药物在医药领域得到广泛 的关注和高度重视。

硒(Se)是人体必需的微量元素之一，它具有抗氧化、延缓衰老和防癌、 抗癌的作用，硒纳米粒子(SeNPs)毒性低，且在生物活性方面具有更多的优 势。至今未发现有关纳米硒用于促进间充质干细胞成骨分化的报道。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种钌 配合物修饰纳米硒在促进间充质干细胞成骨分化中的应用。

本发明的目的通过下述方案实现：

钌配合物修饰纳米硒在促进间充质干细胞成骨分化中的应用。

所述钌配合物修饰纳米硒为活性成分，具有促进间充质干细胞成骨分化的 作用。

所述的钌配合物修饰纳米硒指钌配合物-X修饰的纳米硒，其中，X为柠 檬酸、天冬氨酸、谷氨酸、维甲酸或维生素C，钌配合物为联吡啶钌配合物或 邻菲罗啉钌配合物。

所述的钌配合物修饰纳米硒(X-Ru@Se)优选通过如下方法制备得到：

取Na₂SeO₃溶液、联吡啶钌配合物或邻菲罗啉钌配合物溶液和水混合，搅 拌下滴加X溶液后继续搅拌，得到红色纳米溶胶，室温放置，离心、洗涤、 干燥，得到钌配合物修饰纳米硒。

所述Na₂SeO₃溶液浓度为0.1～1.0mol/L。

所述联吡啶钌配合物或邻菲罗啉钌配合物溶液浓度为0.02～0.2mmol/L。

所述X溶液浓度为0.1～1.0mol/L。

优选地，所用Na₂SeO₃溶液、联吡啶钌配合物或邻菲罗啉钌配合物溶液和 水的摩尔比为1:0.2:10。

所用X溶液与Na₂SeO₃溶液的摩尔比为0.1:1～2:1。

优选地，所述继续搅拌指搅拌2～5h。

优选地，滴加X溶液时保持体系pH为9～11，优选通过盐酸调节，更优 选通过0.1mol/L盐酸调节。

优选地，所述室温放置的时间为24h。

优选地，制备得到的红色纳米溶胶可于4℃储存。

优选制备过程中所用的水为由Milli-Q系统制备的纯净水或超纯水。

上述制备过程中，通过调节X溶液体积调节所制纳米硒的粒径。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：

(1)本发明提供钌配合物修饰纳米硒在促进间充质干细胞成骨分化中的 应用。本发明的纳米硒不仅能促进人脐带间充质干细胞成骨分化的作用，由于 间充质干细胞的成骨分化与成酯分化存在分化平衡，因此本发明的纳米硒同时 具有抑制间充质干细胞成脂分化的作用，并能有效标记间充质干细胞。

(2)本发明制备的钌配合物修饰纳米硒，制备过程无需添加其它辅助试 剂、产物体系简单，产品可直接保存和使用。

(3)本发明采用的修饰剂大大减少了钌配合物修饰纳米硒的细胞毒性， 并能够增加细胞的药物摄取量，减少外排，从而保证细胞内药物维持在较高水 平。

附图说明

图1是联吡啶钌配合物-柠檬酸修饰的纳米硒的透视电镜图。

图2是柠檬酸修饰的纳米硒的透视电镜图。

图3是钌配合物修饰纳米硒促进干细胞成骨分化染色图。

图4是钌配合物修饰纳米硒抑制干细胞成脂分化染色图。

图5是钌配合物修饰纳米硒激活BMP信号通路，促进p-Smad1/5表达的 免疫荧光图像。

图6是钌配合物修饰纳米硒有效标记间充质干细胞的激光共聚焦图像。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方 式不限于此。

本发明所用原料的纯度只要达到分析纯以上即可，来源均可从市场购得。 所选取的细胞均为第4代人脐带间充质干细胞(细胞从新生婴儿脐带上分离取 得，新生婴儿脐带由暨南大学附属第一医院提供，取自健康产妇孕婴。)

实施例1：联吡啶钌配合物-柠檬酸修饰的纳米硒(Cit-Ru@Se)的制备

[Ru(bpy)₂(dhipH₃)](ClO₄)₂的制备：cis-[Ru(bpy)₂Cl₂]·2H₂O(广州东征化 玻仪器有限公司)(0.156g，0.3mmol)和3,4-二羟基-咪唑并[4,5-f][1,10]-邻菲 罗啉(dhipH₃)(广州东征化玻仪器有限公司)(0.098g，0.3mmol)溶于10mL 乙二醇中，氩气保护下120℃加热6h。溶液逐渐变为亮红色。冷至室温后， 边搅拌滴加饱和NaClO₄，立即产生大量红色沉淀。搅拌静置后将溶液抽滤， 粗产物经洗涤干燥后，用中性氧化铝(200目)柱分离。洗脱液为V(甲苯): V(乙腈)＝1:4的混合溶剂，收集主要的红色条带组分，减压蒸去溶剂，即 得到亮红色[Ru(bpy)₂(dhipH₃)](ClO₄)₂晶体。

[Ru(phen)₂(dhipH₃)](ClO₄)₂的制备方法同上，以[Ru(phen)₂(dhipH₃)](ClO₄)₂(广州东征化玻仪器有限公司)(0.17g，0.3mmol)代替 cis-[Ru(bpy)₂Cl₂]·2H₂O。

(1)将[Ru(bpy)₂(dhipH₃)](ClO₄)₂和[Ru(phen)₂(dhipH₃)](ClO₄)₂分别溶解 于纯净水中配制成0.2mmol/L的储备液，并储存在4℃备用；

(2)取2.9410g柠檬酸钠溶解于10mL纯净水配制成1mol/L的溶液， 并储存在4℃备用；

(3)将1.7294g Na₂SeO₃溶解于10mL纯净水配制成1mol/L的溶液，并 储存在4℃备用；

(4)分别取1mL Na₂SeO₃溶液、2mL[Ru(bpy)₂(dhipH₃)](ClO₄)₂储备液和 10mL超纯水混合，得到溶液A；将1mL1mol/L柠檬酸钠溶液在不断搅拌 下滴加到溶液A中，过程中保持pH值为9～11；继续搅拌2～5h，得酒红色纳 米溶胶；通过TEANAI-10型透射电子显微镜(TEM)观察，如图1所示。得 到纳米粒子的分散体系，其粒径在100～120nm。该纳米粒子能在室温下稳定 存在，容易保存；离心、洗涤、干燥，得到联吡啶钌配合物-柠檬酸修饰的纳 米硒(Cit-Ru@Se)。

(5)取1mL Na₂SeO₃溶液，滴加2mL0.1mol/L柠檬酸钠溶液，调节其 pH值为9～11。在不断搅拌下，将0.5mL0.1mol/L的硼氢化钠溶液滴加到上 述溶液中，持续搅拌4～6h，得到砖红色的柠檬酸修饰纳米硒(Cit-Ru@Se) 溶胶。其形貌通过TEANAI-10型透射电子显微镜(TEM)观察，如图2所示。 得到纳米粒子的分散体系，其粒径在70～95nm。该纳米粒子能在室温下稳定 存在，容易保存。

(6)联吡啶钌配合物-天冬氨酸修饰的纳米硒、联吡啶钌配合物-谷氨酸 修饰的纳米硒、联吡啶钌配合物-维甲酸修饰的纳米硒和联吡啶钌配合物-维生 素C修饰的纳米硒制备方法同步骤(4)，只是把1mol/L柠檬酸钠溶液换成对 于1mol/L的天冬氨酸溶液、谷氨酸溶液、维甲酸溶液或维生素C溶液。

(7)邻菲罗啉钌配合物-柠檬酸修饰的纳米硒的制备方法同步骤(4)，仅 是把0.2mmol/L的[Ru(bpy)₂(dhipH₃)](ClO₄)₂储备液改为0.2mmol/L [Ru(phen)₂(dhipH₃)](ClO₄)₂储备液。

实施例2：联吡啶钌配合物-柠檬酸修饰的纳米硒(Cit-Ru@Se)体外促进 干细胞成骨分化的实验

人脐带间充质干细胞(HUMSCs)的分离培养：根据医院规定并经家属同 意，从手术台取正常足月产健康婴儿脐带组织，浸泡于DMEM中。于超净工 作台内取出脐带，用D-Hanks’平衡液充分洗涤脐带上残留的血液，去除脐静 脉、脐动脉及脐带外膜后，剥离Wharton胶，并将其剪碎为约1mm³的组织块。 将组织块移至胶原酶Ⅱ(1g/L)中，加入少许DMEM，在37℃恒温震荡仪内 消化，直至Wharton胶全部消化。将含细胞的消化液吸入无菌离心管，加入 30倍体积的DMEM反复吹打稀释，1500r/min离心10min后，弃上清液，用 含15％FBS的DMEM/F12培养基吹打稀释，使细胞悬液均匀分布，转移至普 通培养瓶中，在37℃、5％CO₂培养箱内培养。细胞贴壁后，第3天进行半量 换液，弃去未贴壁细胞，以后每3～4天换液1次。倒置显微镜下观察，细胞达 90％融合后，用1.25g/L的胰酶消化，按1:2～1:3的比例传代，续扩增培养。

人脐带间充质干细胞(HUMSCs，5×10⁵细胞每孔)分别接种于24孔组 织培养板中，置于5％CO₂，37℃培养箱培养3天。将基础培养基除去，换成 含有成骨诱导成分的诱导液(即成骨诱导剂OS，DMEM(H)+10％FBS+双 抗+10mmol/Lβ-甘油磷酸钠+0.1μmol/L地塞米松+50mg/L维C)，并分 别加入实施例1制备的联吡啶钌配合物修饰纳米硒(最终浓度为5μg/mL)或 NaF(最终浓度为1mmol/L)，培养7和14天。矿化节结的形成由茜素红(Alizarin  Red S)染色。吸除培养基，用预冷的PBS冲洗细胞2次后，用100％乙醇固 定10～15min。PBS冲洗2次室温干燥后，加入茜素红染色试剂，30min染色 试剂显色后，流水冲洗干燥后拍照。并用20％甲醇和10％乙酸溶解、萃取细 胞内的染色的矿化结节，在450nm处使用NanoDrop紫外-可见分光光度检测 其OD值。

矿化促进率＝[OD_sample-OD_blank]/[OD_control-OD_blank]×100％。

成骨诱导(OS)处理的HUMSCs用来作为正常对照组，而1mmol/mL NaF 作为阳性对照。经过14天的成骨诱导，HUMSCs的矿化程度通过茜素红染色 来评估。相对于正常对照组，本发明的联吡啶钌配合物修饰的纳米硒 (Cit-Ru@Se)、柠檬酸修饰的纳米硒(Cit@Se)、NaF的矿化程度均有较大的 增强效果。其中，如图3所示，本发明的Cit-Ru@Se增强了约28.34％，相对 于Cit@Se增强的21.9％和NaF增强的15.68％具有更明显的效果。实验结果 表明本发明的联吡啶钌配合物修饰的纳米硒具有良好的脂溶性和水溶性，易被 间充质干细胞吸收内化。在体外试验中对间充质干细胞成骨分化具有很好的促 进作用，比NaF和柠檬酸修饰的纳米硒的疗效要好，显示良好的应用价值， 适合制备成促进骨形成药物。

实施例3：联吡啶钌配合物-柠檬酸修饰的纳米硒(Cit-Ru@Se)体外抑制 干细胞成脂分化的实验

人脐带间充质干细胞(每孔5×10⁵细胞)接种于24孔组织培养板中，置 于5％CO₂，37℃培养箱培养3天。将基础培养基除去，换成含有成脂诱导成 分的诱导液(即成脂诱导剂AS，DMEM(L)+10％FBS+10μmol/L地塞米松+200 μmol/L吲哚美辛+0.5mmol/L3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)+10mg/L胰岛 素)，并分别加入实施例1制备的联吡啶钌配合物修饰纳米硒(最终浓度为5 μg/mL)或NaF(最终浓度为1mmol/L)，诱导9和18天。培养基中加入本发 明的钌配合物修饰纳米硒为实验组，NaF为阳性对照组。干细胞分化的脂肪细 胞内的脂肪滴通过油红O染色方法进行评价。吸除培养液，预冷的PBS冲洗 细胞2次后，用4％多聚甲酸固定10～15min。PBS冲洗2次室温干燥后，加 入油红染色试剂，15min染色试剂显色后，轻柔冲洗干燥后镜下观察拍照。

成脂分化抑制率＝[OD_sample-OD_blank]/[OD_control-OD_blank]×100％。

成脂诱导(AS)处理的HUMSCs用来作为正常对照组，而1mmol/mL NaF 作为阳性对照。经过18天的成骨诱导，HUMSCs的成脂情况通过油红O染色 来评估。相对于正常实验组，本发明的钌配合物修饰的纳米硒抑制率明显提高。 其中，如图4所示，联吡啶钌配合物-柠檬酸修饰的纳米硒(Cit-Ru@Se)、柠 檬酸修饰的纳米硒(Cit@Se)、NaF的成脂分化受到的抑制率约35.81％， 27.53％，14.90％。实验结果表明本发明的钌配合物修饰的纳米硒(X-Ru@Se) 在体外试验中对间充质干细胞成脂分化具有很强的抑制作用。间充质干细胞分 化为成骨细胞和脂肪细胞之间存在着很大程度的可塑性，并且两者转化是相 互。本发明的联吡啶钌配合物修饰的纳米硒(X-Ru@Se)通过抑制间充质干 细胞成脂肪细胞分化并增加其成骨分化，是防止或治疗因骨含量减少引起的骨 疾病的一个潜在治疗机会。

实施例4：联吡啶钌配合物-柠檬酸修饰的纳米硒(Cit-Ru@Se)对BMP 信号通路关键蛋白p-Smad1/5表达的影响

Smad1/5蛋白是BMP信号通路涉及的关键蛋白。当BMP信号通路被激 活时，Smad1/5蛋白进行磷酸化，生成p-Smad1/5蛋白，p-Smad1/5蛋白与Smad 4蛋白结合形成共同体进入细胞核调控成骨分化相关基因的表达，从而促进干 细胞成骨分化。

人脐带间充质干细胞以密度为1×10⁷个细胞接种到聚焦培养皿中在37℃ 培养3天。然后将培养基更换，并分别添加2mL本发明的联吡啶钌配合物修 饰纳米硒、Noggin(终浓度为10μg/mL)(Noggin，头蛋白，——BMP信号通 路抑制剂。购自Sigma)的成骨诱导培养基。37℃孵育4小时后，细胞用PBS 清洗3次，用4％多聚甲醛固定细胞30min，然后含0.25％Triton X-100的PBS 通透10分钟。随后加入磷酸化Smad1/5在4℃孵育过夜，然后与FITC标记的 二抗体在室温下孵育1小时。最后，将细胞用DAPI染色。激光共聚焦图片用 Zeiss共聚焦显微镜拍摄获取。

从图5可以看出，本发明的联吡啶钌配合物修饰的纳米硒(Cit-Ru@Se) 作用下间充质干细胞中p-Smad1/5蛋白的绿色荧光强度最大。钌配合物修饰的 纳米硒(X-Ru@Se)作用下间充质干细胞中p-Smad1/5蛋白的表达水平比阳性 对照组NaF处理的大大提高。这说明本发明提供的联吡啶钌配合物修饰纳米 硒能够作为促进骨形成的药物。此外，图5的结果还表明，在间充质干细胞成 骨分化过程中，联吡啶钌配合物修饰纳米硒通过激活BMP信号通路从而促进 干细胞成骨分化。

实施例5：联吡啶钌配合物-柠檬酸修饰的纳米硒(Cit-Ru@Se)有效标记 间充质干细胞的细胞成像

人脐带间充质干细胞以1×10⁴接种于激光共聚焦皿中，置于37℃，5％ CO₂培养箱培养24h后，每个共聚焦皿中加入联吡啶钌配合物修饰的纳米硒 (X-Ru@Se)，最终浓度为10μg/mL。加入实施例1制备得到的钌配合物修饰 纳米硒后，细胞放回培养箱继续培养12h后，用PBS洗涤细胞3次，除去未 被吸收内化的纳米粒子。再将细胞放回培养箱继续培养12h、48h。将共聚焦 皿中培养基换成无血清的基础培养基，用Zeiss共聚焦显微镜拍摄获取钌配合 物修饰纳米硒标记的间充质干细胞的细胞图像。

图6显示加入Cit-Ru@Se标记的间充质干细胞12h、48h后，其荧光强 度的变化不大，说明本发明联吡啶钌配合物修饰的纳米硒(X-Ru@Se)能稳 定标记间充质干细胞。通过结合前面所述实施例子，说明钌配合物修饰纳米硒 是一个生物相容性良好，有效促进骨形成的细胞标记材料。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实 施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、 替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。