一种检测白细胞介素-6的试剂盒以及非诊断目的检测白细胞介素-6的方法

摘要

本发明涉及免疫分析领域，特别涉及一种检测白细胞介素-6的试剂盒以及非诊断目的检测白细胞介素-6的方法。该试剂盒包括生物素化抗体、酶标记抗体、化学发光底物和亲和素偶联的超顺磁微粒；生物素化抗体为生物素N羟基丁二酰亚胺酯与抗白细胞介素-6单克隆抗体A偶联的产物；酶标记抗体为酶与抗白细胞介素-6单克隆抗体B偶联的产物。本发明提供的试剂盒具有检测灵敏度高，特异性好，检测时间短，检测过程简单，并能方便用于全自动检测仪器等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及免疫分析领域，特别涉及一种检测白细胞介素-6的试剂盒以 及非诊断目的检测白细胞介素-6的方法。

背景技术

白细胞介素-6(IL-6)是细胞因子的核心成员，1980被发现，1986年被 统一命名为IL-6，相对分子量为Mr26000，它是由212个氨基酸组成的多功 能糖蛋白，主要由单核-巨噬细胞、T淋巴细胞和纤维母细胞合成，可以促进 肝脏合成急性期蛋白，激活T淋巴细胞，并诱导B淋巴细胞的终末期分化， 使之成为具有分泌免疫球蛋白的免疫活性细胞。IL-6所具有的多种生物学功 能，在抗感染、肿瘤、免疫性疾病及免疫调节等诸多方面发挥重要作用。在 异常情况下，IL-6的升高可能对机体产生不利影响，造成组织损害和加重病 情发展。随着医学研究的不断深入，IL-6在临床诊断上的重要性日益增加。 目前IL-6在临床诊断上的应用主要有以下方面：

1、炎症反应

感染、创伤、大手术等因素可诱发全身炎症反应综合征(SIRS)，严重 时可发展为多器官功能障碍综合征(MODS)，甚至死亡。IL-6是一种重要的 促炎细胞因子，异常释放会导致机体多器官细胞代谢障碍和功能损害。国内 有学者报道，重度多发性创伤患者从受伤当日至出院前血中IL-6明显升高。 Miyaoka等发现，在正颌外科手术后继发SIRS患者的IL-6浓度明显高于未 继发SIRS的患者，IL-6是SIRS患者预后的一个预测因素。也有研究发现， SIRS患者第1天血清IL-6浓度明显升高，并且在发生MODS患者中明显高 于未发生MODS患者，在死亡患者中明显高于存活者，说明IL-6浓度的高 低预示着SIRS患者病程的进展。

多项研究表明，IL-6对新生儿败血症的诊断也有重要意义。金雅磊等报 导，脐血IL-6水平与新生儿败血症的发生有一定关系，IL-6可作为新生儿败 血症的早期诊断指标。金益人等研究表明新生儿败血症及败血症休克早期血 清IL-6水平升高，与病情、预后有关，早期检测意义较大。陈小琴、陈云的 研究表明，IL-6对新生儿败血症诊断的敏感性、特异性、阴阳性预测值均优 于CRP和PCT，而三个指标联合应用则效果更好，揭示了IL-6对新生儿败 血症的良好诊断价值。

2、肿瘤免疫

生物体通过多层次、精确的内部调节机制，完成发育、分化、代谢等各 项正常的生理活动。一旦这些调控系统出现紊乱，细胞失去对分化、增值、 凋亡等过程正确及时的调控，正常的组织形态就会出现恶性转化，导致肿瘤 的发生。IL-6的失调就可能导致肿瘤的发生。

近年来研究发现IL-6与肿瘤的发生关系密切，并与其诊断和预后相关 联。有文献报道通过对胆管癌(BDC)患者、肝细胞癌(HCC)患者及正常 人血清IL-6水平的研究，发现IL-6的浓度在BDC中明显高于HCC和正常 人的水平，BDC经过光子治疗后IL-6的水平恢复正常，因此血清IL-6测定 对于诊断BDC具有重要参考意义，且可作为用光子疗法治疗BDC的效果监 测指标。Hsia等发现在肝癌中，应用血清学测定IL-6较良性肝脏疾病和非肝 细胞癌肿瘤高，IL-6可以帮助鉴别甲胎蛋白(AFP)不高的一组肝细胞癌病 人，因此IL-6可以用于辅助肝细胞癌的诊断。Tan等在对鼻咽癌的研究中发 现，EB病毒(EBV)的病毒载量与IL-6的水平可作为肿瘤诊断的标志物， 也是判断预后的指标。Clinchy等报道结肠癌病人术后将外周血单个核细胞 (PBMC)培养，测定上清液中的IL-6，发现浓度>5000pg/mL IL-6病人有极 差的预后，IL-6水平越低预后越好，故认为PBMC培养的IL-6水平可以作 为结肠癌预后指标。以上实验都表明常规的肿瘤诊断联合测定IL-6的水平在 肿瘤的诊断和预后中具有重要意义。Salgado R等研究表明循环中的IL-6与 转移性乳腺癌的低生存率有关，并且与病变范围有关，通过96个未接受系统 治疗的进展转移性的乳腺癌患者，测定血清中IL-6水平，统计学分析表明高 水平的IL-6对其预后有独立的价值。Tempfer等通过73个不同分期的卵巢癌 病人，在未接受治疗前按酶联免疫吸附试验(ELISA)方法测定血清中的IL-6 水平，结果表明IL-6水平与FIOGO分期、淋巴结转移、肿瘤的分级无关， 但IL-6升高与肿瘤复发和低生存率有显著关系。Yamaoka等研究发现，早起 胃癌伴活动性幽门螺杆菌(HP)感染者其IL-6水平较无HP感染早期胃癌明 显升高，在HP治疗后又明显下降，说明IL-6水平与HP感染有关。同时， 胃癌组织与正常胃粘膜组织相比，IL-6水平明显增高，因此，推断IL-6与伴 有HP感染的胃癌有关。

3、心血管疾病

IL-6参与了冠状动脉粥样硬化的形成，是冠脉事件的预测因子，与心力 衰竭的进展相关。此为，IL-6与心脏粘液瘤和不稳定型心绞痛等心血管疾病 也有一定的关系。

一项3090例冠心病病人的病例对照研究表明，发生冠脉事件组的IL-6 水平明显高于没有发生冠脉事件的对照组(65pg/mL：2.34pg/mL)，IL-6每 增加1pg/mL，急性心肌梗塞(AMI)和猝死的相对优势增加1.70(1.23～ 2.45)。血清IL-6水平反映了冠脉病变的严重程度和不稳定型心绞痛及AMI 的预后，是比CRP和ICAM-1更好的冠脉事件的预测因子。Mendoza等研究 发现心脏粘液瘤复发时，IL-6的浓度常明显增高，认为IL-6有可能成为测定 心脏粘液瘤复发的一个标志。此外，IL-6作为粘液瘤细胞的自分泌生长因子， 其过度表达也可能导致肿瘤复发、远处转移和栓塞。冯小平等研究发现，测 定血清中IL-6和HS-CRP的水平对不稳定性心绞痛(UAP)的诊断有价值， 有助于UAP的早期诊断和病变程度的判断。一些研究也表明，IL-6还与脑 梗死、2-型糖尿病、慢性肾功能衰竭等疾病的发生与发展有关。

目前临床上对IL-6的检测，基本都是采用酶联免疫吸附试验法(ELISA)， 该方法采用抗体包被固相板孔，并采用酶催化底物产生颜色变化的方式进行 检测；该方法需要进行多步操作，整个检测过程耗时2～4小时；而且该方法 通常只适用手工操作，不利于全自动检测仪器的检测，加大了实验结果人为 因素引起的误差；并且ELISA方法具有灵敏度较低(通常只能达到ng/mL 的灵敏度水平)，检测时间长等缺点，限制了该方法进一步的应用。因此，提 供一种分析灵敏度更高的IL-6检测试剂盒具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种检测白细胞介素-6的试剂盒以及非诊断目 的检测白细胞介素-6的方法。该试剂盒具有检测灵敏度高，特异性好，检测 时间短，检测过程简单，并能方便用于全自动检测仪器等优点。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种检测白细胞介素-6的试剂盒，包括生物素化抗体、酶 标记抗体、化学发光底物和亲和素偶联的超顺磁微粒；

生物素化抗体为生物素N羟基丁二酰亚胺酯与抗白细胞介素-6单克隆抗 体A偶联的产物；

酶标记抗体为酶与抗白细胞介素-6单克隆抗体B偶联的产物。

该试剂盒的检测原理为：当样本中含有抗原“白细胞介素-6”时，生物 素化抗体、抗原与酶标记抗体在37℃中进行反应，形成生物素化抗体-抗原- 酶标记抗体免疫复合物；然后再加入亲和素偶联的超顺磁微粒，37℃中反应， 形成磁微粒-生物素化抗体-抗原-酶标记抗体免疫复合物；经过洗涤除去未参 与反应的物质，加入酶对应的化学发光底物，免疫复合物上的酶作用于发光 底物，在信号试剂作用下发光，由特定仪器检测发光信号。

在本发明中，抗白细胞介素-6单克隆抗体A与抗白细胞介素-6单克隆抗 体B均为识别白细胞介素-6的抗体，但抗白细胞介素-6单克隆抗体A识别 抗原的表位与抗白细胞介素-6单克隆抗体B识别抗原的表位不同。

本发明提供的试剂盒与白细胞介素-6(IL-6)ELISA试剂盒相比具有如 下优点：1)本发明属于酶促化学发光技术，与ELISA试剂产生显色示踪信 号相比，具有检测灵敏度高、检测限性范围宽、可以延长检测时间。2)采用 生物素-亲和素多级放大体系，由于一个亲和素分子能够结合多个生物素分 子，因此把生物素-亲和素系统与高灵敏度的化学发光法结合起来，可以大大 提高化学发光试剂产品的敏感度，实现pg级别甚至更低水平的检测灵敏度。 3)ELISA采用传统的微孔板式包被固定相，而本发明采用磁微粒偶联抗体 作为固定分离相，具有更大的抗体包被表面积，增大了与被检测物的接触几 率，整个免疫反应均在近似液态中进行，能大大缩短反应时间，且磁微粒固 相对磁场响应性的特点，使反应物的分离、洗涤过程变的非常简便，更适合 应用到全自动分析仪器上。

作为优选，超顺磁微粒的直径为500nm～5μm。

优选地，超顺磁微粒的直径为1～3μm。

作为优选，超顺磁微粒的浓度为1～10mg/mL。

在本发明提供的一些实施例中，超顺磁微粒表面的活性基团为羧基 (-COOH)或氨基(-NH₂)。

作为优选，超顺磁微粒表面的活性基团为羧基(-COOH)。

在本发明提供的一些实施例中，亲和素为链霉亲和素蛋白。

作为优选，亲和素的浓度为1～5mg/mL。

在本发明提供的一些实施例中，酶标记抗体中的酶为辣根过氧化物酶 (HRP)。

当酶为辣根过氧化物酶时，所对应的化学发光底物为鲁米诺或异鲁米诺。

在本发明提供的一些实施例中，当化学发光底物为鲁米诺或异鲁米诺时， 化学发光底物液中还包括增强剂和氧化剂。

在本发明提供的另一些实施例中，酶标记抗体中的酶为碱性磷酸酶 (ALP)。

当酶为碱性磷酸酶时，所对应的化学发光底物为3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲 氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐(AMPPD)。

本发明还提供了该试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

获得亲和素偶联的超顺磁微粒；

获得生物素化抗体；

获得酶标记抗体；

取亲和素偶联的超顺磁微粒、生物素化抗体、酶标记抗体和化学发光底 物组合，即得。

在本发明提供的一些实施例中，亲和素偶联的超顺磁微粒的制备原理为： 超顺磁微粒表面的活性基团为羧基或氨基，通过化学交联试剂活化超顺磁微 粒，使之分别与亲和素蛋白的氨基或羧基基团共价结合，形成稳定的标记物。

在本发明提供的一些实施例中，亲和素为链霉亲和素蛋白。

作为优选，亲和素的浓度为1～5mg/mL。

作为优选，超顺磁微粒的直径为500nm～5μm。

优选地，超顺磁微粒的直径为1～3μm。

作为优选，超顺磁微粒的浓度为1～10mg/mL。

在本发明提供的一些实施例中，超顺磁微粒表面的活性基团为羧基 (-COOH)或氨基(-NH₂)。

作为优选，超顺磁微粒表面的活性基团为羧基(-COOH)。羧基基团的 磁微粒在化学交联剂EDC【1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐】作 用下，与链霉亲和素蛋白(SA蛋白)的氨基基团形成酰胺键而共价结合。

在本发明提供的一些实施例中，生物化抗体的制备原理为：由于生物素 是小分子物质，不能直接与抗体进行偶联，需要经过修饰之后，才能与蛋白 偶联。优选N-羟基丁二酰亚胺酯修饰生物素后形成生物素N羟基丁二酰亚 胺酯(biotin-hydroxysuccinimide，缩略词为BNHS)，再与抗白细胞介素-6单 克隆抗体偶联。优选地，用于偶联生物素的抗白细胞介素-6单克隆抗体与偶 联酶的抗白细胞介素-6单克隆抗体为针对白细胞介素-6不同表位的抗体。

在本发明提供的一些实施例中，酶标记抗体中的酶为辣根过氧化物酶 (HRP)。

当酶为辣根过氧化物酶时，所对应的化学发光底物为鲁米诺或异鲁米诺。

在本发明提供的一些实施例中，当化学发光底物为鲁米诺或异鲁米诺时， 化学发光底物液中还包括增强剂和氧化剂。

在本发明提供的另一些实施例中，酶标记抗体中的酶为碱性磷酸酶 (ALP)。

当酶为碱性磷酸酶时，所对应的化学发光底物为3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲 氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐(AMPPD)。

作为优选，抗白细胞介素-6单克隆抗体A识别抗原的表位与抗白细胞介 素-6单克隆抗体B识别抗原的表位不同。

本发明还提供了一种非诊断目的检测白细胞介素-6的方法，其特征在于， 使用本发明提供的试剂盒进行操作，包括如下步骤：

取生物素化抗体、酶标记抗体与待测样本发生特异性结合反应，获得第 一反应物；

取亲和素偶联的超顺磁微粒与第一反应物发生特异性结合反应，获得第 二反应物；

取化学发光底物与第二反应物发生酶促反应，测定发光信号，获得白细 胞介素-6的浓度值。

该试剂盒的检测原理为：当样本中含有抗原“白细胞介素-6”时，生物 素化抗体、抗原与酶标记抗体在37℃中进行反应，形成生物素化抗体-抗原- 酶标记抗体免疫复合物；然后再加入亲和素偶联的超顺磁微粒，37℃中反应， 形成磁微粒-生物素化抗体-抗原-酶标记抗体免疫复合物；经过洗涤除去未参 与反应的物质，加入酶对应的化学发光底物，免疫复合物上的酶作用于发光 底物，在信号试剂作用下发光，由特定仪器检测发光信号。

作为优选，特异性结合反应具体为在37℃的条件下反应5～15min。

在本发明提供的一些实施例中，生物素化抗体、酶标记抗体与待测样本 发生的特异性结合反应具体为在37℃的条件下反应10min。

在本发明提供的一些实施例中，亲和素偶联的超顺磁微粒与第一反应物 发生的特异性结合反应具体为在37℃的条件下反应5min。

作为优选，酶促反应具体为在37℃的条件下反应5～10min。

本发明提供了一种检测白细胞介素-6的试剂盒以及非诊断目的检测白细 胞介素-6的方法。该试剂盒包括生物素化抗体、酶标记抗体、化学发光底物 和亲和素偶联的超顺磁微粒；生物素化抗体为生物素N羟基丁二酰亚胺酯与 抗白细胞介素-6单克隆抗体A偶联的产物；酶标记抗体为酶与抗白细胞介素 -6单克隆抗体B偶联的产物。通过对本发明提供的试剂盒进行方法学评价， 显示该试剂盒的回收率在97.9～102.6％之间，批内变异系数在3.46～4.97％ 之间，批间变异系数在5.47～7.92％之间，分析灵敏度为0.5pg/mL，与市售 的罗氏IL-6化学发光试剂具有较强的相关性。而市售的IL-6ELISA检测试 剂盒的分析灵敏度为5pg/mL，检测范围为5～800pg/mL；该试剂盒是基于抗 原和抗体的特异性免疫反应进行检测的，因此具有很好的特异性。由此可见， 本发明提供的试剂盒具有检测灵敏度高、特异性好的优点。

附图说明

图1示实施例8中的标准曲线；

图2示实施例11中的相关性分析图。

具体实施方式

本发明公开了一种检测白细胞介素-6的试剂盒以及非诊断目的检测白细 胞介素-6的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实 现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显 而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳 实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对 本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技 术。

本发明提供的检测白细胞介素-6的试剂盒以及非诊断目的检测白细胞介 素-6的方法中所用材料或试剂均可由市场购得。其中，抗IL-6单克隆抗体A 和抗IL-6单克隆抗体B均购自Thermo Fisher，抗IL-6单克隆抗体A识别白 细胞介素-6的表位与抗IL-6单克隆抗体B识别白细胞介素-6的表位不同； 鲁米诺化学发光底物液购自Thermo Fisher；重组人IL-6蛋白(标准品)购自 Thermo Scientific；正常人血清购自Hytest公司。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1亲和素偶联的超顺磁微粒的制备

取表面活性基团为羧基基团的超顺磁微粒(直径为500nm～5μm)10mg， 置于磁分离器上2min，弃去上清液；加入0.05mol/mL PBS缓冲液4mL，吹 打均匀，置于磁分离器上分离2min，弃去上清液，重复洗涤2次。清洗完毕 后，加入50mg/mL EDC溶液(pH7.0)1200μL活化超顺磁微粒，吹打均匀 后，置于振荡器上，反应1h，获得活化后的超顺磁性微粒。然后加入亲和素 为链霉亲和素(SA)蛋白进行偶联，具体操作为：SA用10mmol PBS缓冲 液溶解，向活化后的超顺磁性微粒中加入5mg/mL SA溶液1500μL，置于振 荡器上反应3～6h。偶联完成后，加入1％牛血清白蛋白(Bovine Serum  Albumin，缩略词为BSA)3mL封闭磁微粒表面的剩余的羧基集团，混匀后， 置于振荡器上反应30min；加入0.1mol/mL PBST缓冲液5mL，混合均匀， 置于磁分离器上分离，弃去上清液，重复洗涤3次；最后加入0.1mol/mL PBS 和0.5％BSA的保存液复溶，获得亲和素偶联的超顺磁微粒，亲和素偶联的 超顺磁微粒的浓度为0.5～2mg/mL，置于4℃备用。

实施例2亲和素偶联的超顺磁微粒的制备

取表面的活性基团为羧基基团的超顺磁微粒(直径为1～3μm)10mg， 置于磁分离器上2min，弃去上清液；加入0.05mol/mL PBS缓冲液4mL，吹 打均匀，置于磁分离器上分离2min，弃去上清液，重复洗涤2次。清洗完毕 后，加入50mg/mL EDC溶液(pH7.0)1200μL活化超顺磁微粒，吹打均匀 后，置于振荡器上，反应1h，获得活化后的超顺磁性微粒。然后加入亲和素 为链霉亲和素(SA)蛋白进行偶联，具体操作为：SA用10mmol PBS缓冲 液溶解，向活化后的超顺磁性微粒中加入5mg/mL SA溶液1500μL，置于振 荡器上反应3～6h。偶联完成后，加入1％牛血清白蛋白(Bovine Serum  Albumin，缩略词为BSA)3mL封闭磁微粒表面的剩余的羧基集团，混匀后， 置于振荡器上反应30min；加入0.1mol/mL PBST缓冲液5mL，混合均匀， 置于磁分离器上分离，弃去上清液，重复洗涤3次；最后加入0.1mol/mL PBS 和0.5％BSA的保存液复溶，获得亲和素偶联的超顺磁微粒，亲和素偶联的 超顺磁微粒的浓度为0.5～2mg/mL，置于4℃备用。

实施例3生物素化抗体的制备

取生物素、N-羟基丁二酰亚胺和二环己基碳二亚胺各1mmol，一并加入 二甲基甲酰胺溶液6mL中，室温(18～25℃)搅拌18h，过滤，滤液减压抽 干，干燥物反复用乙醚洗涤后复溶于异丙醇，再用真空抽干法使浓缩成原量 一半体积，置于低温冰箱中结晶，滤纸过滤，收集结晶物，用乙醚洗后即得 到生物素N羟基丁二酰亚胺酯(BNHS)。

用0.1mol/L NaHCO₃溶液将抗IL-6单克隆抗体A(来源Thermo Fisher) 稀释成2mg/mL的抗体溶液，每毫升抗体溶液中加入二甲基甲酰胺溶解的 BNHS(20mg/mL)20μL，混匀，于室温(22℃)反应1h，在4℃环境中置 于0.1mM PBS缓冲液中透析24h，透析完成后收集的反应物即为生物素化抗 体。

实施例4酶标记抗体的制备

采用改进的过碘酸钠氧化法制备得到辣根过氧化物酶标记抗体：取辣根 过氧化物酶(HRP)20mg溶于蒸馏水1.5mL中，加入60mmol/L NaIO₄0.4mL， 放置4℃，混合均匀，氧化60min，然后加入0.16mol/L乙二醇0.4mL，再置 4℃终止30min；加入抗IL-6单克隆抗体B(来源Thermo Fisher，其识别白 细胞介素-6的抗原表位与抗IL-6单克隆抗体A识别白细胞介素-6的抗原表 位不同)5mg，用0.05mol/L碳酸盐缓冲液透析，4℃过夜，加NaBH₄(5mg/mL) 0.6mL，置4℃终止2h，加入与上述混合溶液等容积的饱和硫酸铵，4℃沉淀 30min后用12000r/min离心15min。沉淀物用pH7.4、0.02mol/L PBS缓冲液 1mL溶解，用PBS缓冲液透析除铵，完成后-20℃保存，获得辣根过氧化物 酶标记抗体。

实施例5酶标记抗体的制备

采用戊二醛一步法制备得到碱性磷酸酶标记抗体：取抗IL-6单克隆抗体 1mL(2mg/mL)，加入碱性磷酸酶5mg溶解；装入透析袋，用pH为7.2、 0.01mol/L PBS在4℃下透析18h，换液3次。加入2.5％戊二醛20μL，室温 (20℃)放置2h。置于pH为7.2、0.01mol/L PBS中4℃透析过夜，换液3 次。移入pH为7.2、0.05mol/L Tris-HCl缓冲液中，4℃透析过夜，换液3次。 用含1％BSA和0.02％NaN₃的Tris-HCl缓冲液稀释至4mL，即为酶标记物原 液。加入1/3量纯甘油，小量(0.1mL)分装，获得碱性磷酸酶标记抗体，-20℃ 保存。

实施例6检测白细胞介素-6的试剂盒的制备

用50mM PBS、0.2％Casien(酪蛋白)、0.02％TW-20溶液将实施例1制 得的亲和素偶联的超顺磁微粒稀释至0.25mg/mL，获得亲和素偶联的超顺磁 微粒工作液。

用50mM PBS、1％BSA溶液将实施例3制得的生物素化抗体稀释至 2μg/mL，获得生物素化抗体工作液。

用50mM PBS、1％BSA、0.05％TW-20溶液将实施例4制得的辣根过氧 化物酶标记抗体稀释至0.5μg/mL，获得酶标记抗体工作液。

取鲁米诺化学发光底物液(来源Thermo Fisher)，包括发光液A和发光 液B)100μL，与上述制得的亲和素偶联的超顺磁微粒工作液50μL、生物素 化抗体工作液50μL、酶标记抗体工作液50μL组合，即得。

实施例7检测白细胞介素-6的试剂盒的制备

用50mM PBS、0.2％Casien(酪蛋白)、0.02％TW-20溶液将实施例2制 得的亲和素偶联的超顺磁微粒稀释至0.25mg/mL，获得亲和素偶联的超顺磁 微粒工作液。

用50mM PBS、1％BSA溶液将实施例3制得的生物素化抗体稀释至 2μg/mL，获得生物素化抗体工作液。

用50mM PBS、1％BSA、0.05％TW-20溶液将实施例5制得的碱性磷酸 酶标记抗体稀释至0.5μg/mL，获得酶标记抗体工作液。

取化学发光底物液【含3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基 -1,2-二氧环乙烷二钠盐(AMPPD)】100μL，与上述制得的亲和素偶联的超 顺磁微粒工作液50μL、生物素化抗体工作液50μL、酶标记抗体工作液50μL 组合，即得。

实施例8准确性评价

准确性测量是指用已知量白细胞介素-6(IL-6)标准品加入到正常人的 血清标本中，将测量浓度值与理论浓度值进行比较，计算IL-6的回收率。具 体实验方法如下：

采用重组人IL-6蛋白作为标准品(购自Thermo Scientific)，复溶后初始 浓度为1000pg/mL，用正常人血清(购自Hytest公司)稀释到800pg/mL(样 本1)、250pg/mL(样本2)、50pg/mL(样本3)(稀释后浓度作为理论值)。 用本发明实施例6提供的试剂盒进行检测。检测的具体操作为：将50μL待 测样本、50μL生物素抗体工作液、50μL酶工作液加入到反应孔中，37℃水 浴反应10分钟；然后加入50μL磁珠工作液，37℃水浴反应5分钟；磁性分 离，对反应形成的免疫复合物洗涤3次；然后加入化学发光底物100μL，37℃ 反应3分钟，用PMT光子计数器检测光电信号(RLU)值。将该值代入到 事先建立好的标准曲线中(如图1所示，y＝-0.0017x³+2.4498x²+897.09x+ 2900，R²＝1)，计算出待测样本中IL-6的浓度值。每个浓度重复测试3次， 取其平均值为测量浓度均值，按照如下公式进行计算：

回收率(％)＝测量浓度均值/理论浓度值×100％

准确性的评价标准为：回收率在85％～120％之间时，表示该试剂盒具有 较高的准确性。

检测结果如表1所示。

表1标准品回收率的测量结果

样本编号 IL-6理论浓度值(pg/mL) IL-6测量浓度值(pg/mL) 回收率(％) 1 800 783.5 97.9 2 250 248.6. 99.4 3 50 51.3 102.6

由表1的检测结果可知，本发明实施例6提供的试剂盒的回收率在 97.9％～102.6％之间，表明该试剂盒具有较高的准确性，符合试剂盒的规定。

取实施例7制得的试剂盒对标准品的回收率进行测量，结果与此相近， 表明实施例7提供的试剂盒同样具有较高的准确性。

实施例9精密性评价

选取3份不同浓度的临床标本(编号分别为1、2、3)，分别用本发明实 施例6提供的试剂盒重复测量20次。具体操作为：将50μL临床标本、50μL 生物素抗体工作液、50μL酶工作液加入到反应孔中，37℃水浴反应12分钟； 然后加入50μL磁珠工作液，37℃水浴反应8分钟；磁性分离，对反应形成 的免疫复合物洗涤3次；然后加入化学发光底物100μL，37℃反应4分钟， 用PMT光子计数器检测光电信号(RLU)值。将该值代入到事先建立好的 标准曲线中，计算出临床标本中IL-6的浓度值。根据20次的测量结果，计 算临床标本的平均值(Mean)和标准差(SD)，按如下公式计算变异系数(CV)。

变异系数(CV)＝平均值/标准差×100％

精密性的评价标准为：批内变异系数或批间变异系数CV<10％时，表示 该试剂盒的精密性好。

检测结果如表2所示。

表2临床标本变异系数的测量结果

由表2的检测结果可知，本发明实施例6提供的试剂盒的批内变异系数 在3.46～4.97％之间，批间变异系数在5.47～7.92％之间，表明该试剂盒具有 较高的精密性，符合试剂盒的规定。

取实施例7制得的试剂盒对临床标本的精密性进行测量，结果与此相近， 表明实施例7提供的试剂盒同样具有较高的精密性。

实施例10分析灵敏度评价

分析灵敏度是指在统计学意义上能与零剂量区别的量。具体操作为：将 50μL样本(零浓度样本或不含IL-6的稀释液)、50μL生物素抗体工作液、 50μL酶工作液加入到反应孔中，37℃水浴反应15分钟；然后加入50μL磁 珠工作液，37℃水浴反应10分钟；磁性分离，对反应形成的免疫复合物洗涤 3次；然后加入化学发光底物100μL，37℃反应5分钟，用PMT光子计数器 检测光电信号(RLU)值。将该值代入到事先建立好的标准曲线中，计算出 零值样本的浓度值。重复20次测量零剂量点，计算其平均值()和标准差 (SD)，以公式计算的浓度值即为该试剂盒的分析灵敏度。

检测数据见表3。

表3零剂量点检测结果

通过测量计算，结果显示本发明实施例6提供的试剂盒的分析灵敏度为 0.5pg/mL。

取实施例7制得的试剂盒进行分析灵敏度测量，结果与此相近，表明实 施例7提供的试剂盒同样具有较高的分析灵敏度。

实施例11相关性评价

取50份临床标本，分别用本发明实施例6提供的试剂盒与市售的罗氏 IL-6化学发光试剂进行检测。具体操作为：将50μL临床标本、50μL生物素 抗体工作液、50μL酶工作液加入到反应孔中，37℃水浴反应10分钟；然后 加入50μL磁珠工作液，37℃水浴反应5分钟；磁性分离，对反应形成的免 疫复合物洗涤3次；然后加入化学发光底物100μL，37℃反应3分钟，用PMT 光子计数器检测光电信号(RLU)值。将该值代入到事先建立好的标准曲线 中，计算出临床标本中IL-6的浓度值。比较两种试剂盒检测结果的相关性。 检测数据见表4。

表4相关性分析中测定的IL-6的浓度值(单位pg/mL)

将表4中本发明实施例6提供的试剂盒测定的IL-6的浓度值与罗氏IL-6 化学发光试剂盒测定的IL-6的浓度值做相关性分析，相关性分析结果如图2 所示，计算结果如下：

Y＝0.9787X-0.2177

R²＝0.9937

由此可见，本发明实施例6提供的试剂盒测定的IL-6的浓度值与罗氏 IL-6化学发光试剂盒测定的IL-6的浓度值具有很好的相关性。

取实施例7制得的试剂盒与市售的罗氏IL-6化学发光试剂进行相关性分 析，结果与此相近。

对比例1市售的IL-6ELISA检测试剂盒性能指标测定

使用前将市售的IL-6ELISA检测试剂盒中各组分平衡到室温。

洗涤液：如果洗涤液的浓缩液中形成了结晶，温热到室温，并轻轻混匀 使结晶完全溶解；用去离子水或蒸馏水将洗涤浓缩液稀释10倍后使用。

底物工作液：将底物工作液中的Glo Reagent A和Reagent B按照1：2 混合，使用前放置15min～4h(避光保存)，工作液每孔需要加入100μL。

标准品：用0.5mL去离子水或蒸馏水复溶标准品，复溶的母液浓度为 30000pg/mL。稀释前，先静止15min并轻轻震荡混匀。加入950μL RD6-10 稀释液到1500pg/mL的管子，剩下的管子加入800μL RD6-10。然后进行梯度 稀释，稀释浓度为800pg/mL、400pg/mL、100pg/mL、50pg/mL、15pg/mL、 7.5pg/mL。

测试程序：准备好所有的试剂，拿出需要量的板孔试剂。每孔加入100μL 测试稀释液RD1-83，RD1-83使用前要预先混合均匀。每孔加入100μL待测 标本。盖上密封条，室温反应2小时，以500转的速度维持震荡混匀。用洗 涤液洗涤4遍。加入200μL的IL-6结合物，覆盖密封膜。在震荡器上室温孵 育3小时。重复洗涤4遍。每孔加入100μL底物工作液。室温避光孵育5～ 20分钟。然后检测光电值(RLU)。将该值代入到事先建立好的标准曲线中， 计算出待测样本中IL-6的浓度值。

经过检测，结果显示该市售的IL-6ELISA检测试剂盒的分析灵敏度为 5pg/mL，检测范围为5～800pg/mL。而本发明提供的检测试剂盒的分析灵敏 度可达0.5pg/mL，大大提高了检测试剂盒的分析灵敏度。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润 饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。