用于预测ALI/ARDS及估量其预后的酶联免疫检测板及试剂盒

摘要

本发明提供了一种用于预测ALI/ARDS及估量其预后的酶联免疫检测板及试剂盒。所述的用于预测ALI/ARDS及估量其预后的酶联免疫检测板，包括固相载体，所述的固相载体上设有骨形成蛋白15的单克隆抗体、CXC趋化因子配体16的单克隆抗体、CXC趋化因子受体3的单克隆抗体、白介素-6的单克隆抗体、肾母细胞过度表达基因的单克隆抗体、胰岛素样生长因子结合蛋白4的单克隆抗体、白介素-5的单克隆抗体、白介素5受体的单克隆抗体、白介素22受体结合蛋白抗体的单克隆抗体、瘦素的单克隆抗体、巨噬细胞炎性蛋白-1D的单克隆抗体、欲激素B的单克隆抗体、CC类趋化因子受体2的单克隆抗体、转化生长因子-beta5的单克隆抗体和空白对照孔。本发明结果准确、操作简单。

说明书

技术领域

本发明涉及一种体外诊断的试剂盒，特别是涉及一种通过酶联免疫法检测血 液中细胞因子含量的联合变化，得以预测急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合症预后 的试剂盒。

背景技术

急性肺损伤(Acute Lung Injury，ALI)在1967年首次提出，是各种直接和 间接致伤因素导致的肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞损伤，造成弥漫性肺间质 及肺泡水肿，导致的急性低氧性呼吸功能不全。病理生理特征是肺容积减少、肺 顺应性降低、通气/血流比例失调，临床表现为突发的进行性低氧血症和呼吸窘 迫，肺部影像学表现为非均一性的渗出性病变。ALI发展至严重阶段(氧合指数 ＜200)称为急性呼吸窘迫综合征(Acute Respiratory Distress Syndrome，ARDS)。

根据2000年中华医学会颁布的ALI/ARDS诊断标准，该疾病的诊断、预防 和治疗措施遭遇到一定程度上的瓶颈。第一，实验室检查方面，并没有明确地量 化肺泡毛细血管膜通透性改变程度及肺组织损伤程度的检验指标；第二，影像学 方面，单凭其改变难以辨别肺水肿性质；第三，临床方面，PaO₂/FiO₂并不是总 与ALI/ARDS患者的病死率和肺外器官衰竭相关，证明其不能完全正确反映 ALI/ARDS的严重程度及预后。因此，进一步探索ALI/ARDS的临床诊断及监 测指标，尽早采取干预措施，阻止失控性全身炎症反应的发展，成为该领域研究 的热点。

生物标志物作为疾病早期的预测与诊断因子，已开始应用于冠心病、糖尿病、 高血压等慢性疾病。随着医疗从传统的被动治疗逐步向主动预防和诊治的医学观 念质变，尤其是个体化医学的出现和渐入主流，生物标志物的研究开发也成为近 年来临床和制药领域炙手可热的课题。寻找生物标志物，主要通过高通量的组学 研究。迄今已发现多种基因表达可作为急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合症的效应 或靶点基因。然而，目前临床上尚没有预测ALI/ARDS及估量其预后的试剂盒来 预测该病的进展及评估生存情况。

近年来大量研究表明系统性炎症和细胞凋亡改变在ALI/ARDS发生及进展 中发挥着重要作用。对于类似ALI/ARDS这样具有复杂炎症背景的疾病而言，单 个基因或蛋白已难以反映疾病的整体变化。既往研究发现，多个血清蛋白构成的 生物标志物组群与ALI/ARDS的临床预后密切相关，这提示同步联合测定多个因 子有助于更全面的了解该疾病的发展。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于预测ALI/ARDS及估量其预后的酶联免疫检 测板及试剂盒。

为了达到上述目的，本发明提供了一种用于预测ALI/ARDS及估量其预后的 酶联免疫检测板，其特征在于，包括固相载体，所述的固相载体上设有骨形成蛋 白15(BMP-15)的单克隆抗体、CXC趋化因子配体16(CXCL16)的单克隆抗体、 CXC趋化因子受体3(CXCR3)的单克隆抗体、白介素-6(IL-6)的单克隆抗体、 肾母细胞过度表达基因(CCN3/NOV)的单克隆抗体、胰岛素样生长因子结合蛋白 4(IGFBP-4)的单克隆抗体、白介素-5(IL-5)的单克隆抗体、白介素5受体(IL-5R alpha)的单克隆抗体、白介素22受体结合蛋白抗体(IL-22BP)的单克隆抗体、 瘦素(Leptin/OB)的单克隆抗体、巨噬细胞炎性蛋白-1D(MIP-1d)的单克隆抗 体、欲激素B(Orexin B)的单克隆抗体、CC类趋化因子受体2(CCR2)的单克 隆抗体、转化生长因子-beta5(TGF-beta5)的单克隆抗体和空白对照孔。

优选地，所述的固相载体为聚苯乙烯酶标板。

本发明还提供了一种用于预测ALI/ARDS及估量其预后的酶联免疫试剂盒， 其特征在于，包括上述的用于预测ALI/ARDS及估量其预后的酶联免疫检测板， 还包括生物素标记的骨形成蛋白15(BMP-15)的多克隆抗体、生物素标记的CXC 趋化因子配体16(CXCL16)的多克隆抗体、生物素标记的CXC趋化因子受体3 (CXCR3)的多克隆抗体、生物素标记的白介素-6(IL-6)的多克隆抗体、生物 素标记的肾母细胞过度表达基因(CCN3/NOV)的多克隆抗体、生物素标记的胰岛 素样生长因子结合蛋白4(IGFBP-4)的多克隆抗体、生物素标记的白介素-5(IL-5) 的多克隆抗体、生物素标记的白介素5受体(IL-5R alpha)的多克隆抗体、生 物素标记的白介素22受体结合蛋白抗体(IL-22BP)的多克隆抗体、生物素标 记的瘦素(Leptin/OB)的多克隆抗体、生物素标记的巨噬细胞炎性蛋白-1D (MIP-1d)的多克隆抗体、生物素标记的欲激素B(Orexin B)的多克隆抗体、 生物素标记的CC类趋化因子受体2(CCR2)的多克隆抗体、生物素标记的转化 生长因子-beta5(TGF-beta5)的多克隆抗体、HRP标记的链霉素亲和素、阳性 血清、显色剂、终止液、浓缩洗涤液和样品稀释液。

为了改变缺少明确量化肺损伤程度的检查指标和影像学不能全面反映 ALI/ARDS的状态和病程的状况，研制一种用于预测ALI/ARDS及预后的试剂盒， 本发明收集温州医科大学附属第一医院呼吸内科2012年期间住院病人正常组(5 例)、肺炎组(5例)、ARDS组(6例)共70个血标本，通过蛋白芯片检测ALI/ARDS 血清蛋白的表达，并以正常人血清中蛋白因子的水平作为衡量标准，发现骨形成 蛋白15(BMP-15)，CXC趋化因子配体16(CXCL16)，CXC趋化因子受体3(CXCR3)， 白介素-6(IL-6)，肾母细胞过度表达基因(CCN3/NOV)，胰岛素样生长因子结合 蛋白4(IGFBP-4)，白介素-5(IL-5)，白介素5受体(IL-5R alpha)，白介素 22受体结合蛋白抗体(IL-22BP)，瘦素(Leptin/OB)，巨噬细胞炎性蛋白-1D (MIP-1d)，欲激素B(Orexin B)，CC类趋化因子受体2(CCR2)，转化生长因 子-beta5(TGF-beta5)在ARDS组内含量会急剧升高，与重症肺炎组和正常 组相比存在统计学差异(p＜0.05)。因此，选用这14种细胞因子的联合可作为一 种可预测ALI/ARDS评估病人预后的生物标记物，可以成为早期发现ALI/ARDS 的筛查试剂，用于发展成包含该细胞因子联合的诊断试剂盒，将为医护人员和病 人带来极大便利，也将拥有更为广阔的应用市场。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明将14种抗体整合到一个酶联免疫检测板上，放置在一个试剂盒内， 利用酶联免疫反应对该14种ALI/ARDS相关的生物标志物进行检测，利用其联 合变化对ALI/ARDS预后进行预测，结果准确、操作简单，节省人力和时间，提 高了工作效率；本发明既适用于酶联免疫吸附剂测定，也可改为蛋白质芯片技术。

附图说明

图1为用于预测ALI/ARDS及估量其预后的酶联免疫检测板的剖面示意图。

图2为用于预测ALI/ARDS及估量其预后的酶联免疫试剂盒的俯面示意图

具体实施方式

为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。

实施例1

一种用于预测ALI/ARDS及估量其预后的酶联免疫检测板，包括固相载体， 所述的固相载体上设有骨形成蛋白15(BMP-15)的单克隆抗体、CXC趋化因子配 体16(CXCL16)的单克隆抗体、CXC趋化因子受体3(CXCR3)的单克隆抗体、 白介素-6(IL-6)的单克隆抗体、肾母细胞过度表达基因(CCN3/NOV)的单克隆 抗体、胰岛素样生长因子结合蛋白4(IGFBP-4)的单克隆抗体、白介素-5(IL-5) 的单克隆抗体、白介素5受体(IL-5R alpha)的单克隆抗体、白介素22受体结 合蛋白抗体(IL-22BP)的单克隆抗体、瘦素(Leptin/OB)的单克隆抗体、巨 噬细胞炎性蛋白-1D(MIP-1d)的单克隆抗体、欲激素B(Orexin B)的单克隆 抗体、CC类趋化因子受体2(CCR2)的单克隆抗体、转化生长因子-beta5(TGF-beta 5)的单克隆抗体和空白对照孔。所述的固相载体为聚苯乙烯酶标板。

一种用于预测ALI/ARDS及估量其预后的酶联免疫试剂盒，包括上述的用于 预测ALI/ARDS及估量其预后的酶联免疫检测板，还包括生物素标记的骨形成蛋 白15(BMP-15)的多克隆抗体、生物素标记的CXC趋化因子配体16(CXCL16) 的多克隆抗体、生物素标记的CXC趋化因子受体3(CXCR3)的多克隆抗体、生 物素标记的白介素-6(IL-6)的多克隆抗体、生物素标记的肾母细胞过度表达基 因(CCN3/NOV)的多克隆抗体、生物素标记的胰岛素样生长因子结合蛋白4 (IGFBP-4)的多克隆抗体、生物素标记的白介素-5(IL-5)的多克隆抗体、生 物素标记的白介素5受体(IL-5R alpha)的多克隆抗体、生物素标记的白介素 22受体结合蛋白抗体(IL-22BP)的多克隆抗体、生物素标记的瘦素(Leptin/OB) 的多克隆抗体、生物素标记的巨噬细胞炎性蛋白-1D(MIP-1d)的多克隆抗体、 生物素标记的欲激素B(Orexin B)的多克隆抗体、生物素标记的CC类趋化因 子受体2(CCR2)的多克隆抗体、生物素标记的转化生长因子-beta5(TGF-beta 5)的多克隆抗体、HRP标记的链霉素亲和素、阳性血清、显色剂、终止液、浓 缩洗涤液和样品稀释液。

如图1所示，所述的用于预测ALI/ARDS及估量其预后的酶联免疫检测板包 括固相载体1，所述的固相载体1上设有空白对照孔40及骨形成蛋白15(BMP-15) 的单克隆抗体孔2、CXC趋化因子配体16(CXCL16)的单克隆抗体孔3、CXC趋 化因子受体3(CXCR3)的单克隆抗体孔4、白介素-6(IL-6)的单克隆抗体孔5、 肾母细胞过度表达基因(CCN3/NOV)的单克隆抗体孔6、胰岛素样生长因子结合 蛋白4(IGFBP-4)的单克隆抗体孔7、白介素-5(IL-5)的单克隆抗体孔8、白 介素5受体(IL-5R alpha)的单克隆抗体孔9、白介素22受体结合蛋白抗体(IL-22 BP)的单克隆抗体孔10、瘦素(Leptin/OB)的单克隆抗体孔11、巨噬细胞炎性 蛋白-1D(MIP-1d)的单克隆抗体孔12、欲激素B(Orexin B)的单克隆抗体孔 13、CC类趋化因子受体2(CCR2)的单克隆抗体孔14、转化生长因子-beta5 (TGF-beta5)的单克隆抗体孔15。因单克隆抗体种类为14种，本发明将其分 列成上下两行，分别有空白孔40作为对照。所述的固相载体1为96孔聚苯乙烯 酶标板。

如图2所示，为用于预测ALI/ARDS及估量其预后的酶联免疫试剂盒的俯面 示意图。所述用于预测ALI/ARDS预后的试剂盒，包括外盒16，外盒内设有盒 内支架17，盒内支架17上具有主凹槽18，主凹槽18内设有上述的用于预测 ALI/ARDS预后的酶联免疫检测板。所述的盒内支架17上位于主凹槽18周围的 位置处还设有副凹槽19，所述副凹槽19内设有20个固定孔，20生物素标记的 骨形成蛋白15(BMP-15)的多克隆抗体管、生物素标记的CXC趋化因子配体16 (CXCL16)的多克隆抗体管21、生物素标记的CXC趋化因子受体3(CXCR3)的 多克隆抗体管22、生物素标记的白介素-6(IL-6)的多克隆抗体管23、生物素 标记的肾母细胞过度表达基因(CCN3/NOV)的多克隆抗体管24、生物素标记的 胰岛素样生长因子结合蛋白4(IGFBP-4)的多克隆抗体管25、生物素标记的白 介素-5(IL-5)的多克隆抗体管26、生物素标记的白介素5受体(IL-5R alpha) 的多克隆抗体管27、生物素标记的白介素22受体结合蛋白抗体(IL-22BP)的 多克隆抗体管28、生物素标记的瘦素(Leptin/OB)的多克隆抗体管29、生物素 标记的巨噬细胞炎性蛋白-1D(MIP-1d)的多克隆抗体管30、生物素标记的欲激 素B(Orexin B)的多克隆抗体管31、生物素标记的CC类趋化因子受体2(CCR2) 的多克隆抗体管32和生物素标记的转化生长因子-beta5(TGF-beta5)的多克 隆抗体管33、HRP标记的链霉素亲和素管34、阳性血清管35、显色剂管36、终 止液管37、浓缩洗涤液管38和样品稀释液管39各设于一个固定孔中。所述的 生物素标记的骨形成蛋白15(BMP-15)的多克隆抗体管20、生物素标记的CXC 趋化因子配体16(CXCL16)的多克隆抗体管21、生物素标记的CXC趋化因子受 体3(CXCR3)的多克隆抗体管22、生物素标记的白介素-6(IL-6)的多克隆抗 体管23、生物素标记的肾母细胞过度表达基因(CCN3/NOV)的多克隆抗体管24、 生物素标记的胰岛素样生长因子结合蛋白4(IGFBP-4)的多克隆抗体管25、生 物素标记的白介素-5(IL-5)的多克隆抗体管26、生物素标记的白介素5受体 (IL-5R alpha)的多克隆抗体管27、生物素标记的白介素22受体结合蛋白抗 体(IL-22BP)的多克隆抗体管28、生物素标记的瘦素(Leptin/OB)的多克隆 抗体管29、生物素标记的巨噬细胞炎性蛋白-1D(MIP-1d)的多克隆抗体管30、 生物素标记的欲激素B(Orexin B)的多克隆抗体管31、生物素标记的CC类趋 化因子受体2(CCR2)的多克隆抗体管32和生物素标记的转化生长因子-beta5 (TGF-beta5)的多克隆抗体管33位于用于预测ALI/ARDS及估量其预后的酶 联免疫检测板的后侧，终止液管37、浓缩洗涤液管38和样品稀释液管39位于 检测板的左侧，HRP标记的链霉素亲和素管34、阳性血清管35、显色剂管36 位于检测板的右侧。

本发明试剂盒所用的酶联免疫检测板以及14种细胞因子的多克隆抗体可采 用常规方法制备，具体如下：

(1)制备抗原：分别将克隆的骨形成蛋白15(BMP-15)的基因、克隆的CXC 趋化因子配体16(CXCL16)的基因、克隆的CXC趋化因子受体3(CXCR3)的基 因、克隆的白介素-6(IL-6)的基因、克隆的肾母细胞过度表达基因(CCN3/NOV) 的基因、克隆的胰岛素样生长因子结合蛋白4(IGFBP-4)的基因、克隆的白介 素-5(IL-5)的基因、克隆的白介素5受体(IL-5R alpha)的基因、克隆的白 介素22受体结合蛋白抗体(IL-22BP)的基因、克隆的瘦素(Leptin/OB)的基 因、克隆的巨噬细胞炎性蛋白-1D(MIP-1d)的基因、克隆的欲激素B(Orexin B) 的基因、克隆的CC类趋化因子受体2(CCR2)的基因、克隆的转化生长因子-beta5 (TGF-beta5)的基因在大肠杆菌中表达，得到蛋白后经纯化作为抗原；

(2)制备抗体：分别将步骤(1)中所得的14种抗原免疫兔，即抗原于家兔 皮下多点注射，3周后，再次进行多点皮下注射，以后间隔7天用抗原加强一次， 2次后采取颈动脉放血收集家兔血液，离心分离得到血清，即得到14种特异性 的多克隆抗体；复苏分泌上述14种细胞因子单克隆抗体的杂交瘤并注入小鼠腹 腔，收集腹水，离心，留取上清液，即得到14种细胞因子的单克隆抗体；

(3)纯化抗体：步骤(2)中所得的14种细胞因子的单克隆抗体和多克隆抗 体分别经过离心、沉淀、亲和层析，得到纯化抗体；

(4)标记抗体：用生物素分别标记步骤(3)中所得到的的纯化多克隆抗体；

(5)试剂盒制备：用步骤(3)所得的纯化单克隆抗体包被固相载体，得到 用于预测ALI/ARDS及估量其预后的酶联免疫检测板。

检测时，按照常规的酶联免疫检测方法进行检测，将待检测血清样品、正 常对照品(正常人血清)，阳性血清(ALI/ARDS患者血清)用样品稀释液稀释 后，分别于固定在固相载体1的骨形成蛋白15(BMP-15)的单克隆抗体孔2、CXC 趋化因子配体16(CXCL16)的单克隆抗体孔3、CXC趋化因子受体3(CXCR3)的 单克隆抗体孔4、白介素-6(IL-6)的单克隆抗体孔5、肾母细胞过度表达基因 (CCN3/NOV)的单克隆抗体孔6、胰岛素样生长因子结合蛋白4(IGFBP-4)的单 克隆抗体孔7、白介素-5(IL-5)的单克隆抗体孔8、白介素5受体(IL-5R alpha) 的单克隆抗体孔9、白介素22受体结合蛋白抗体(IL-22BP)的单克隆抗体孔 10、瘦素(Leptin/OB)的单克隆抗体孔11、巨噬细胞炎性蛋白-1D(MIP-1d) 的单克隆抗体孔12、欲激素B(Orexin B)的单克隆抗体孔13、CC类趋化因子 受体2(CCR2)的单克隆抗体孔14、转化生长因子-beta5(TGF-beta5)的单克 隆抗体孔15中的骨形成蛋白15(BMP-15)的单克隆抗体2、CXC趋化因子配体 16(CXCL16)的单克隆抗体3、CXC趋化因子受体3(CXCR3)的单克隆抗体4、 白介素-6(IL-6)的单克隆抗体5、肾母细胞过度表达基因(CCN3/NOV)的单克 隆抗体6、胰岛素样生长因子结合蛋白4(IGFBP-4)的单克隆抗体7、白介素-5 (IL-5)的单克隆抗体8、白介素5受体(IL-5R alpha)的单克隆抗体9、白介 素22受体结合蛋白抗体(IL-22BP)的单克隆抗体10、瘦素(Leptin/OB)的 单克隆抗体11、巨噬细胞炎性蛋白-1D(MIP-1d)的单克隆抗体12、欲激素B (Orexin B)的单克隆抗体13、CC类趋化因子受体2(CCR2)的单克隆抗体14、 转化生长因子-beta5(TGF-beta5)的单克隆抗体15接触和保温。将生物素标 记的多克隆抗体与结合于单克隆抗体的检测样本接触和保温。最后用HRP标记的 链霉素亲和素特异性的捕捉结合于检测抗体上的生物素，并用显色剂显色，用终 止液终止反应，在EILSA检测仪上，测定各孔的OD值，从而检测结合于捕捉抗 体上的细胞因子水平。

具体的检测步骤如下：

1.加样：将待检测血清样品、正常对照品(正常人血清)，阳性血清 (ALI/ARDS患者血清)用样品稀释液稀释3倍后，分别加入酶联免疫检测板的 各反应孔中，每个反应孔加样0.1ml，每个样品做3个平行试验，置37℃孵育1 小时，弃去孔内溶液。蒸馏水稀释浓缩洗涤液10倍后，每孔加入0.4ml，洗涤3 次，每次1分钟(简称洗涤，下同)。样品稀释液为0.1克牛血清白蛋白加到100ml pH7.4磷酸盐缓冲液中得到，其中所述的pH7.4磷酸盐缓冲液为将0.2克磷酸二 氢钾、2.9克十二水合磷酸氢二钠、8.0克氯化钠、0.2克氯化钾和0.5ml吐温 -20加到1000ml蒸馏水中得到。浓缩洗涤液为将0.2克磷酸二氢钾、2.9克十二 水合磷酸氢二钠、8.0克氯化钠、0.2克氯化钾和0.5ml吐温-20加到1000ml蒸 馏水中得到。

2.加生物素标记的多克隆抗体：于各反应孔中，相应加入用样品稀释液新鲜 稀释的10μg/ml浓度的各生物素标记的多克隆抗体0.1ml，置37℃孵育1小时， 洗涤。

3.加HRP标记的链霉素亲和素：于各反应孔中加入HRP标记的链霉素亲和素 0.1ml，室温保持20分钟。

4.加显色液：于各反应孔中加入显色液0.1ml，室温保持20分钟。所述显 色液为将0.5ml10mg/5ml的四甲基联苯胺的无水乙醇溶液、10ml pH5.0底物 缓冲液与32μl0.75vol％过氧化氢水溶液，混合得到。其中，所述的PH5.0底 物缓冲液为含有0.2M磷酸氢二钠和0.1M柠檬酸的蒸馏水溶液。

5.终止反应：于各反应孔中加入终止液0.05ml，在EILSA检测仪上，于450nm 处，以空白对照孔调零后侧各孔OD值。所述终止液为将56ml纯硫酸缓慢加到 1000ml蒸馏水中得到。以正常对照品的蛋白表达水平作为衡量标准，阳性血清 的蛋白表达量除以此标准，从而确定ALI/ARDS病人细胞因子相对于正常人的表 达比例。将待检测血清样品的蛋白表达量(OD值)除以正常对照品的蛋白表达 量(OD值)，其中大于或等于3为增高，小于-3为降低。当14种细胞因子均增 高明显时，提示ALI/ARDS预后不良。

实施例2

收集10例正常人血清和10例ALI/ARDS患者血清作为正常组和ALI/ARDS组， 采用实施例1中的试剂盒，按照实施例1中的检测步骤进行检测，14种因子的 联合表达改变如表1所示：

表1：14种细胞因子在ALI/ARDS患者和正常人血清中的表达变化表

如表1所示，上述14种细胞因子在两组间的OD比值均高于3，且其OD值 在ALI/ARDS组与正常组之间均存在统计学差异。上述结果表明，14种细胞因子 在ALI/ARDS患者血清中显著增高，故同时检测上述14种细胞因子可以作为 ALI/ARDS诊断和预后不良的临床辅助手段。