麦角甾醇过氧化物与紫杉醇在杀伤Hela癌细胞方面的协同作用及其应用

摘要

本发明涉及一种杀伤Hela癌细胞的组合物。该组合物由麦角甾醇过氧化物与紫杉醇组成,具有协同抑制Hela癌细胞增殖作用,特别是在6.25-12.5μg/ml麦角甾醇过氧化物:0.025-0.1μg/ml紫杉醇的浓度范围内协同作用显著。该组合物可大幅降低紫杉醇用量，降低费用和毒副作用并可能对紫杉醇有抗药性的癌细胞株有效。

说明书

技术领域

本发明属于天然药物化学及食品化学技术领域，涉及2种天然产物：麦角甾醇过氧化物与紫杉醇。麦角甾醇过氧化物可增强紫杉醇对癌细胞增殖的抑制作用。 

背景技术

麦角甾醇过氧化物(EP)(图1)是药用真菌及食用蘑菇中广泛存在的天然成分(Chen Y. K., Kuo Y. H., Chiang B. H., Lo J. M., Sheen L. Y. (2009). Cytotoxic activities of 9, 11-dehydroergosterol peroxide and ergosterol peroxide from the fermentation mycelia of ganoderma lucidum cultivated in the medium containing leguminous plants on Hep 3B cells. Journal of agricultural & food chemistry, 57(13), 5713-5719.; Kobori M., Yoshida M., Kameyama, M. O., Shinmoto. H. (2007). Ergosterol peroxide from an edible mushroom suppresses inflammatory responses in RAW264.7 macrophages and growth of HT29 colon adenocarcinoma cells. British Journal of Pharmacology, 150(2), 209-219)。灵芝等药用真菌已用作癌症患者的食品补充剂(Sliva D. (2003). Ganoderma lucidum (Reishi) in cancer treatment. Integrative Cancer Therapies, 2(4), 358-364.). 通常认为多糖和三萜成分为灵芝的抗癌活性成分, 关于灵芝中麦角甾醇过氧化物的活性贡献尚没有报道。其他生物来源的EP曾报道有诱导癌细胞凋亡的活性 (Takei T., Yoshida M., Kameyama M. O., Kobori M. (2005). Ergosterol peroxide, an apoptosis–inducing component isolated from Sarcodon aspratus (Berk.) S. Ito. Bioscience, Biotechnology & Biochemistry, 69(1), 212-215.)，但没有关于麦角甾醇过氧化物与临床抗癌药物联合作用的报道. 

紫杉醇（图1）是临床常用的广谱抗癌药物，尤其对乳腺癌和子宫癌效果好 (Wang T. H., Wang H. S., Soong Y. K. (2000). Paclitaxel-induced cell death, where the cell cycle and apoptosis come together. Cancer, 88(11), 2619-2628.)。紫杉醇结合到微管抑制细胞的G2/M期, 从而诱导细胞凋亡。临床使用紫杉醇的最大问题是其毒副作用和耐药性，另外，昂贵的价格也对患者造成负担。近些年，药物联合使用成为治疗癌症的新策略。联合使用作用于不同靶点的药物常会产生协同作用使药物在较低剂量即可发挥药效，从而减少药物的毒副作用；联合用药也可对一些耐药癌株有效。临床上已见紫杉醇与其他药物联合使用的例子，如，文献报道紫杉醇-环磷酰胺联用比环磷酰胺-顺铂联用对子宫癌的效果更好(Mcguire W. P., Hoskins W. J., Brady M. F., Paul B. S., Kucera R., Partridge E. E., Look K. Y., Pearson D. C., Davidson M. (1996). Cyclophosphamide and cisplatin compared with paclitaxel and cisplatin in patients with stage III and stage IV ovarian cancer. The New England Journal of Medicine, 334(1), 1-6.)。紫杉醇-贝伐单抗联用与单用紫杉醇相比可显著延长转移性乳腺癌的无进展生存期, 但是，这些联合抗癌方案也常常产生一些副作用，如：引起神经病变、感染和疲劳(Miller K., Wang M. M., Gralow J., Dickler M., Cobleigh M., Perez E. A., Shenkier T., Cella D., Davidson N. E. (2007). Paclitaxel plus bevacizumab versus paclitaxel alone for metastatic breast cancer. The New England Journal of Medicine, 357(26), 2666-2676.)。将毒性很低或无毒的天然产物与紫杉醇联用可能成为癌症治疗的新希望。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有协同作用，可降低紫杉醇用量从而降低其化疗副作用和费用的组合药物。 

本发明的组合药物由麦角甾醇过氧化物与紫杉醇组成，在麦角甾醇过氧化物-紫杉醇比例为6.25-12.5 μg/ml：0.025-0.1 μg/ml的浓度内协同作用显著。 

实验证明，麦角甾醇过氧化物可增加紫杉醇进入癌细胞浓度，增加对癌细胞的选择性抑制作用，降低对正常细胞的毒性。本发明的组合药物协同抑制Hela细胞生长增殖，显同样活性时所需紫杉醇的用量大幅降低（可达紫杉醇单独使用量的1/10），从而大幅降低费用和紫杉醇的毒副作用。 

附图说明：图1 麦角甾醇过氧化物与紫杉醇的化学结构式； 

图2 紫杉醇、麦角甾醇过氧化物及紫杉醇+麦角甾醇过氧化物对Hela细胞的增殖抑制率(72小时; 浓度μg/ml)； 

图3.A: 用紫杉醇(10 μg/ml)或紫杉醇(10 μg/ml)+麦角甾醇过氧化物(10 μg/ml)处理Hela细胞2.5小时后，用UHPLC-MS检测到的紫杉醇峰；B. 用紫杉醇(10 μg/ml)或紫杉醇(10 μg/ml)+麦角甾醇过氧化物(10 μg/ml)处理Hela或GES-1细胞2.5小时后检测到的细胞内紫杉醇含量； 

图4. 麦角甾醇过氧化物处理72小时后对不同癌细胞及正常细胞的细胞毒作用，X轴为麦角甾醇过氧化物的浓度（μg/ml）； 

图5.  Hela癌细胞与GES-1正常细胞中的总SOD活性；(+): 用20 μg/ml麦角甾醇过氧化物处理18小时；

图6. A: 无细胞体系中麦角甾醇过氧化物与SOD反应后的相对浓度（麦角甾醇过氧化物在不含SOD的缓冲液中的浓度定义为 1）；B：用20 μg/ml麦角甾醇过氧化物处理细胞6小时后的麦角甾醇过氧化物相对含量（麦角甾醇过氧化物在GES-1正常细胞中的含量定义为1）。

表 1.麦角甾醇过氧化物在药用真菌与食用蘑菇中的含量 

^a 药用真菌; ^b食用蘑菇

*回归方程: Y=1.5468X+0.145; 相关系数 (R²) =0.99; 线性范围: 8.33- 0.31 μg/ml; 内标化合物氢化可的松的浓度为2.5 μg/ml.

 

具体实施方式

细胞培养

Hela (人宫颈癌细胞), A431 (人皮肤癌细胞), GES-1 (人MG53胃粘膜上皮细胞), HBE (人支气管上皮细胞) 在DMEM培养基中培养; MGC-803 (人胃癌细胞), HUEVC (人脐MG53静脉上皮细胞)在PRMI 1640培养基中培养。所有培养基均含10%的小牛血清、100 U/ml青链霉素。细胞在37 ℃ 5% CO₂培养箱中培养。

细胞毒活性

细胞接种于96孔板上，每孔5000个细胞, 细胞贴壁后加入化合物继续培养72小时, 每孔加入20 μl MTT (5 mg/ml)培养4小时, 吸出培养液后加入150 μl DMSO并在570 nm测定吸光值；

图2显示了紫杉醇和麦角甾醇过氧化物分别单独使用时，及紫杉醇与麦角甾醇过氧化物联合使用时对Hela细胞增殖的抑制率。可以看到，紫杉醇浓度在0.025 和0.05 μg/ml以下时对Hela细胞的增殖抑制率分别为10%和38%；麦角甾醇过氧化物浓度在12.5 μg/ml以下时对Hela细胞的增殖抑制率是23%。然而，0.025 μg/ml的紫杉醇与12.5 μg/ml的麦角甾醇过氧化物联合使用时对Hela细胞的增殖抑制率为66%，为同浓度2物质单独使用时的抑制率之和（10%+23%=33%）的两倍，为同浓度紫杉醇单独使用时抑制率的6倍以上。当0.05 μg/ml紫杉醇与12.5 μg/ml麦角甾醇过氧化物合用时对Hela细胞的增殖抑制率达到80%，与单独使用0.5 μg/ml紫杉醇时对Hela细胞的增殖抑制率相当，即，对Hela细胞的增殖抑制率达到80%所需紫杉醇的量在联合麦角甾醇过氧化物时仅为单独使用紫杉醇时的紫杉醇用量的1/10。

细胞内紫杉醇含量 

将细胞接种于6孔板上，长至90％汇合后，用紫杉醇(10μg/ml)加麦角甾醇过氧化物(10μg/ml)或紫杉醇(10μg/ml)单独处理2.5小时.移去培养基，细胞用PBS清洗2次。用胰蛋白酶消化后将细胞收集到离心管中,离心弃去上清液。收集细胞再次悬浮于水中并离心弃去上清液。在每孔细胞中加入500μl甲醇后超声破碎细胞，混合物在12000g重力下离心20分钟，得到的上清液经过ODS小柱后用0.22μm滤膜过滤，滤液用UHPLC-MS分析。 

图3A显示了加药处理2.5小时后，用UHPLC-MS检测到的Hela细胞中紫杉醇的峰面积。可以看出，用紫杉醇(10μg/ml)+麦角甾醇过氧化物(10μg/ml)处理后，细胞内紫杉醇的含量明显高于用紫杉醇(10μg/ml)单独处理的细胞。从图3B可以看出用紫杉醇(10μg/ml)单独处理时，紫杉醇进入Hela癌细胞的量明显低 于进入正常细胞的量。紫杉醇(10μg/ml)与麦角甾醇过氧化物(10μg/ml)联合处理，可明显增加紫杉醇进入Hela癌细胞的量而对进入GES-1细胞的量影响不明显。总SOD活性 

Hela癌和GES-1正常细胞在6-cm培养皿中培养,每皿分为麦角甾醇过氧化物处理(20μg/ml)及未处理两部分。18小时后,将细胞消化至水中超声破碎,12000g重力下离心20min。上清液在450nm测定SOD活性。 

SOD抑制率(％)＝100×[(A_blank1-A_blank2)-(A_sample-A_blank3)]/(A_blank1-A_blank2) 

blank1:底物+黄嘌呤酶+水；blank2:底物+缓冲液+水；blank3:底物+缓冲液+样品；sample:底物+酶+样品 

SOD活性(U/mg蛋白质)＝[SOD inhibition/(1-SOD inhiition)]/M 

SOD inhibition：SOD抑制率；M:样品中总蛋白质量(mg)。 

无细胞体系中SOD存在下的麦角甾醇过氧化物含量

SOD溶于磷酸钾缓冲液中，调节pH至7.8。将含100 μg 麦角甾醇过氧化物和500 μl SOD的反应液在25 ℃反应30分钟。混合物冷冻干燥后重新溶于乙腈并于12000 g离心20分钟以沉淀除去无机盐。上清液过滤后用UHPLC-MS分析麦角甾醇过氧化物的含量. 

麦角甾醇过氧化物有细胞毒活性而麦角甾醇没有这方面的活性，甾体类化合物的细胞毒活性可能与过氧基团有关。另外，从图4可以看出，麦角甾醇过氧化物处理细胞72小时后，对癌细胞的增殖抑制作用明显大于对正常细胞的作用。这些现象是否是因为癌细胞的SOD活性比正常细胞低，不能像含有高水平的SOD的正常细胞那样有效地将麦角甾醇过氧化物还原成了没有细胞毒作用的物质？考察结果如图5所示， GES-1正常细胞的SOD水平明显高于Hela癌细胞的SOD水平。用20 μg/ml麦角甾醇过氧化物处理18小时对细胞内的SOD产生有一定激活作用，但与未处理细胞相比没有明显差异。SOD对麦角甾醇过氧化物的作用在无细胞体系也得到验证。如图6所示，恒量麦角甾醇过氧化物与不同浓度的SOD混合实验表明，随着SOD 的浓度增加麦角甾醇过氧化物的浓度在降低, 表明SOD可以将麦角甾醇过氧化物转变为其他物质。细胞内的测定结果验证了前面的猜想，即：麦角甾醇过氧化物在GES-1正常细胞内的量明显低于在Hela癌细胞中的量(p<0.01), 很可能是由于GES-1正常细胞的高水平SOD活性有效地代谢了麦角甾醇过氧化物。

麦角甾醇过氧化物的定量分析

UPLC-ESIMS（超高效液相-电喷雾质谱）在安捷伦Agilent 1290 infinity UPLC及 Agilent 6430 triple Quad MS (ESI离子源)系统上分析。层析柱为agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 (50 mm×2.1 mm; 1.8 μm), 柱温控制在30oC。氢化可的松作为内标。标准品 (EP) 溶于DMSO 中并用含内标的DMSO溶液稀释成系列浓度以便测定标准曲线。50 mg 样品提取物用2 ml含内标的甲醇溶液超声提取2次，每次10分钟, 然后离心。上清液通过ODS小柱后用0.22 μm滤膜过滤，滤液用 UHPLC-MS分析。UPLC-ESIMS分析流动相: A为含0.1%甲酸的纯净水, B为甲醇；流速为0.4 ml/min，注射量为2μl。洗脱程序：0 min时60 % B, 1.5 min时90 % B, 4-6 min 100% B。用正离子模式的MRM（质谱多反应监测）定量EP，母离子为429 [M+H]，因为没有足够强度的子离子碎片，子离子也设定为429。优化后的 fragmentor为 170 V，collision energy 为1 eV；用上述优化的麦角甾醇过氧化物UHPLC-MS定量方法测定结果表明，所检测的5种药用真菌和6种食用蘑菇均含有麦角甾醇过氧化物（表1）。这一结果从活性物质基础上支持食用蘑菇对癌症患者有益。

本发明首次公开了麦角甾醇过氧化物可通过增加紫杉醇进入细胞的量来增强对癌细胞增殖的抑制作用。与麦角甾醇过氧化物联用可显著减少紫杉醇的用量，从而减少紫杉醇的毒副作用和费用，并有可能对耐药癌细胞株有效。紫杉醇-麦角甾醇过氧化物联用可成为治疗癌症的新方案。食用蘑菇等真菌类有助于癌症患者的治疗。 

以上所述为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此。任何熟悉本领域的技术人员在本发明公开的内容上，通过简单变化或等效替换可显而易见得到的技术方案均落入本发明的保护范围内。