一种哺乳动物细胞转化的电化学检测方法

摘要

一种哺乳动物细胞转化的电化学检测方法，涉及一种细胞转化的检测方法。本发明是要解决传统细胞转化实验存在的检测准确性低，试验周期长，试验的模型细胞株种类受到限制的技术问题。本发明的方法为：一、将细胞分为三组，A组为空白组，记录正常细胞的电化学行为；B组以MNNG为启动剂，进行电化学检测；C组用DMSO代替MNNG做阴性对照，进行同步电化学检测；二、将步骤一中B组的细胞培养8天，然后将细胞分二组：第一组加入促进剂TPA；第二组仍为MNNG组；以步骤一中的C组DMSO组为第三组；对三组细胞进行同步电化学检测，当出现电化学信号TPA组>MNNG组>DMSO组时，即完成。本发明应用于细胞检测领域。

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞转化的检测方法。

背景技术

癌症是目前全世界共同面临的重大公共卫生问题，已成为严重威胁人类生命与健康的 疾病之一。国际癌症研究中心（IARC）指出，80-90%的人类肿瘤是由环境致癌物引起的， 其中化学致癌物是主要因素。目前，体外哺乳动物细胞转化试验是唯一成熟的能够评价物 质致癌活性的体外试验方法。此法已被国际癌症研究中心（IARC）、欧洲替代方法研究中 心（ECVAM）、全国危险化学品管理标准化技术委员会（SAC/TC）等众多机构评价为一种 有效的筛选致癌物的方法。

体外哺乳动物细胞转化试验是将细胞暴露于致癌物，高度模拟致癌物在体内致癌作用 的一种技术。转化过程可分为两阶段：首先在细胞指数生长期给予短暂的肿瘤启动剂处理； 然后在细胞融合后的生长静止期给以长时间促癌剂处理，以细胞发生恶性转化从而产生的 形态改变为试验终点，通过单盲法观察细胞转化灶，计算克隆数，确定致癌物毒性。目前 得到广泛认可和使用的细胞系为具有敏感接触抑制性的小鼠间充质干细胞（C3H10T1/2）、 小鼠胚胎成纤维细胞（Balb/3T3）和金黄地鼠胚胎细胞（SHE）等。

传统细胞转化实验以细胞形态学变化为观察终点，检测结果很大程度上受人为主观因 素影响，导致检测准确性低；而且试验周期长，至少需要4-5周。另外，受到敏感性、自 发转化率和稳定性等因素的影响，可用于试验的模型细胞株种类受到了极大的限制。

发明内容

本发明是要解决传统细胞转化实验存在的检测准确性低，试验周期长，试验的模型细 胞株种类受到限制的技术问题，从而提供了一种哺乳动物细胞转化的电化学检测方法。

本发明的一种哺乳动物细胞转化的电化学检测方法是按以下步骤进行的：

一、将细胞接种于60mm培养皿，培养24～48h后分为三组，A组为空白组，记录正 常细胞的电化学行为；B组以浓度为0.5～1.0mg/L的甲基硝基亚硝基胍（MNNG）为启 动剂，对细胞进行染毒，培养3～4h后除去MNNG，每40～48h进行一次电化学检测；C 组用浓度为3%～5%的二甲基亚砜（DMSO）代替MNNG做阴性对照，与染毒组进行同 步电化学检测；

二、将步骤一中B组以MNNG为启动剂的细胞培养8天，然后将细胞分两组：第一 组加入浓度为100～200μg/L的促进剂TPA；第二组仍为MNNG组；以步骤一中的C组DMSO 组为第三组；对三组细胞每40～48h进行一次电化学检测，当出现电化学信号TPA组>MNNG 组>DMSO组时，即完成哺乳动物细胞转化的电化学检测方法。

本发明包括以下有益效果：

1、本发明以电化学分析为手段，以嘌呤碱基为生物标志物，建立了简单、快速、灵敏、 低成本评价环境致癌物毒性的体外哺乳动物细胞转化电化学试验方法，实现分子水平的终 点检测，大幅度降低检测时间，消除检测的主观因素，提高检测准确性；

2、本发明通过数据处理，分析比较正常细胞和转化细胞电化学数据的差异，确定判断 细胞转化的电化学特征指标，建立体外哺乳动物细胞转化的电化学检测方法。

3、本发明采用电化学法检测细胞转化，加入启动剂MNNG后，加药组在第4天由于 细胞内DNA损伤，测得细胞电化学信号出现衰减，双电化学信号强度均比空白组和DMSO 阴性对照组弱；而在加入促进剂TPA后第八天，由于促进剂促进了细胞的增值，其电化学 信号激增，达到最大。说明细胞转化过程中嘌呤代谢发生显著改变，电化学信号与细胞转 化过程具有明显相关性。

附图说明

图1为试验一步骤一中三组细胞培养第4天的伏安图；其中，a为A组未加入启动剂 的细胞培养第4天的伏安图；b为C组以DMSO为阴性对照的细胞培养第4天的伏安图； c为B组以MNNG为启动剂的细胞培养第4天的伏安图；

图2为试验一步骤二中三组细胞培养第4天的伏安图；其中，a为第三组DMSO组的 细胞培养第4天的伏安图；b为第一组以TPA为促进剂的细胞培养第4天的伏安图；c为 第二组MNNG组的细胞培养第4天的伏安图；

图3为试验一步骤二中三组细胞培养第8天的伏安图；其中，a为第一组以TPA为促 进剂的细胞培养第8天的伏安图；b为第二组MNNG组的细胞培养第8天的伏安图；c为 第三组DMSO组的细胞培养第8天的伏安图。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式的一种哺乳动物细胞转化的电化学检测方法是按以下步 骤进行的：

一、将细胞接种于60mm培养皿，培养24～48h后分为三组，A组为空白组，记录正 常细胞的电化学行为；B组以浓度为0.5～1.0mg/L的甲基硝基亚硝基胍（MNNG）为启 动剂，对细胞进行染毒，培养3～4h后除去MNNG，每40～48h进行一次电化学检测；C 组用浓度为3%～5%的二甲基亚砜（DMSO）代替MNNG做阴性对照，与染毒组进行同 步电化学检测；

二、将步骤一中B组以MNNG为启动剂的细胞培养8天，然后将细胞分两组：第一 组加入浓度为100～200μg/L的促进剂TPA；第二组仍为MNNG组；以步骤一中的C组DMSO 组为第三组；对三组细胞每40～48h进行一次电化学检测，当出现电化学信号TPA组>MNNG 组>DMSO组时，即完成哺乳动物细胞转化的电化学检测方法。

本实施方式包括以下有益效果：

1、本实施方式以电化学分析为手段，以嘌呤碱基为生物标志物，建立了简单、快速、 灵敏、低成本评价环境致癌物毒性的体外哺乳动物细胞转化电化学试验方法，实现分子水 平的终点检测，大幅度降低检测时间，消除检测的主观因素，提高检测准确性；

2、本实施方式通过数据处理，分析比较正常细胞和转化细胞电化学数据的差异，确定 判断细胞转化的电化学特征指标，建立体外哺乳动物细胞转化的电化学检测方法。

3、本实施方式采用电化学法检测细胞转化，加入启动剂MNNG后，加药组在第4天 由于细胞内DNA损伤，测得细胞电化学信号出现衰减，双电化学信号强度均比空白组和 DMSO阴性对照组弱；而在加入促进剂TPA后第八天，由于促进剂促进了细胞的增值，其 电化学信号激增，达到最大。说明细胞转化过程中嘌呤代谢发生显著改变，电化学信号与 细胞转化过程具有明显相关性。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述细胞为C3H10T1/2、 Balb/3T3或SHE细胞。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：所述电化学检测方法 为循环伏安法或差示脉冲法。其它与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：所述电化学检测 的工作电极为离子液体/多壁碳纳米管复合修饰电极。其它与具体实施方式一至三之一相 同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：所述电化学检测 以0.7V和1.1V的双信号为指标。其它与具体实施方式一至四之一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤一中培养24h 后分为三组。其它与具体实施方式一至五之一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤一中培养4h 后除去MNNG。其它与具体实施方式一至六之一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤一中每48h 进行一次电化学检测。其它与具体实施方式一至七之一相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是：步骤二中每48h 进行一次电化学检测。其它与具体实施方式一至八之一相同。

通过以下试验验证本发明的有益效果：

试验一：本试验的的一种哺乳动物细胞转化的电化学检测方法是按以下步骤进行的：

一、将细胞接种于60mm培养皿，培养24h后分为三组，A组为空白组，记录正常 细胞的电化学行为；B组以浓度为0.8mg/L的甲基硝基亚硝基胍（MNNG）为启动剂， 对细胞进行染毒，培养4h后除去MNNG，每48h进行一次电化学检测；C组用浓度为 5%的二甲基亚砜（DMSO）代替MNNG做阴性对照，与染毒组进行同步电化学检测；

二、将步骤一中B组以MNNG为启动剂的细胞培养8天，然后将细胞分两组：第一 组加入浓度为100μg/L的促进剂TPA；第二组仍为MNNG组；以步骤一中的C组DMSO 组为第三组；对三组细胞每48h进行一次电化学检测，当出现电化学信号TPA组>MNNG 组>DMSO组时，即完成哺乳动物细胞转化的电化学检测方法；

其中，所述细胞Balb/3T3；所述的工作电极为离子液体/多壁碳纳米管复合修饰电极； 所述的电化学检测方法为循环伏安法；所述的细胞前处理方法为原位裂解法；所述的电化 学检测以0.7V和1.1V的双信号为指标。

本试验步骤一中三组细胞培养第4天的伏安图如图1所示，其中，a为A组未加入启 动剂的细胞培养第4天的伏安图；b为C组以DMSO为阴性对照的细胞培养第4天的伏安 图；c为B组以MNNG为启动剂的细胞培养第4天的伏安图；从图1可以看出，Balb/3T3 细胞的两个电化学信号峰：空白组>DMSO阴性对照组>MNNG启动剂组，说明加入启动剂 后，细胞DNA受到损伤，细胞处于修复阶段，分裂减慢，活性降低，电化学信号减弱。

本试验步骤二中三组细胞培养第4天的伏安图如图2所示，其中，a为第三组DMSO 组的细胞培养第4天的伏安图；b为第一组以TPA为促进剂的细胞培养第4天的伏安图；c 为第二组MNNG组的细胞培养第4天的伏安图；从图2可以看出，Balb/3T3细胞的两个电 化学信号峰：DMSO阴性对照组>TPA促进剂组>MNNG启动剂组，说明加入促进剂后， 正常细胞开始向肿瘤细胞转化，核苷酸代谢增强，分裂加速，TPA促进剂组电化学信号强 于MNNG启动剂组。

本试验步骤二中三组细胞培养第8天的伏安图如图3所示，其中，a为第一组以TPA 为促进剂的细胞培养第8天的伏安图；b为第二组MNNG组的细胞培养第8天的伏安图； c为第三组DMSO组的细胞培养第8天的伏安图；从图3可以看出，Balb/3T3细胞的两个 电化学信号峰：TPA促进剂组>MNNG启动剂组>DMSO阴性对照组，说明促进剂加入一周 后，细胞出现永生性，电化学信号激增。

综上所述，采用电化学法检测细胞转化，加入启动剂MNNG后，由于DNA出现损伤， 细胞进行DNA修复，第4天测得细胞电化学信号出现衰减，即双电化学信号强度I_空白>I_DMSO>I_MNNG；加入促进剂TPA后，由于加速了细胞转化，细胞双电化学信号均出现增强， 即加入TPA第4天I_DMSO>I_TPA>I_MNNG，第8天I_TPA>I_MNNG>I_DMSO；说明细胞转化过程中嘌呤 代谢发生显著改变，电化学信号与细胞转化过程具有明显相关性，在促进剂加入第八天， 从电化学信号强度变化即可判断细胞的转化，电化学法检测细胞转化仅需16天。