包含前列腺素F2α衍生物和透明质酸的眼用组合物

摘要

本发明涉及一种包含至少一种前列腺素类似物作为活性化合物和稳定量的至少一种透明质酸或其盐的组合物，所述组合物不含防腐剂；并且涉及其用于治疗有此需要的受试者中的高眼压症和/或青光眼的用途。

说明书

技术领域

本发明涉及治疗高眼压症和青光眼。更具体地，本发明涉及用于治疗高眼压症和青光眼的不含防腐剂的组合物，其中所述组合物包含至少一种前列腺素的类似物和至少一种透明质酸聚合物。

背景技术

青光眼是一种以视神经乳头损害和相关视野缺损，通常伴有眼内压升高(IOP)为特征的眼病。青光眼的特征在于视网膜神经节细胞和视神经轴突的缓慢且进行性退化。在全世界，该疾病影响超过6600万人，引起680万人双眼失明。

一种可以将青光眼分成原发性青光眼(没有已知的先前病因)和继发性青光眼。原发性青光眼可能是由遗传决定的。术语继发性青光眼指由一些已知的先行或伴随的眼部疾病引起的青光眼。而且，原发性青光眼可以基于解剖学分成四个主要类型：开角型青光眼、闭角型青光眼、混合型青光眼和先天性青光眼。原发性开角是最常见的青光眼类型。开角型青光眼代表一种长期、缓慢进展的视神经病，特征为视神经乳头的渐进性凹陷(excavation)和独特模式的视野缺损。该疾病的病因是多因素的，并且与主要导致房水的引流减少的眼内压(IOP)升高更密切相关。

对于青光眼，存在几个公知的危险因素，比如眼内压(IOP)升高、衰老、家族史、高度近视、系统性高血压、心血管疾病、偏头痛、外周性血管痉挛和之前的神经损伤。青光眼导致的可见损伤被认为是不可逆的。然而，如果在足够早期被诊断，则其可以进行治疗。

药物包括抑制房水流入、增加房水流出、保护视神经和控制血浆和眼睛之间的渗透压。

用于治疗青光眼的现有药物属于几个药理学类别，包括β-肾上腺素能阻断剂(噻吗洛尔马来酸、卡替洛尔、倍他洛尔)、胆碱能激动剂、碳酸酐酶抑制剂(多佐胺、布林佐胺)或肾上腺素能受体阻断剂(溴莫尼定)。

降低IOP的另一种方法是通过使用毒蕈碱乙酰胆碱受体激动剂增加液体从眼睛流出。该机制是间接的，包括毒蕈碱乙酰胆碱受体(M3)-介导的睫状肌收缩。该收缩引起小梁网中间距增宽。使用该策略的最新药物类型是前列腺素F2α衍生物(比如，例如，乌诺前列酮、拉坦前列素、曲伏前列素、比马前列素、他氟前列腺素等)。所有这些药物都在其中降低IOP的机制下起作用。这些治疗剂通常呈滴眼剂给药。

前列腺素类似物是在人类组织或器官中发现的化学物成分，显示出广泛的生理学活性。例如，拉坦前列素，也称为异丙基-(Z)-7-[(1R,2R,3R,5S)-3,5-二羟基-2-[(3R)-3-羟基-5-苯基戊基]环戊基]-5-庚烯酸酯，是一种前列腺素F2α受体激动剂，通过促进房水的葡萄膜巩膜流出降低IOP(Camras,C.B.;Podos,S.M.;Rosenthal,J.S.;Lee,P.Y.;Severin,C.H."Multiple dosing of prostaglandin F2alphaor epinephrine on cynomolgus monkey eyes.I.Aqueous humordynamics"Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.1987,28,463)。拉坦前列素的这种性质使得有可能显示持久的控制IOP作用和较优的降低IOP的作用。另外，患者对该药物的顺应性高，并且通过其优良的眼部耐受性建立了其安全性(Sudesh,S.;Cohen,E.J.;Rapuano,C.J.;Wilson,R.P."Corneal toxicity associated with latanoprost"Arch.Ophthalmol.1999,117,539)。

拉坦前列素、曲伏前列素和比马前列素已经作为用于治疗高眼压症和青光眼的眼用滴眼液分别以商标和引入市场。是迄今世界上开处方最多的抗青光眼药品。

然而，与前列腺素类似物有关的问题是其相当差的水溶性及其特别地在水溶液中的化学不稳定性。为了解决这些问题，已经开发了包含前列腺素类似物的眼用剂型。

例如，包含前列腺素类似物的大多数眼用滴眼剂组合物使用防腐剂，其除了对于细菌和真菌具有抗菌性质之外，还增溶前列腺素的类似物和在低温下使其稳定。防腐剂可以通过与前列腺素类似物相互作用和/或通过其均匀分散或溶出到滴眼液中起作用。

现在，在市售可获得的眼用溶液中最常使用的防腐剂是苯扎氯铵(BAC)。BAC(烷基二甲基苄基氯化铵)是证实具有广谱抗菌活性的基于氮的季铵化合物。BAC是多种用于眼用剂型的抗菌防腐剂之一，但是其已经广泛地用于形成眼用微乳剂(参见例如US5,698,219)，因为其正电荷可稳定液滴。包含0.005%的拉坦前列素，并且包装在由0.02%的BAC防腐的2.5mL的多剂量容器中。包含0.004%的曲伏前列素，并且包装在由0.02%的BAC防腐的2.5或5mL的多剂量容器中。包含0.01%或0.03%的比马前列素，并且包装在由0.005%的BAC防腐的3mL的多剂量容器中。

即使这些药物对于治疗青光眼非常值得关注，但是它们具有副作用，其中一些副作用可能是由于存在防腐剂引起的。在治疗该慢性终身(life-long)疾病数月之后，这些药物滴眼剂可开始刺激眼表面且产生眼表面创伤。

实际上，研究已经显示出BAC的致敏性质(Park,H.J.;Kang,H.A.;Lee,J.Y.;Kim,H.O."Allergic contact dermatitis frombenzalkonium chloride in antifungal year solution"Contact Derm.2000,42,306)和毒性(Marple,B.;Roland,P.;Benninger,M."Safety review of benzalkonium chloride as a preservative used inintranasal solutions:an overview of Conflicting data and opinions"Otolaryngol.Head Neck Surg.2004,130,131)。另外，研究已经表明长期重复使用BAC(0.02%的浓度)使角膜变形，诱发不可逆眼睛损伤(Swan,K.C."Reactivity of the Ocular Tissues to Wetting Agents"Am.J.Ophthalmol.1944,27,118)。最后，2009年进行的很多最新研究表明BAC诱发绿脓假单胞菌型细菌对抗生素环丙沙星的耐药性(Mc Cay,P.H.;Ocampo-Sosa A.A.;Fleming,G.T.A."Effect of subinhibitoryconcentrations benzalkonium chloride of on the Competitiveness ofPseudomonas aeruginosa grown in continuous culture"Microbiology2010,156,30)。

所有这些副作用都促进通过减小防腐剂的浓度或从组合物消除它们来限制在眼用滴眼剂溶液中使用防腐剂的医学趋势。

然而，据申请人所知，目前没有销售任何不含或基本上不含防腐剂并且其中所述前列腺素类似物保持溶解、稳定且生物可利用的前列腺素类似物组合物。因此，仍然需要至少与市售产品同样有效的眼科学前列腺素类似物产品，其提高前列腺素类似物的化学稳定性，毒性更小，比常规产品的物理和化学稳定性更好(即,随时间稳定)且患者对其耐受性良好。

更特别地，目前需要前列腺素类似物组合物，其在室温下保持稳定，从而避免其冷藏。令人惊奇地，本申请人表明向前列腺素组合物中加入透明质酸导致其在室温下稳定。

发明内容

因此，本发明涉及一种包含至少一种前列腺素类似物作为活性化合物和稳定量的至少一种透明质酸或其盐的组合物，所述组合物不含防腐剂。在本发明的一个实施方案中，所述组合物随时间稳定，其意味着该组合物满足回收率试验A和/或回收率试验B的要求。在本发明的另一个实施方案中，所述组合物在过滤之后保持稳定，其意味着该组合物满足过滤试验C的要求。

在本发明的一个实施方案中，透明质酸具有的分子量为1.6至4MDa，优选1.6至3MDa，更优选1.6至2.4MDa。在一个实施方案中，所述组合物包含透明质酸的含量为占组合物总体积的约0.01至约1.0%重量，优选约0.05至约0.4%w/v，更优选约0.1至约0.2%w/v，并且甚至更优选约0.1至约0.15%w/v。在一个实施方案中，至少一种前列腺素类似物选自：13,14-二氢-17-苯基-18,19,20-三去甲基前列腺素(trinorprostaglandin)F2α-异丙酯(拉坦前列素)、20-乙基前列腺素F2α-(+)-氟前列醇异丙酯(曲伏前列素)、17-苯基-18,19,20-三去甲基前列腺素F2α-酰胺、13,14-二氢-17-苯基-18,19,20-三去甲基前列腺素F2α-乙基酰胺(比马前列素)、他氟前列腺素前列腺素F2α-乙醇酰胺、比马前列素(游离酸)-d₄、比马前列素-d₄、拉坦前列素乙基酰胺、13,14-二氢-20-乙基-15-酮基前列腺素F2α(乌诺前列酮)、13,14-二氢-20-乙基-15-酮基前列腺素F2α-异丙酯(乌诺前列酮异丙酯)、8-异前列腺素E2、或其两种或更多种的混合物；优选地，所述至少一种前列腺素类似物是拉坦前列素、比马前列素或曲伏前列素。在一个实施方案中，组合物包含占组合物的总体积的约0.0001至约0.5%重量、优选约0.0005至约0.1%w/v、更优选约0.001至约0.05%w/v的至少一种前列腺素类似物。

在本发明的一个实施方案中，组合物进一步包含另外的活性成分，优选另外的抗青光眼试剂，更优选噻吗洛尔马来酸盐。在本发明的一个实施方案中，组合物包含：

‐拉坦前列素，含量为约0.001至约0.05%w/v、优选约0.002至约0.01%w/v、更优选约0.005%w/v；

‐透明质酸，含量为约0.05至约0.4%w/v、优选约0.1至约0.2%w/v、更优选约0.1%w/v；优选地，所述透明质酸具有的分子量为约1.6至约4MDa、优选约1.6至约3MDa、更优选约1.6至约2.4MDa；

‐赋形剂，优选氯化钠、磷酸二氢钠脱水物和磷酸氢二钠无水物；和

‐水。

本发明的另一个目的是包含如上所述组合物与至少一种可药用赋形剂组合的药物组合物。本发明的另一个目的是包含本发明的组合物的药物。

本发明的另一个目的是如上所述用于治疗有此需要的受试者中的高眼压症和/或青光眼的组合物、药物组合物或药物。

在本发明的一个实施方案中，组合物、药物组合物或药物是局部给药至眼睛，优选地以滴眼剂、眼用软膏、眼用凝胶、洗眼溶液、睫毛膏等形式。

在另一个实施方案中，组合物、药物组合物或药物至少每天给药一次。在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物、药物组合物或药物以单位剂量或多剂量形式包装。在一个实施方案中，所述单位剂量或多剂量形式为由LPDE制成的单位剂量或多剂量容器。

本发明的另一个目的是一种用于制备本发明的组合物的方法，包括步骤：

-混合透明质酸或其盐、前列腺素类似物和赋形剂;

-过滤得到的组合物；和

-包装过滤的组合物，优选地包装于在正要填充之前模制的容器中。

定义

在本发明中，下述术语具有下述含义：

‐数字前的“约”指所述数字值加或减10%。

‐“不含防腐剂的组合物”∶指不含具有抗菌性质的防腐剂的组合物，所述抗菌性质的防腐剂即在组合物中具有杀菌或静菌(microstatic)性质的试剂。如本文使用的杀菌剂为杀死微生物的试剂，而静菌剂仅仅抑制微生物的生长。在本发明的一个实施方案中，术语“不含防腐剂”也可以指组合物包含非杀菌量和/或非-静菌量的通常称为防腐剂的试剂。

就本发明而言，具有抗菌性质的防腐剂应当与维持活性化合物或溶液的物理-化学特性的助剂不同，这样的助剂的实例包括但不限于EDTA和维生素E。某些助剂可以存在于本发明的组合物中。在另一个实施方案中，“不含防腐剂”更特别地指组合物不包含选自下列防腐剂：季铵卤化物，其中卤化物优选地为氯化物或溴化物，例如苯扎卤铵(比如，例如BAC)、苯度卤铵(比如，例如苯度溴铵)、苄索卤铵(比如，例如苄索氯铵)、劳拉卤铵(lauralkonium halide)(比如，例如劳拉氯铵)、溴化十六烷基三甲铵、卤化十六烷基三甲铵(比如，例如溴化十六碳烷基三甲铵)、卤化十四烷基三甲基铵(比如，例如溴化十四烷基三甲基铵)、卤化十二烷基三甲铵(比如，例如溴化十二烷基三甲铵)、西曲卤铵、卤化二十二烷基二甲基苄基铵(behenalkonium halide)、西他卤铵(比如，例如西他氯铵)、鲸蜡基乙基二甲基卤化铵(cetethyldimonium halide)、西吡卤铵、苯度卤铵(benzododeciniumhalide)、氯烯丙基乌洛托品卤化物、卤化十四烷基二甲基苄基铵(myristalkonium halide)、卤化十八烷基二甲基苄基铵(stearalkoniumhalide)或其两种或更多种的混合物；硼酸和酒石酸(tartric acid)。

‐“眼用组合物”指期望给药至眼睛的组合物。

‐“前列腺素类似物”：指结合前列腺素受体的分子。

‐“治疗”指同时治疗性治疗和预防性措施或预防措施；其目的是防止或减缓(缓解)目标病理病症或障碍。需要治疗的那些包括已经患有病症的那些以及具有患有病症的那些或其中病症待预防的那些。如果在接受有效量的根据本发明的组合物之后，受试者显示出可观察到的和/或可测量的一种或多种下述的减少或消失：与青光眼或高眼压症有关的一种或多种症状减少、和生活质量问题改善，则受试者的青光眼或高眼压症得到成功地“治疗”。评估疾病的成功治疗和改善的上述参数是由医师熟悉的常规方法容易地测量的。

‐“有效量”指针对靶点而不会引起显著负作用或不良副作用的试剂的水平或数量，(1)延迟或预防青光眼和/或高眼压症的发病；(2)减缓或终止青光眼和/或高眼压症的一种或多种症状的发展、恶化或劣化；(3)使青光眼和/或高眼压症的症状得到改善；(4)降低青光眼和/或高眼压症的严重程度或发病率；或(5)治愈青光眼和/或高眼压症。可以在青光眼和/或高眼压症的发病之前给药有效量，用于预防性作用或预防作用。可选地或另外地，可以在青光眼和/或高眼压症开始之后给药有效量，用于治疗作用。

‐“无菌”指不含或基本上不含任何形式的生命体例如不含活细菌或其它微生物的组合物。

‐“可药用赋形剂”指当给药至动物、优选人类时不会产生不利的、过敏性的或其它不良反应的赋形剂。其可以包括任何所有的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。对于人类给药，制剂应当满足如FDA官方生物制品标准(FDA Office ofBiologics standards)要求的无菌、热原性、全面安全和纯度标准。

‐“稳定量”指存在于包含前列腺素类似物的组合物中的透明质酸的量，其旨在稳定前列腺素类似物，即透明质酸的量引起组合物在特定温度下防腐特定时期之后前列腺素类似物的期望回收率。更特别地，稳定量的透明质酸指导致组合物随时间稳定(即组合物通过如下描述的回收率试验A和/或回收率试验B)的量.在一个实施方案中，所述量可取决于透明质酸的分子量和/或前列腺素类似物在组合物中的含量。

‐“受试者”指动物，优选哺乳动物，更优选人类。在本发明的一个实施方案中，受试者也可以指宠物，例如狗、猫、豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠、雪貂、兔子等。

详细说明

因此，本发明涉及一种包含至少一种前列腺素类似物作为活性化合物和至少一种透明质酸或其盐的组合物，所述组合物不含防腐剂。在一个实施方案中，本发明的组合物是眼用组合物。

在一个实施方案中，所述组合物是治疗、或用于有此需要的受试者中的高眼压症和/或青光眼，并且所述组合物包含有效量的至少一种前列腺素类似物。

在本发明的一个实施方案中，至少一种透明质酸或其盐在组合物中起稳定剂的作用。优选地，所述透明质酸或其盐以稳定量存在。

在本发明中可用的透明质酸盐的实例包括，但不限于透明质酸钠、透明质酸锌、透明质酸钙和透明质酸钾。

在本发明的一个实施方案中，透明质酸具有的分子量为约1600000至约4000000Da、优选约1600000至约3000000Da、更优选约1600000到约2400000Da。

用于测定透明质酸分子量的方法是本领域技术人员熟知的。在本发明的一个优选的实施方案中，用于测定透明质酸分子量的方法是由Laurent描述的方法(Laurent et al,Biochem.Biophys.Acta,1960,42,476)。

根据Laurent等人描述的方法，透明质酸的分子量是根据下述方程式由特性粘度数据计算的：

[η]=0.0036M^0.78

其中η为特性粘度，M为透明质酸的分子量。特性粘度(η)是在25℃下计算的。测量是使用具有流出时间为40至50sec/mL和剪切梯度为约1000cm^-1的Ostwald粘度计在0.15至5.6.10^-3g/ml的浓度范围进行的。

透明质酸为市售可获得的，例如来自Shiseido(Japan)或Contipro(Czech Republic)。在本发明的一个实施方案中，具有的分子量为约1600000至约4000000Da、优选约1600000至约3000000Da、更优选约1600000至约2400000Da的透明质酸来自Shisheido。在本发明的另一个实施方案中，具有的分子量为约1600000至约4000000Da、优选约1600000至约3000000Da、更优选约1600000到约2400000Da的透明质酸来自Contipro。

在本发明的一个实施方案中，组合物包含的透明质酸(HA)的含量为占组合物总体积的约0.01至约1.0%重量，优选约0.05至约0.5%w/v，更优选约0.05至约0.4%w/v，并且甚至更优选约0.1至约0.2%w/v，仍然甚至更优选地约0.1至约0.15%w/v。

在本发明的一个实施方案中，透明质酸(HA)的稳定量为基于组合物总体积的约0.01至约1.0%重量、优选约0.05至约0.4%w/v、更优选约0.1至约0.2%w/v、并且甚至更优选约0.1至约0.15%w/v的透明质酸，所述透明质酸优选地具有的分子量为约1600000至约4000000Da、更优选约1600000至约3000000Da、甚至更优选约1600000至约2400000Da。

在本发明的一个实施方案中，透明质酸和前列腺素的相应量范围为约1∶0.005至约1∶1、优选约1∶0.01至约1∶0.5、更优选约1∶0.025至约1∶0.25。

有利地，当前列腺素为拉坦前列素时，组合物中透明质酸∶拉坦前列素的比例范围为约1∶0.005至约1∶1、优选约1∶0.01至约1∶0.5、更优选约1∶0.025至约1∶0.25、甚至更优选约1∶0.025至约1∶0.1，仍然甚至更优选约1∶0.03至约1∶0.06。在本发明的一个实施方案中，组合物中透明质酸：拉坦前列素的比例为约1∶0.033。在本发明的另一个实施方案中，组合物中透明质酸：拉坦前列素的比例为约1∶0.05。

在本发明的一个实施方案中，组合物中透明质酸∶曲伏前列素的比例范围为约1∶0.005至约1∶1、优选约1∶0.01至约1∶0.5、更优选约1∶0.025至约1∶0.25、甚至更优选约1∶0.025至约1∶0.1，仍然甚至更优选约1∶0.025至约1∶0.05。在本发明的一个实施方案中，组合物中透明质酸：曲伏前列素的比例为约1∶0.027。

在本发明的一个实施方案中，组合物中透明质酸∶比马前列素的比例范围为约1∶0.005至约1∶1、优选约1∶0.01至约1∶0.5、更优选约1∶0.025至约1∶0.25、甚至更优选约1∶0.05至约1∶0.25，仍然甚至更优选约1∶0.1至约1∶0.25。在本发明的一个实施方案中，组合物中透明质酸∶曲伏前列素的比例为约1∶0.2。

在本发明的一个实施方案中，至少一种前列腺素类似物为前列腺素F2α类似物。前列腺素F2α类似物的实例包括，但不限于13,14-二氢-17-苯基-18,19,20-三去甲基前列腺素F2α-异丙酯(拉坦前列素)、20-乙基前列腺素F2α-(+)-氟前列醇异丙酯(曲伏前列素)、17-苯基-18,19,20-三去甲基前列腺素F2α-酰胺、13,14-二氢-17-苯基-18,19,20-三去甲基前列腺素F2α-乙基酰胺(比马前列素)、他氟前列腺素前列腺素F2α-乙醇酰胺、比马前列素(游离酸)-d₄、比马前列素-d₄、拉坦前列素乙基酰胺、13,14-二氢-20-乙基-15-酮基前列腺素F2α(乌诺前列酮)、13,14-二氢-20-乙基-15-酮基前列腺素F2α-异丙酯(乌诺前列酮异丙酯)、8-异前列腺素E2、或其两种或更多种的混合物。优选地，至少一种前列腺素类似物为拉坦前列素、曲伏前列素或比马前列素。

拉坦前列素、曲伏前列素、比马前列素、他氟前列腺素、乌诺前列酮异丙基、8-异前列腺素E2等大多数前列腺素类似物几乎都不溶于水。

在本发明的一个实施方案中，组合物包含用于治疗的或用于治疗有此需要的受试者中的高眼压症和/或青光眼的量、优选地有效量的前列腺素类似物，所述量的范围为组合物总体积的约0.001至0.1%重量(w/v)。在本发明的一个实施方案中，组合物中前列腺素类似物的量、优选有效量的范围为组合物总体积的约0.0001至约0.5%重量，优选约0.0005至约0.1%w/v，更优选约0.001至约0.05%w/v。

在一个实施方案中，本发明的组合物包含如下含量、优选有效量的拉坦前列素：占组合物总体积的约0.0001至约0.5%，优选约0.0005至约0.1%w/v，更优选约0.001至约0.05%w/v，甚至更优选约0.002%到约0.01%w/v，仍然甚至更优选约0.005%w/v。

在一个实施方案中，本发明的组合物包含如下含量、优选有效量的曲伏前列素：占组合物总体积的约0.0001至约0.5%，优选约0.0005至约0.1%w/v，更优选约0.001至约0.05%w/v，甚至更优选约0.002%到约0.01%w/v，仍然甚至更优选约0.004%w/v。

在一个实施方案中，本发明的组合物包含如下含量、优选有效量的比马前列素：占组合物总体积的约0.0001至约0.5%，优选约0.0005至约0.1%w/v，更优选约0.001至约0.05%w/v，甚至更优选约0.005%至约0.05%w/v，仍然甚至更优选约0.01%至约0.04%w/v，并且仍然甚至更优选约0.03%w/v。

在本发明的一个实施方案中，组合物进一步包含一种或多种另外的活性成分，优选一种或多种另外的抗青光眼试剂。

另外的活性成分的实例包括，但不限于β-阻断剂(比如，例如马来酸噻吗洛尔或卡替洛尔氯化物)、碳酸酐酶抑制药(比如，例如氯化多佐胺)、和α-肾上腺素能激动剂(比如，例如酒石酸溴莫尼定)。

在本发明的一个实施方案中，组合物包含至少一种前列腺素类似物与马来酸噻吗洛尔。在第一个实施方案中，组合物包含拉坦前列素和马来酸噻吗洛尔。在第二个实施方案中，组合物包含曲伏前列素和马来酸噻吗洛尔。在第三个实施方案中，组合物包含比马前列素和马来酸噻吗洛尔。

在本发明的一个实施方案中，另外的活性成分、优选另外的抗青光眼试剂的含量范围为占组合物总体积的约0.1至约0.5%重量。在本发明的另一个实施方案中，另外的活性成分的含量范围为占组合物总体积的约0.1至约1%重量，优选约0.4至约0.8%w/v，更优选约0.5至约0.7%w/v。

在本发明的另一个实施方案中，组合物包含的噻吗洛尔、优选马来酸噻吗洛尔的含量为占组合物总体积的约0.1至约1%重量，优选约0.4至约0.8%w/v，更优选约0.5至约0.7%w/v。

在一个实施方案中，本发明的组合物进一步包含另外的成分，例如减充血剂、眼肌调节剂、消炎剂/收敛剂、维生素、氨基酸，条件是所述成分不会引起问题比如眼刺激。

减充血剂的实例包括，但不限于肾上腺素、盐酸肾上腺素、盐酸麻黄碱、盐酸四氢唑啉、盐酸萘唑啉、硝酸萘唑啉、盐酸苯肾上腺素、盐酸甲基麻黄素等。

眼肌调节剂的实例包括，甲基硫酸新斯的明等。

消炎剂/收敛剂的实例包括，但不限于ε-氨基己酸、尿囊素、氯化小檗碱、硫酸小檗碱、薁磺酸钠(sodium azulene sulfonate)、甘草酸二钾盐(dipotassium glycyrrhizinate)、硫酸锌、乳酸锌、氯化溶菌酶等。

维生素的实例包括，但不限于黄素腺嘌呤二核苷酸钠、氰钴胺素、乙酸视黄醇、棕榈酸视黄醇、盐酸吡哆醇、泛醇、泛酸钙、泛酸钠、乙酸生育酚等。

氨基酸的实例包括，但不限于L-天冬酰胺酸钾(potassiumL-asparaginate)、L-天冬酰胺镁、L-天冬酰胺镁/L-天冬酰胺钾(比如，例如等份混合物)、氨基乙基磺酸、硫酸软骨素钠等。

在本发明的一个实施方案中，组合物不包括环糊精、卡波姆和或透明质酸的纳米囊。

在本发明的一个实施方案中，组合物包含下述的成份、或由其组成：

‐拉坦前列素，含量为约0.001至约0.05%w/v，优选约0.002至约0.01%w/v，更优选约0.005%w/v；

‐透明质酸，含量为约0.05至约0.4%w/v、优选约0.1至约0.2%w/v、更优选约0.1%w/v；优选地，所述透明质酸具有的分子量为约1.6至约4道尔顿(MDa)、优选约1.6至约3MDa、更优选约1.6至约2.4MDa；优选地，所述组合物包含约0.1%w/v的1.6MDa透明质酸；

‐赋形剂，优选氯化钠、磷酸二氢钠脱水物和磷酸氢二钠无水物；和

‐水。

在本发明的一个实施方案中，组合物是随时间稳定的。随时间稳定的是指组合物特征在于在特定温度下在特定时期内前列腺素类似物回收率(%)高于期望百分数。

在本发明的第一个实施方案中，如果组合物满足下述回收率试验A的要求，则其是随时间稳定的：

回收率试验A∶

回收率试验A包括在至少3个月期间，在25℃下，测量保存在玻璃容器中的前列腺素类似物组合物中前列腺素类似物的回收率。

在t=0时测量组合物的前列腺素浓度，即一旦制备出组合物就测量，将获得的值指定为C₀。

然后，将玻璃容器保存在特定温度下3个月。

然后，在该特定时间段(t=3个月)结束时，测量组合物的前列腺素类似物浓度。获得的值指定为C₃。

然后，计算(C₃/C₀)×100值。其相应于前列腺素类似物的回收率。

前列腺素类似物浓度的测量是利用具有LC9泵的高压液相色谱(HPLC)进行，例如装有UV检测器的来自Shimadzu的HPLC，使用两种流动相的混合物和使用Shimadzu类型-VP软件。

认为组合物满足回收率试验A的要求，因此，如果前列腺素类似物的回收率高于约80%、优选地高于约90%、更优选地高于约95、96、97、98、99%或更高，则被认为是随时间稳定的。在本发明的第二个实施方案中，如果组合物满足下述回收率试验B的要求，则其是随时间稳定的：

回收率试验B∶

回收率试验B包括在至少3个月期间，在30-40℃下，测量保存在玻璃容器中的前列腺素类似物组合物中前列腺素类似物的回收率。

在t=0时测量组合物的前列腺素浓度，即一旦制备出组合物就测量，将获得的值指定为C₀。

然后，将玻璃容器保存在特定温度下3个月。

然后，在该特定时间段(t=3个月)结束时，测量组合物的前列腺素类似物浓度。获得的值指定为C₃。

然后，计算(C₃/C₀)×100值。其相应于前列腺素类似物的回收率。

前列腺素类似物浓度的测量是利用具有LC9泵的高压液相色谱(HPLC)进行，例如装有UV检测器的来自Shimadzu的HPLC，使用两种流动相的混合物和使用Shimadzu类型-VP软件。

认为组合物满足回收率试验B的要求，因此，如果前列腺素类似物的回收率高于70%、优选地高于约80、86、90%，更优选地高于约96、96.5、97、97.5、98%或更高，则被认为是随时间稳定的。

在一个实施方案中，本发明的不含防腐剂的眼用组合物可以贮存在室温下(本文中，室温指温度范围约15至约30℃，优选地约25℃)，包括单位剂量容器、单位剂量吸量管和分配器。

稳定性研究表明根据本发明的不含防腐剂的眼用拉坦前列素组合物稳定很长时间，例如至少三个月、至少6个月、至少一年、优选地两年且更优选地三年。对于包含曲伏前列素或比马前列素的组合物，可以观察到相同的结果(参见实施例)。

本发明还涉及一种药物组合物，其包含作为活性化合物的至少一种前列腺素类似物，以及至少一种透明质酸及至少一种可药用赋形剂；其中所述药物组合物不含防腐剂。在本发明的一个实施方案中，所述可药用赋形剂是水。在一个实施方案中，本发明的药物组合物包含如上描述的不含防腐剂的组合物。在本发明的一个实施方案中，本发明的药物组合物包含有效量的至少一种前列腺素类似物和/或稳定量的透明质酸。

本发明还涉及一种药物，其包含作为活性化合物的至少一种前列腺素类似物，以及至少一种透明质酸；其中所述药物不含防腐剂。在一个实施方案中，本发明的药物包含如上所述不含防腐剂的组合物。在本发明的一个实施方案中，本发明的药物包括有效量的至少一种前列腺素类似物和/或稳定量的透明质酸。

本发明还涉及用于治疗有此需要的受试者中的高眼压症和/或青光眼的不含防腐剂的眼用组合物，其中所述眼用组合物包含作为活性化合物的至少一种前列腺素类似物，以及至少一种透明质酸。

因此，本发明的另一个目的是如上所述的组合物、药物组合物或药物，用于治疗有此需要的受试者中的高眼压症和/或青光眼。

根据本发明的一个实施方案，组合物、药物组合物或药物用于眼部给药，优选地局部给药至受试者的眼睛。

适合于局部给药至眼睛的剂型的实例包括，但不限于滴眼剂、眼用软膏、眼用凝胶、洗眼水等。在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物、药物组合物或药物为睫毛膏或施用在睫毛上的组合物的形式。

在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物、药物组合物或药物为溶液，优选水溶液。在一个实施方案中，本发明的组合物、药物组合物或药物不包括微球。在本发明的一个实施方案中，组合物、药物组合物或药物是无菌的。

在本发明的一个实施方案中，眼用组合物进一步包含常规添加剂或赋形剂。可以加入到本发明的组合物中的添加剂或赋形剂的实例包括，但不限于缓冲剂、渗透剂、pH调节剂和抗氧剂。

合适的缓冲剂的实例包括，但不限于磷酸二氢钠二水合物、磷酸二氢钠单水合物、磷酸钠无水物、柠檬酸或其盐(比如，例如柠檬酸钠等)、葡糖酸或其盐(比如，例如葡糖酸钠等)、乙酸或其盐(比如，例如乙酸钠等)、磷酸或其盐(比如，例如磷酸氢钠等)、各种氨基酸比如谷氨酸和ε-氨基己酸及三羟甲基氨基甲烷缓冲液(tris buffers）、或其任意组合。在一个实施方案中，缓冲剂为磷酸二氢钠一水合物、磷酸氢二钠无水物或其混合物。在另一个实施方案中，缓冲剂为磷酸二氢钠脱水物和磷酸氢二钠的混合物。

张度剂（渗透剂）的特定实施例包括，但不限于甘油、山梨醇、甘露醇、丙二醇、甘油、赤藓糖醇(erythriol)、阿拉伯糖醇、木糖醇、核糖醇、半乳糖醇、multitol、聚乙二醇(比如，例如聚乙二醇Macrogol4000)、拉克替醇及其它糖醇、氯化钠、氯化钾和氯化钙。在一个优选的实施方案中，张度剂选自山梨醇(比如，例如D-山梨醇)、甘油和聚乙二醇4000。在本发明的一个实施方案中，张度剂为高渗剂，优选氯化钠。

在本发明的一个实施方案中，眼用溶液的pH适合于防止给药之后对眼睛的任何刺激，范围为约4至约10、优选约5.0至约8.0、更优选约6.2至约7.2。在本发明的一个实施方案中，使用pH调节剂，例如磷酸盐或硼酸盐。本发明的组合物中可以包括的pH调节剂的实例包括，但不限于氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钠、盐酸、柠檬酸或其盐(比如，例如柠檬酸钠、柠檬酸二氢钠等)、磷酸或其盐(比如，例如磷酸氢二钠、磷酸二氢钾等)、乙酸或其盐(比如，例如乙酸钠、乙酸铵等)、及酒石酸和/或盐酸或其盐。在一个优选的实施方案中，pH调节剂选自磷酸氢二钠和磷酸二氢钠脱水物。

在本发明的一个实施方案中，抗氧剂可以加入到组合物中，以防止前列腺素氧化。抗氧剂的具体实例包括，但不限于亚硝酸钠、抗坏血酸、L-抗坏血酸硬脂酸酯、亚硫酸氢钠、α-硫代甘油、异抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、乙酰半胱氨酸、乙二胺四乙酸、柠檬酸、二氯异氰尿酸钾、二丁基羟基甲苯、2,6-二-叔丁基-4-甲基苯酚、大豆卵磷脂、巯基乙醇酸钠、硫代苹果酸钠、维生素A、维生素C、维生素E、生育酚、ascorbyl pasthyminate、焦亚硫酸钠、丁基羟基茴香醚、1,3-丁二醇、没食子酸丙酯、2-巯基苯并咪唑和硫酸羟基喹啉。优选地，抗氧剂为乙二胺四乙酸(EDTA)或其盐。

在本发明的一个实施方案中，组合物包含磷酸二氢钠一水合物、磷酸钠无水物和/或氯化钠，优选地包括磷酸二氢钠一水合物、磷酸钠无水物和氯化钠。

在另一个实施方案中，本发明的组合物包含D-山梨醇、甘油和/或聚乙二醇。在一个实施方案中，本发明的组合物包含的D-山梨醇、甘油和/或聚乙二醇的含量为占组合物总体积的约1%至约10%重量，优选约2%到约5%(w/v)，更优选约4.5%(w/v)。

在本发明的另一个实施方案中，组合物包含EDTA。在一个实施方案中，组合物包含EDTA的含量范围为占组合物总重量的约0.005%至约0.05%，优选约0.01%至约0.1%(w/v)，更优选约0.05%(w/v)。

在本发明的另一个实施方案中，本发明的组合物包含：

‐磷酸二氢钠一水合物、磷酸钠无水物和氯化钠；和

‐D-山梨醇、甘油和/或聚乙二醇中至少一种，优选地D-山梨醇、甘油和/或聚乙二醇之一；和

‐任选地EDTA。

在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物进一步包括载体。优选地，所述载体为水。

本发明还涉及一种用于治疗有此需要的受试者中高眼压症和/或青光眼的方法，其中所述方法包括向受试者给药根据本发明的不含防腐剂的组合物、药物组合物或药物。

在本发明的一个实施方案中，所述方法包括向受试者的眼睛局部给药本发明的不含防腐剂的组合物、药物组合物或药物。

在本发明的一个实施方案中，向受试者给药所述组合物至少每周一次、优选地至少每周两次、优选地至少每天一次。

在本发明的一个实施方案中，向受试者给药的组合物的量范围为约0.05至约10mL的组合物，优选约0.1至约2.5mL，更优选约0.15至约1mL，并且甚至更优选约0.2至约0.5mL。

本领域技术人员应当理解待给药的组合物的量以及给药途经可以取决于待治疗的青光眼患者症状的严重程度。本发明的组合物典型的给药可以是局部给药约每天每只眼睛一滴。

在本发明的一个实施方案中，受试者诊断患有青光眼和/或高眼压症。

在另一个实施方案中，受试者处于发展为青光眼和/或高眼压症的风险中。在第一个实施方案中，所述风险相应于青光眼和/或高眼压症家族倾向性，例如青光眼和/或高眼压症的遗传倾向性。在第二个实施方案中，所述风险相应于在受试者中存在IOP升高。危险因素的其它的实例包括，但不限于衰老、高度近视、系统性高血压、心血管疾病、偏头痛、外周性血管痉挛和之前的神经损伤。

在本发明的另一个实施方案中，受试者存在约21mmHg至约25mmHg的IOP。在本发明的另一个实施方案中，受试者存在约25mmHg至约30mmHg的IOP。在本发明的另一个实施方案中，受试者存在高于30mmHg的IOP。

本发明还涉及一种用于制备本发明的组合物的方法。

在一个实施方案中，本发明的方法包括在反应器中混合前列腺素类似物、透明质酸或其盐和赋形剂与载体(优选水)。

在本发明的一个实施方案中，所述混合包括三个步骤：

(a)混合赋形剂，优选地通过温和地搅拌，并且任选地使用pH调节剂调节得到的溶液的pH为约4至约10、优选约5至约8、更优选约6.2至约7.2；

(b)向步骤(a)中得到的溶液的一部分、优选步骤(a)中得到的溶液的2至50%、更优选约5-20%、更优选约10%中加入透明质酸或其盐；并且混合，优选地搅拌得到的溶液；任选地，将得到的溶液在约4-8℃下冷冻；

(c)向步骤(b)中得到的溶液中加入前列腺素类似物；并且混合，优选地搅拌得到的溶液；

(d)向步骤(c)的溶液中加入步骤(a)中得到的溶液的剩余部分；混合；并且调节水以达到最终体积，并且搅拌例如75分钟；和

(e)任选地使用pH调节剂调节得到的溶液的pH为约4至约10、优选约5至约8、更优选约6.2至约7.2。

在本发明的一个实施方案中，然后，过滤得到的溶液。

在本发明的一个实施方案中，优选地在正要给药至受试者前过滤组合物，以避免对受试者的任何微生物污染。

在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物使得在过滤之后，滤过率具有至少75%，优选地至少80、85、90%，更优选地至少95、96、97、98、99%或更高，其中所述滤过率相应于回收的前列腺素类似物的百分数，优选地，所述滤过率是在用0.2μM过滤器过滤后测量的。用于测定滤过率的方法是本领域技术人员熟知的。这种方法的实例包括，但不限于如下所述的试验B。

在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物在过滤之后保持稳定，其意味着在过滤本发明的组合物之后，前列腺素的含量基本上不会降低。如果前列腺素组合物满足下述过滤试验C的要求，则其被认为在过滤后保持稳定：

过滤试验C

过滤试验C包括测量本发明的组合物过滤穿过0.2μM过滤器的过滤回收率F_R。

在t=0测量组合物的前列腺素浓度，即一旦制备出组合物就测量，将获得的值指定为C₀。

然后，将组合物过滤穿过0.2μM过滤器。

之后，在过滤后，测量组合物的前列腺素类似物浓度。将获得的值指定为C_F。

然后，如下计算F_R值∶(C_F/C₀)x100。

前列腺素类似物浓度的测量是利用具有LC9泵的高压液相色谱(HPLC)进行，例如装有UV检测器的来自Shimadzu的HPLC，使用两种流动相的混合物和使用Shimadzu类型-VP软件。

如果组合物的F_R高于75%，优选地高于80、85、90%，更优选地高于95、96、97、98、99%或更高，则认为该组合物在过滤之后保持稳定。

在本发明的一个实施方案中，在过滤之后包装本发明的组合物。在本发明的一个实施方案中，所述包装例如所制备的用于包含本发明的组合物的容器或瓶子，是在正要填充和密封之前模制的。本发明的制造方法的实例显示在图6中。

在本发明的一个实施方案中，组合物以单位剂量或多剂量形式包装，优选地包装在单位剂量或多剂量容器中。优选地，本发明的组合物包装在单位剂量容器中。

在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物包装在用于滴眼制剂的一般塑料容器中。可以用于所述容器的材料的实例包括，但不限于热塑性树脂例如聚乙烯(PE)、低密度聚乙烯(LDPE)、聚丙烯(PP)、聚对苯二甲酸乙酯(PET)、聚萘二甲酸乙二醇酯(PEN)、聚烯丙酯(PA)；或聚碳酸乙烯酯/乙烯醇共聚物。优选地，使用的热塑性树脂在成本、强度、光学透射比、气体或水蒸汽阻隔性能(水分渗透)等方面是令人满意地。在一个优选的实施方案中，包装为以LDPE生产的单剂量或多剂量容器。

在本发明的一个实施方案中，容器包括在顶部的过滤器，优选0.2μM过滤器。用于容器顶部的过滤器的材料的实例包括，但不限于聚醚砜(PES)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚碳酸酯、聚四氟乙烯(PTFE)及混合纤维素酯(MSE)。优选地，过滤器由聚醚砜制造。由聚醚砜制造的过滤器是市售可获得的，包括由Millipore Corporation制造的Millipore和Millipore Express

在本发明的一个实施方案中，根据本发明的眼用组合物可以装在单位剂量容器或多剂量容器中，比如(UrsapharmArzneimittel GmbH)、(Rexam)、Ophthalmic SqueezeDispenser(Aptar)或允许长时间提供不含防腐剂的眼用溶液的同等容器中。这些无空气的多剂量容器装有防止在滴注之后空气渗入瓶子中（其可以引入无菌眼用组合物的微生物污染）的系统。

在一个实施方案中，本发明的组合物包装在由吹塑法制造的单位剂量容器中。

在一个实施方案中，单位剂量容器具有的体积范围为约0.1至约10mL，优选约0.5至约2.5mL，更优选约1mL。

在本发明的一个实施方案中，单位剂量容器填充的本发明组合物的体积为约0.05至约10mL、优选0.1至约1mL、更优选约0.2至约0.5mL。

这样的容器的各种各样的形状都是已知的。典型的实例参见US5,409,125和US6,241,124。在本发明的一个实施方案中，容器可以具有圆柱状形状。在多剂量容器的情形中，有可能适当地选择容器的容量。

在本发明的一个实施方案中，包含本发明的组合物的多剂量容器具有的容量范围为约0.5至约20mL、优选1至约10mL、更优选约2至约5mL。

在本发明的一个实施方案中，组合物包装在单位剂量吸量管和分配器中。

本申请人令人惊奇地表明在包含前列腺素类似物的眼用组合物中存在透明质酸引起前列腺素类似物的稳定性改善。提高的稳定性是在室温下或在应力条件(温度范围30或40℃以上)保存的组合物中测量的。

因此，本发明还涉及用于提高前列腺素类似物的组合物，其中所述组合物包含至少一种前列腺素类似物和透明质酸。优选地，所述前列腺素类似物选自拉坦前列素、比马前列素和曲伏前列素。

在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物因而呈现下述优点∶

‐其在室温下稳定至少1个月，优选地至少2、3、4、5或6个月，更优选地至少1、2或3年；

‐当局部应用在眼睛上时，其呈现与相同的药代动力学性质；

‐其可容易地被过滤；

‐其不包括具有抗菌性质的防腐剂，例如BAC，因此避免了相关毒性；

‐前列腺素类似物有效地溶于组合物中。

附图说明

图1为显示对于不含透明质酸(不含聚合物)或含具有分子量1.6MDa或2.4MDa的透明质酸的拉坦前列素组合物，拉坦前列素回收率的百分数作为时间函数的柱状图组合。拉坦前列素回收率是组合物在2-4℃(A)、25℃(B)、30℃(C)或40℃(D)下保存之后测量的。

图2为显示对于不含透明质酸(不含聚合物)或含具有分子量1.6MDa的透明质酸的曲伏前列素组合物，曲伏前列素回收率的百分数作为时间函数的柱状图组合。曲伏前列素回收率是组合物在25℃(A)或40℃(B)下保存之后测量的。

图3为显示对于不含透明质酸(不含聚合物)或含具有分子量1.6MDa的透明质酸的比马前列素组合物，比马前列素回收率的百分数作为时间函数的柱状图组合。比马前列素回收率是组合物在25℃(A)或40℃(B)下保存之后测量的。

图4为显示对于包含拉坦前列素；拉坦前列素和1.6MDa透明质酸或拉坦前列素、噻吗洛尔和1.6MDa透明质酸的组合物，拉坦前列素回收率的百分数作为时间函数的柱状图组合。拉坦前列素回收率是组合物在2-4℃(A)或25℃(B)下保存之后测量的。

图5为显示在3个月前列腺素回收率的百分数作为前列腺素组合物中存在的透明质酸分子量的函数的柱状图。试验的前列腺素为拉坦前列素、曲伏前列素和比马前列素。100%的百分数对应于在t=0时组合物中存在的前列腺素的含量(*)∶统计学显著性差异(P<0.01)。

图6为本发明的制备方法的图。

具体实施方案

将通过下述实施例进一步阐述本发明。

实施例1∶眼用滴眼液

不同的眼用滴眼液为在本文描述的优选的组合物。然而，这样的实施例决不应当解释为限制性含义，而是尽可能地认识到是可以最终修饰因而不会脱离本发明原理的方法。

用于制备包含前列腺素类似物的溶液的方案的实施例∶

将磷酸氢二钠无水物和磷酸二氢钠二水合物加入到氯化钠的溶液中。在搅拌10分钟之后，测量称为“溶液1”的溶液的pH，并且使用10%的磷酸氢二钠溶液或10%的磷酸二氢钠溶液调节至6.3-7.1。然后，将透明质酸加入到10%溶液1中。搅拌得到的混合物30分钟或直到完全溶解，得到“溶液2”，并且至少在4-8℃下冷却。此后，加入前列腺素类似物。在搅拌30分钟之后，将该组合物与剩余的90%溶液1混合，并且使用纯净水达到最终体积。然后，搅拌该组合物75分钟，检查pH，并且如有必要进行校正。最后，在膜滤器(0.2μm)上实现过滤除菌，得到不含颗粒的澄清无色溶液。

使用一定范围的HA(0.6至3MDa)确定溶解性和稳定性。使用拉坦前列素(0.005g)、曲伏前列素(0.004g)或比马前列素(0.03g)的稀释液在用于获得不含颗粒的澄清无色溶液的安全条件下，使用包含水、磷酸二氢钠一水合物和磷酸氢二钠无水物的磷酸盐缓冲液作为缓冲液，使用氯化钠作为高渗剂，并且在某些组合物中：D-山梨醇或Macrogol4000作为等渗剂，EDTA作为抗氧剂，具有控制的摩尔渗透压浓度(240-290mosmol/kg)和平衡pH(6.3至7.1)，制备所有前列腺素类似物样品。拉坦前列素、曲伏前列素和比马前列素都购自Finetech(Israel)、Aceto(France)和Teva API Division(Italy)。透明质酸购自Shiseido(Japon)或Contipro(Czech Republic)。对包含在单位剂量容器中的眼用组合物进行分析。

含有0.15%透明质酸的测试配方

表1:眼用滴眼液中使用的化合物的实施例

物质功能拉坦前列素活性物质曲伏前列素活性物质比马前列素活性物质噻吗洛尔(马来酸盐)活性物质透明质酸增溶剂和稳定剂磷酸二氢钠一水合物缓冲剂磷酸氢二钠无水物缓冲剂氯化钠高渗剂D-山梨醇等渗剂甘油等渗剂Macrogol4000等渗剂乙二胺四乙酸二钠(EDTA)抗氧剂纯净水载体

表2:含或不含透明质酸的包含0.005%拉坦前列素的眼用滴眼液

表3:包含0.004%曲伏前列素或0.03%比马前列素与0.15%透明质酸的眼用滴眼液

表4:包含0.005%拉坦前列素、0.004%曲伏前列素或0.03%比马前列素与0.5%马来酸噻吗洛尔和0.15%透明质酸的眼用滴眼液

含有0.10%透明质酸的测试配方

表5:含或不含0.5%马来酸噻吗洛尔、包含0.005%拉坦前列素和0.10%透明质酸的眼用滴眼液

赋形剂的变化

表6:包含0.005%拉坦前列素/0.10%透明质酸，以及山梨醇、甘油或Macrogol4000的眼用滴眼液

表7:包含0.005%拉坦前列素/0.10%透明质酸/EDTA，以及山梨醇、甘油或Macrogol4000的眼用滴眼液

实施例2∶化学稳定性研究

为了测量在本发明组合物中的前列腺素类似物的固有稳定性，本申请人进行了稳定性试验，其中使本发明的组合物在特定时期内接受特定温度(高至40℃)。在不同温度下：冷藏2-4℃(长期稳定性试验)、25℃(加速稳定性试验)、30℃(应力稳定性试验1)和40℃(应力稳定性试验2)，对样品进行稳定性研究。

利用具有LC9泵的高压液相色谱(HPLC)进行拉坦前列素、曲伏前列素和比马前列素回收率的评价。简而言之，将样品保存在玻璃容器中。使用装有UV检测器的HPLC，并且使用两种流动相的混合物和使用Shimadzu类型-VP软件测定拉坦前列素、曲伏前列素和比马前列素的含量。

结果呈现在图1-4中，其中呈现拉坦前列素、曲伏前列素和/或比马前列素的百分回收率。

图1呈现用组合物A(不含HA)、B(HA1.6Mda)和C(HA2.4MDa)测量的拉坦前列素回收率。如图1A-D所示，拉坦前列素的百分回收率在透明质酸的存在下增加，无论哪个温度。而且，对于两种试验分子量的透明质酸，即1.6MDa和2.4MDa都观察到该作用。

如图2所示，也采用曲伏前列素(含有1.6MDa透明质酸的组合物对应于如上描述的组合物D)测量到透明质酸对前列腺素回收率的这一改善。

对于包含比马前列素的组合物获得类似的结果，如图3所示，其中具有1.6MDa透明质酸的组合物对应于如上描述的组合物E。

综上，这些结果令人惊奇地表明透明质酸(1.6MDa或2.4MDa)都赋予前列腺素滴眼液至少3个月的稳定性，并且甚至在应力条件(40℃)下。

而且，使用包含拉坦前列素(组合物A)；拉坦前列素和1.6MDa透明质酸(组合物I)或拉坦前列素、噻吗洛尔和1.6MDa透明质酸(组合物J)进行在2-4℃或25℃下的长期(6个月)回收率试验。结果呈现在图4中。

令人惊奇地，如图4所示，透明质酸(1.6MDa)的存在赋予拉坦前列素和拉坦前列素/噻吗洛尔滴眼液稳定性，从在25℃下6个月之后可见。

实施例3∶在一定范围分子量的透明质酸存在下前列腺素的化学稳定性

使用一定范围透明质酸分子量(60至300万道尔顿(MDa))研究前列腺素稳定性。试验组合物包含在磷酸盐缓冲液中的前列腺素(0.005%拉坦前列素或0.004%曲伏前列素或0.03%比马前列素)和0.15%(w/v)的透明质酸。利用高压液相色谱(HPLC)进行拉坦前列素、曲伏前列素和比马前列素回收率的评价。简而言之，在40℃下，将样品保存在玻璃容器中3个月。使用装有UV检测器的HPLC，并且使用两种流动相的混合物和使用Shimadzu类型-VP软件测定拉坦前列素、曲伏前列素和比马前列素的含量。

结果表示为与前列腺素的初始浓度相比(即，在t=0下前列腺素回收率的百分数为100%)在3个月(t=3个月)前列腺素回收率的百分数。

回收率试验的结果呈现在图5中。如图5所示，当透明质酸的分子量高于或等于1.6MDa时，前列腺素回收率的百分数统计学地增加。使用三种试验的前列腺素，即拉坦前列素、曲伏前列素和比马前列素都观察到这一作用。

实施例4∶在染色的兔子中眼部药代动力学的比较研究

为了比较在滴点单剂量的三种包含0.005%拉坦前列素的眼用滴眼组合物之后，拉坦前列素(酸形式)在两个眼部组织(角膜和结膜(conjonctiva))中的存留状态，已经进行眼部药代动力学的比较研究。研究目的是评价组合物A或组合物B是否具有与市售参照产品相同的眼部动力学特性。

简而言之，对三组9只染色的兔子进行比较研究。将一滴拉坦前列素的0.005%局部眼用滴眼组合物滴入兔子的右眼(一滴=50μL)，使用左眼作为阴性对照。将包含防腐剂的参照产物给药至第一组，其它组接受不含防腐剂的眼用滴眼液(n°2组接受组合物A，n°3组接受组合物B)。在从结膜和角膜提取之后，通过HPLC测定拉坦前列素(酸形式)的回收率。在每次分析时测试每组三只兔子。

表8:及组合物A和组合物B之间的眼部药代动力学比较研究

*每个时间点从三只动物收集的样品。

这些结果表明在三组试验组合物，即；包含拉坦前列素的组合物A；以及包括拉坦前列素和透明质酸的组合物B之间，在滴注后6小时和24小时角膜和结膜中剩余拉坦前列素的浓度相等。

因此，对于第1、2和3组，在单次滴点一滴0.005%局部眼用组合物之后拉坦前列素的眼部浓度动力学似乎相等。

本领域技术人员已知，局部给药拉坦前列素达到眼睛内部，例如房水(et al,Drug Metab.Disp.1998,26,745)。因此，由于和本发明的组合物(其都包含拉坦前列素，区别仅仅在于分别存在BAC或透明质酸)之间，所测量的浓度动力学在角膜和结膜中相等，因此眼睛内部特别是房水中的浓度动力学也相等。

实施例5∶临床试验方案

该临床试验的主要目标是通过第一次就诊和最后一次就诊之间测量的每日IOP的平均降低，证实在治疗原发性开角型青光眼或高眼压方面，与市售包含防腐剂的拉坦前列素滴眼剂(Pfizer)相比，本发明的滴眼剂组合物(包含50μg/ml拉坦前列素和赋形剂，不含防腐剂)的非劣性(non-inferiority)。而且，还评价了本发明的组合物的安全性和耐受性。

受试者

对150名受试者进行临床试验(75名患者随机分布在两个处理组的每组中，接受本发明的组合物或。该临床试验选择的受试者为至少18岁，男性或女性，患有单眼或双眼原发性开角型青光眼或高眼压症。他们采用降低IOP的前列腺素类似物制剂治疗至少6个月，并且双眼具有IOP＜21mmHg、对应于0.7的logMAR的≥20最佳矫正视敏度（100中的）。

方法

将本发明的组合物或的滴眼剂局部给药至眼睛28天。在晚上(21点+/-15min)，每日一次给药受影响的眼睛一滴组合物。

使用例如Goldmann applanation眼压计(其为用于测量IOP的目前金标准仪器)测量眼内压。其通过使角膜区域变平并测量使角膜区域变平需要的压力量测量IOP。因为仪器需要接触到眼睛，医生首先给药麻醉滴剂以使眼睛失去知觉，并给药荧光素染料滴剂以在测量期间产生更明显可见的泪膜。

评价眼睛参数(视敏度、眼内压、眼部不适...)以及一般参数(血压、心率等)。从第1天(开始日)到第28天(最后一次就诊)，按日程就诊四次。由盲研究者进行临床试验中每名参与者的评价。