用于降低血浆来源免疫球蛋白组合物的血栓栓塞可能性的方法

摘要

本发明提供通过使用阳离子交换色谱来降低免疫球蛋白组合物的酰胺分解和抗补体活性(ACA)含量的方法。在一个特定实施方案中，本发明提供通过收集阳离子交换洗脱液的前导部分来降低免疫球蛋白组合物的因子XI和/或因子XIa和/或ACA含量的方法。本发明还提供免疫球蛋白组合物，其具有降低的酰胺分解活性水平、因子XI和/或因子XIa和/或ACA含量。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2011年8月26日提交的美国临时申请第61/527,974 号的权益，所述美国临时申请的内容以全文引用的方式明确并入本文 中以用于所有目的。

发明背景

血浆来源血液产品不仅用于治疗多种血液病症，而且用于治疗其 它根源的疾病。举例来说，1952年首次使用来源于人血浆的免疫球 蛋白(IgG)产品来治疗免疫缺陷症。从那时起，IgG制剂被广泛用于至 少三类主要的医学病状中：(1)免疫缺陷症，如X连锁无丙种球蛋白 血症(X-linked agammaglobulinemia)、低丙种球蛋白血症(原发性免疫 缺陷症)以及后天性免疫功能降低病状(继发性免疫缺陷症)、特征性低 抗体含量；(2)炎症和自身免疫疾病；以及(3)急性感染。

在制备和配制血浆来源生物疗法时，必须考虑各种安全预防措 施。这些预防措施包括去除和/或失活血液传播病原体(例如病毒性和 细菌性病原体)、抗补体活性以及因使用捐赠血浆所产生的其它非所 需污染物的方法。研究已指出，施用酰胺分解活性水平高的药物可能 导致非所需的血栓栓塞事件(Wolberg AS等,Coagulation factor XI is a  contaminant in intravenous immunoglobulin preparations.Am J Hematol 2000;65:30-34；和Alving BM等,Contact-activated factors:contaminants  of immunoglobulin preparations with coagulant and vasoactive properties. J Lab Clin Med1980;96:334-346；所述文献的公开内容以全文引用的 方式并入本文中用于所有目的)。

血栓栓塞事件报导增加后，(Octapharma)在美国自愿退 市并且欧洲委员会中止和Octagam10%的行销授权，这都 着重表明了这个担忧。已提出的是，血栓栓塞事件的增加归结于生物 体内高水平的酰胺分解活性，这是由丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶酶 原杂质造成，如因子XI、因子XIa、因子XII以及因子XIIa(FDA通 告：自愿退市-2010年9月23日，Octagam[静脉内免疫球蛋白(人)] 的5%液体制剂；Octagam50mg/ml灌注溶液，Octapharma France-Mise  en quarantaine de tous les lots，2010年9月9日AFSSAPS线上公布； 和欧洲药品管理局(European Medicines Agency)在2010年9月23日 线上公布的关于中止Octagam(5%和10%人正常免疫球蛋白)的行销 授权的问答)。

EDQM(European Directorate on the Quality of Medicines&Health  Care(欧洲药品质量和健康保障局))公布了一篇关于静脉内施用(0918) 人正常免疫球蛋白的专论修订版，以便在2012年1月1日进行快速 实施，从而解决免疫球蛋白产品的潜在促凝血活性。修订版阐明“制 备方法还包括显示可除去血栓生成剂的一个或多个步骤。重点是鉴别 活化凝血因子和其酶原以及可能引起其活化的工艺步骤。还应关注可 由制造工艺引入的其它促凝血剂。”

2011年3月18日，Swissmedic报道称：FDA已注意到血栓栓塞 不利事件与众多Vivaglobin产品有关。由CSL制造的Vivaglobin(160 mg/mL人正常免疫球蛋白皮下注射溶液)已获准为用于患有原发性免 疫缺陷综合征、骨髓瘤或慢性淋巴性白血病的成人与儿童的替代疗 法。血栓栓塞不利事件的风险直到这次的这种施用途径才得以认识。 调查揭示，至少一些批次中存在促凝血活性。结果，Vivaglobin退出 市场并且被新产品Hizentra(20%人正常免疫球蛋白皮下注射溶液)替 代。由于关于Vivaglobin的不利事件的报道，因此现在要求皮下施用 的免疫球蛋白产品具有低水平的促凝血活性，类似于对于静脉内免疫 球蛋白产品的要求。

总称为凝血因子的专门丝氨酸蛋白酶为凝血级联的接触活化与 组织因子途径的整体组分。刺激凝血途径之后，作为失活酶前体的丝 氨酸蛋白酶酶原变成催化下一个蛋白酶酶原活化的活化蛋白酶，从而 产生活化级联。这种凝血级联使凝血酶(因子IIa)和因子XIIIa的活化 达到顶点，所述凝血酶和因子XIIIa的作用分别是使纤维蛋白原(因子 I)转变成纤维蛋白(因子Ia)和与纤维蛋白交联形成纤维蛋白凝块。

接触活化途径(又称为固有凝血途径)始于激肽释放酶和因子 XIIa(FXIIa)分别从前激肽释放酶和因子XII的活化。活化丝氨酸蛋白 酶FXIIa使因子XI(FXI)分解，从而使酶原转变成因子XIa(FXIa)，所 述因子XIa为一种参与因子Xa(FXa)的后续活化丝氨酸蛋白酶。

由于越来越多地担心血浆来源蛋白质组合物中存在丝氨酸蛋白 酶和丝氨酸蛋白酶酶原，因此，本领域中仍需要降低免疫球蛋白制剂 中这些污染物(尤其是FXI及FXIa)的含量的方法。

发明简述

本发明在各个方面中提供用于降低IgG免疫球蛋白组合物的酰 胺分解性含量(例如FXI和/或FXIa)的方法，和酰胺分解活性水平(例 如FXI和/或FXIa)低于市面上可获得的相当组合物的IgG免疫球蛋白 组合物。

在第一方面中，本发明提供用于降低血浆来源免疫球蛋白组合物 中的因子XI(FXI)和/或因子XIa(FXIa)含量的方法，所述方法包括以 下步骤：(a)提供包含IgG免疫球蛋白和FXI和/或FXIa的血浆来源 免疫球蛋白组合物；(b)使所述血浆来源免疫球蛋白组合物与安置在 色谱柱中的阳离子交换树脂在包括pH不超过6.0并且电导率不超过 11mS/cm的第一溶液条件下接触，以便使IgG免疫球蛋白和至少一 部分FXI和/或FXIa与所述阳离子交换树脂结合；(c)通过使所述阳 离子交换树脂与包括pH为至少7.5并且电导率为至少15mS/cm的洗 脱缓冲液接触来形成包含前导部分和滞后部分的洗脱液从而使IgG 免疫球蛋白从阳离子交换树脂中洗脱；以及(d)分别收集所述洗脱液 的所述前导部分和所述洗脱液的所述滞后部分，其中所述洗脱液的所 述前导部分占所述洗脱液的不超过80%。

在上文提供的方法的一个实施方案中，洗脱缓冲液包括至少20 mS/cm的电导率。在上文提供的方法的另一个实施方案中，洗脱缓冲 液包括至少22mS/cm的电导率。在上文提供的方法的另一个实施方 案中，洗脱缓冲液包括至少25mS/cm的电导率。

在上文提供的方法的一个实施方案中，所述方法在步骤(c)中使所 述免疫球蛋白从所述阳离子交换树脂洗脱之前进一步包括以下步骤： 用pH不超过6.0和电导率小于11mS/cm的洗涤缓冲液洗涤结合有所 述免疫球蛋白和FXI和/或FXIa的所述阳离子交换树脂。

在上文提供的方法的一个实施方案中，所述阳离子交换树脂为弱 阳离子交换树脂。在上文提供的方法的一个特定实施方案中，所述弱 阳离子交换树脂为羧甲基阳离子交换树脂。

在上文提供的方法的一个实施方案中，洗脱缓冲液的pH介于7.5 与8.5之间。在上文提供的方法的另一个实施方案中，洗脱缓冲液的 pH为8.0±0.2。

在上文提供的方法的一个实施方案中，洗脱缓冲液包含介于200 mM与300mM之间的氯化钠。在上文提供的方法的另一个实施方案 中，洗脱缓冲液包含介于240mM与260mM之间的氯化钠。

在上文提供的方法的一个实施方案中，洗脱缓冲液包含介于100 mM与300mM之间的甘氨酸。在上文提供的方法的另一个实施方案 中，洗脱缓冲液包含介于175mM与225mM之间的甘氨酸。

在上文提供的方法的一个实施方案中，所述洗脱液的所述前导部 分由不超过70%的所述洗脱液组成。

在上文提供的方法的一个实施方案中，所述分别收集所述洗脱液 的所述前导部分和所述洗脱液的所述滞后部分的步骤包括分别收集 pH不超过7.0的洗脱液和pH超过7.0的洗脱液。

在上文提供的方法的一个实施方案中，所述分别收集所述洗脱液 的所述前导部分和所述洗脱液的所述滞后部分的步骤包括分别收集 pH不超过6.5的洗脱液和pH超过6.5的洗脱液。

在上文提供的方法的一个实施方案中，所述分别收集所述洗脱液 的所述前导部分和所述洗脱液的所述滞后部分的步骤包括分别收集 pH不超过6.0的洗脱液和pH超过6.0的洗脱液。

在上文提供的方法的一个实施方案中，所述分别收集所述洗脱液 的所述前导部分和所述洗脱液的所述滞后部分的步骤包括分别收集 pH不超过5.5的洗脱液和pH超过5.5的洗脱液。

在上文提供的方法的一个实施方案中，所述分别收集所述洗脱液 的所述前导部分和所述洗脱液的所述滞后部分的步骤包括分别收集 pH不超过5.0的洗脱液和pH超过5.0的洗脱液。

在上文提供的方法的一个实施方案中，所述分别收集所述洗脱液 的所述前导部分和所述洗脱液的所述滞后部分的步骤包括监测所述 洗脱液的所述pH。

在上文提供的方法的一个实施方案中，收集所述洗脱液的所述前 导部分的步骤包括以下子步骤：(i)监测所述洗脱液在280nm下的光 学密度(OD₂₈₀)；(ii)当所述洗脱液OD280上升超过至少50mAU的 第一阈值OD₂₈₀时，开始收集；以及(iii)当所述洗脱液OD280下降 低于不小于500mAU的第二阈值OD₂₈₀时，终止收集。在一个特定 实施方案中，第二阈值OD₂₈₀不小于1AU。在另一个特定实施方案 中，第二阈值OD₂₈₀不小于2AU。

在上文提供的方法的一个实施方案中，所述洗涤缓冲液的pH介 于5.0与6.0之间。在上文提供的方法的另一个实施方案中，所述洗 涤缓冲液的pH为5.5±0.2。

在上文提供的方法的一个实施方案中，步骤(b)中与所述阳离子 交换树脂的FXI和/或FXIa的小于50%存在于步骤(d)中所收集的所 述洗脱液的所述前导部分中。

在上文提供的方法的一个实施方案中，步骤(b)中与所述阳离子 交换树脂的FXI和/或FXIa的小于25%存在于步骤(d)中所收集的所 述洗脱液的所述前导部分中。

在上文提供的方法的一个实施方案中，步骤(b)中与所述阳离子 交换树脂的FXI和/或FXIa的小于10%存在于步骤(d)中所收集的所 述洗脱液的所述前导部分中。

在上文提供的方法的一个实施方案中，FXI和/或FXIa的量是通 过使用FXIa特异性底物执行酰胺分解活性分析来测定。

在上文提供的方法的一个实施方案中，步骤(a)中所提供的所述血 浆来源免疫球蛋白组合物为混悬血浆洗脱份沉淀物，其选自由以下组 成的组：洗脱份I沉淀物、洗脱份I+II+III沉淀物、洗脱份II+III沉 淀物、洗脱份IV-1、Kistler-Nitschmann沉淀物A、Kistler-Nitschmann 沉淀物B以及其被修饰沉淀物。

在上文提供的方法的一个实施方案中，步骤(a)中所提供的所述血 浆来源免疫球蛋白组合物为混悬洗脱份II沉淀物。

在一个方面中，本发明提供一种用于降低血浆来源免疫球蛋白组 合物的抗补体活性(ACA)的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供 包含IgG免疫球蛋白和第一量的ACA的血浆来源免疫球蛋白组合 物；(b)使所述血浆来源免疫球蛋白组合物与安置在色谱柱中的阳离 子交换树脂在包括pH不超过6.0并且电导率不超过11mS/cm的第一 溶液条件下接触，以便使IgG免疫球蛋白和第一量的ACA的至少一 部分与所述阳离子交换树脂结合；(c)通过使所述阳离子交换树脂与包 括pH为至少7.5并且电导率为至少15mS/cm的洗脱缓冲液接触来形 成包含前导部分和滞后部分的洗脱液从而使IgG免疫球蛋白从阳离 子交换树脂中洗脱；以及(d)分别收集所述洗脱液的所述前导部分和 所述洗脱液的所述滞后部分，其中所述洗脱液的所述前导部分占不超 过80%洗脱液。

在上述方法的一个实施方案中，所述洗脱缓冲液包括至少20 mS/cm的电导率。在上述方法的另一个实施方案中，所述洗脱缓冲液 包括至少22mS/cm的电导率。在上述方法的另一个实施方案中，所 述洗脱缓冲液包括至少25mS/cm的电导率。

在上述方法的一个实施方案中，所述方法在步骤(c)中使所述免疫 球蛋白从阳离子交换树脂洗脱之前进一步包括以下步骤：用pH不超 过6.0并且电导率小于11mS/cm的洗涤缓冲液洗涤结合有所述免疫 球蛋白和ACA的所述阳离子交换树脂。

在上述方法的一个实施方案中，所述阳离子交换树脂为弱阳离子 交换树脂。在上述方法的一个特定实施方案中，所述弱阳离子交换树 脂为羧甲基阳离子交换树脂。

在上述方法的一个实施方案中，所述洗脱缓冲液的pH值介于7.5 与8.5之间。在上述方法的另一个实施方案中，所述洗脱缓冲液的pH 值为8.0±0.2。

在上述方法的一个实施方案中，所述洗脱缓冲液包含介于200 mM与300mM之间的氯化钠。在上述方法的另一个实施方案中，所 述洗脱缓冲液包含介于240mM与260mM之间的氯化钠。

在上述方法的一个实施方案中，所述洗脱缓冲液包含100mM与 300mM之间的甘氨酸。在上述方法的另一个实施方案中，所述洗脱 缓冲液包含175mM与225mM之间的甘氨酸。

在上述方法的一个实施方案中，所述洗脱液的所述前导部分由不 超过70%的洗脱液组成。

在上述方法的一个实施方案中，所述分别收集所述洗脱液的所述 前导部分和所述洗脱液的所述滞后部分的步骤包括分别收集pH不超 过7.0的洗脱液和pH超过7.0的洗脱液。

在上述方法的一个实施方案中，所述分别收集所述洗脱液的所述 前导部分和所述洗脱液的所述滞后部分的步骤包括分别收集pH不超 过6.5的洗脱液和pH超过6.5的洗脱液。

在上述方法的一个实施方案中，所述分别收集所述洗脱液的所述 前导部分和所述洗脱液的所述滞后部分的步骤包括分别收集pH不超 过6.0的洗脱液和pH超过6.0的洗脱液。

在上述方法的一个实施方案中，所述分别收集所述洗脱液的所述 前导部分和所述洗脱液的所述滞后部分的步骤包括分别收集pH不超 过5.5的洗脱液和pH超过5.5的洗脱液。

在上述方法的一个实施方案中，所述分别收集所述洗脱液的所述 前导部分和所述洗脱液的所述滞后部分的步骤包括分别收集pH不超 过5.0的洗脱液和pH超过5.0的洗脱液。

在上述方法的一个实施方案中，所述分别收集所述洗脱液的所述 前导部分和所述洗脱液的所述滞后部分的步骤包括监测所述洗脱液 的所述pH。

在上述方法的一个实施方案中，所述收集所述洗脱液的所述前导 部分的步骤包括以下子步骤：(i)监测所述洗脱液在280nm下的光学 密度(OD280)；(ii)当洗脱液OD280上升超过至少50mAU的第一阈 值OD280时，开始收集；以及(iii)当洗脱液OD280下降低于不小于 500mAU的第二阈值OD280时，终止收集。

在上述方法的一个实施方案中，所述第二阈值OD280不小于1 AU。在上述方法的另一个实施方案中，所述第二阈值OD280不小于 2AU。

在上述方法的一个实施方案中，所述洗涤缓冲液的pH介于5.0 与6.0之间。在上述方法的另一个实施方案中，所述洗涤缓冲液的pH 为5.5±0.2。

在上述方法的一个实施方案中，步骤(d)中所收集的所述洗脱液 的所述前导部分中存在的相对于IgG免疫球蛋白浓度的ACA浓度低 于步骤(a)中所提供的所述血浆来源免疫球蛋白组合物中对IgG免疫 球蛋白浓度的ACA浓度。

在上述方法的一个实施方案中，步骤(d)中所收集的所述洗脱液 的所述前导部分中存在的相对于所述IgG免疫球蛋白浓度的所述 ACA浓度比步骤(a)中所提供的所述血浆来源免疫球蛋白组合物中相 对于所述IgG免疫球蛋白浓度的所述ACA浓度低至少25%。

在上述方法的一个实施方案中，步骤(d)中所收集的所述洗脱液 的所述前导部分中存在的相对于所述IgG免疫球蛋白浓度的所述 ACA浓度比步骤(a)中所提供的所述血浆来源免疫球蛋白组合物中相 对于所述IgG免疫球蛋白浓度的所述ACA浓度低至少50%。

在上述方法的一个实施方案中，步骤(d)中所收集的所述洗脱液 的所述前导部分中存在的相对于所述IgG免疫球蛋白浓度的所述 ACA浓度低于步骤(d)中所收集的所述洗脱液的所述滞后部分中相对 于IgG免疫球蛋白浓度的ACA浓度。

在上述方法的一个实施方案中，步骤(d)中所收集的所述洗脱液 的所述前导部分中存在的相对于所述IgG免疫球蛋白浓度的所述 ACA浓度小于步骤(d)中所收集的所述洗脱液的所述滞后部分中相对 于所述IgG免疫球蛋白浓度的所述ACA浓度的50%。

在上述方法的一个实施方案中，步骤(d)中所收集的所述洗脱液 的所述前导部分中存在的相对于所述IgG免疫球蛋白浓度的所述 ACA浓度小于步骤(d)中所收集的所述洗脱液的所述滞后部分中相对 于所述IgG免疫球蛋白浓度的所述ACA浓度的25%。

在上述方法的一个实施方案中，步骤(a)中所提供的所述血浆来源 免疫球蛋白组合物为混悬血浆洗脱份沉淀物，其选自由以下组成的 组：洗脱份I沉淀物、洗脱份I+II+III沉淀物、洗脱份II+III沉淀物、 洗脱份IV-1、Kistler-Nitschmann沉淀物A、Kistler-Nitschmann沉淀 物B以及其被修饰沉淀物。

在上述方法的一个实施方案中，步骤(a)中所提供的所述血浆来源 免疫球蛋白组合物为混悬洗脱份II沉淀物。

附图简述

图1.展示实施例1中所述的CM琼脂糖快速流动(ff)色谱步骤的 色谱图。图线编号1展示UV吸光度，图线编号2展示pH，并且图 线编号3展示柱出口处的流出液的电导率。280纳米下的光学密度指 示，两种洗脱份在蛋白质从CM琼脂糖ff柱洗脱期间的部分分离。 在洗脱期间，柱出口处的pH在UV吸光度刚开始再上升之前开始上 升。这时，两种洗脱份分离，如色谱图中以F4和F5(洗脱份4和洗 脱份5)所示，以下称为E1和E2。

图2.展示实施例2中所述的CM琼脂糖ff操作的色谱图。示出 的是在IgG洗脱份从CM琼脂糖ff(起始物质：科恩洗脱份II糊剂途 径II(Cohn fraction II paste pathway II)；P24701IV；吸附步骤：FIX； FVII；AT III)洗脱期间pH和OD280的进程。

图3.展示实施例11中所述的CM琼脂糖快速流动(ff)色谱步骤的 色谱图。图线编号1展示UV吸光度，图线编号3展示pH，并且图 线编号2展示柱出口处的流出液的电导率。

图4.展示实施例12中所述的CM琼脂糖快速流动(ff)色谱步骤的 色谱图。图线编号1展示UV吸光度，图线编号3展示pH值，并且 图线编号2展示柱出口处的流出液的电导率。

图5.展示实施例13中所述的CM琼脂糖快速流动(ff)色谱步骤的 色谱图。图线编号1展示UV吸光度，图线编号3展示pH，并且图 线编号2展示柱出口处的流出液的电导率。

发明详述

I.引言

鉴于治疗性血浆来源静脉内免疫球蛋白组合物的广泛使用，因此 确保这些组合物的安全性至关重要。对免疫球蛋白组合物的酰胺分解 性水平与施用血浆来源免疫球蛋白的患者中血栓栓塞事件发生率关 联的担忧，突显了对于在免疫球蛋白制造期间有效减少丝氨酸蛋白酶 (例如FXIa及FXIIa)和丝氨酸蛋白酶酶原(例如FXI及FXII)的方法的 需要。

本发明至少部分基于以下惊人发现：通过仅收集阳离子交换洗脱 液的前导部分便可除去免疫球蛋白组合物中的大量酰胺分解活性(例 如FXI和/或FXIa)和/或抗补体活性(ACA)。因此，本文提供在血浆来 源蛋白质组合物制造期间降低丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶酶原的 浓度的方法。

在一个方面中，本发明是基于以下发现：在从阳离子交换树脂单 步洗脱期间，IgG免疫球蛋白从树脂释放，随后洗脱酰胺分解活性(例 如至少由FXI和/或FXIa引起)和/或ACA的大量洗脱份。明确来说， 已发现，在结合有IgG免疫球蛋白和促成酰胺分解活性的蛋白质的阳 离子交换树脂与pH值大于至少7.0的洗脱缓冲液接触之后，从管柱 回收的初始洗脱液就具有低pH(例如低于5.0的pH)。一段时间以后， 从管柱回收的洗脱液的pH移位到7.0以上。已惊人地发现，具有低 pH的初始洗脱液含有低水平的酰胺分解活性、低含量的FXI和/或 FXIa和/或ACA，而pH移位后回收的洗脱液含有显著更高含量的酰 胺分解活性、显著更高含量的FXI和/或FXIa和/或ACA。

因此，在一个方面中，本发明是基于一种如下从IgG免疫球蛋白 组合物中分离大部分酰胺分解活性(例如因子XI和/或因子XIa)和/或 ACA的方法：使IgG免疫球蛋白、酰胺分解活性和/或ACA与阳离 子交换树脂结合，以单步洗脱法洗脱IgG免疫球蛋白、酰胺分解活性 和/或ACA，以及收集洗脱液的前导部分，所述前导部分的特征为与 洗脱液的滞后部分分离后的高IgG产率、低酰胺分解活性和/或低 ACA含量，所述滞后部分的特征为低IgG产率、高酰胺分解活性和/ 或高ACA含量。

本发明方法的优点尤其为提供(1)通过阳离子交换色谱，以单步 洗脱法从IgG免疫球蛋白组合物除去酰胺分解活性的简单方法；(2) 基于监测洗脱液的pH来快速鉴别具有高酰胺分解活性(即高FXI和/ 或FXIa含量)的IgG免疫球蛋白阳离子交换洗脱液的洗脱份的简单方 法；(3)从IgG免疫球蛋白组合物除去酰胺分解活性而不受装载于阳 离子交换树脂上的蛋白质浓度影响、同时允许针对大规模制造工艺按 比例简单扩大的方法；(4)允许基于pH监测来快速测定用于进一步处 理的IgG免疫球蛋白阳离子交换洗脱份的方法；(5)使酰胺分解活性 (例如FXI和/或FXIa含量)显著降低而IgG免疫球蛋白产率损失最小 的方法；(6)制造具有较低IgG聚集物浓度、较低PKA活性、较低酰 胺分解活性(如利用显色底物(包括(但不限于)底物PL-1)所测量)、较 高IgG单体浓度和较理想IgG亚类分布的IgG免疫球蛋白组合物的 方法；(7)允许基于色谱步骤的洗脱体积来快速确定用于进一步处理 的阳离子交换IgG免疫球蛋白洗脱份的方法；(8)允许基于特定洗脱 份的蛋白质吸光度来快速确定用于进一步处理的IgG免疫球蛋白阳 离子交换洗脱份的方法；(9)能够在大规模制造工艺中使用本发明的 有利特征；(10)富集用于鉴别和定量的酰胺分解活性；(11)通过阳离 子交换色谱，以单步洗脱法从IgG免疫球蛋白组合物除去抗补体活性 (ACA)的简单方法；(12)基于监测洗脱液的pH来快速鉴别具有高抗 补体活性(ACA)的IgG免疫球蛋白阳离子交换洗脱液的洗脱份的简单 方法；(13)从IgG免疫球蛋白组合物除去抗补体活性(ACA)而不受装 载于阳离子交换树脂上的蛋白质浓度影响、同时允许针对大规模制造 工艺按比例简单扩大的方法；(14)使抗补体活性(ACA)显著降低而IgG 免疫球蛋白产率损失最小的方法；(15)制造具有较低IgG聚集物浓度、 较低抗补体活性(ACA)、较高IgG单体浓度和较理想IgG亚类分布的 IgG免疫球蛋白组合物的方法；以及(16)富集抗补体活性(ACA)用于 鉴别和定量。

II.定义

如本文所用，术语“静脉内IgG”或“IVIG”治疗通常是指向患 者静脉内、皮下或肌肉内施用IgG免疫球蛋白组合物以便治疗如免疫 缺陷症、发炎疾病和自体免疫疾病的多种病状的治疗方法。典型地， 从血浆汇集并制备IgG免疫球蛋白。可使用完整抗体或片段。IgG免 疫球蛋白可针对皮下施用以较高浓度(例如大于10%)配制，或针对肌 肉内施用加以配制。对于以针对特定抗原(例如Rho D因子、百日咳 毒素、破伤风毒素、肉毒杆菌毒素、狂犬病等)的平均效价更高的效 价制备的专门IgG制剂，这尤其常见。为便于论述，在本申请中，术 语“IVIG”还包括这些针对皮下或肌肉内施用配制的IgG组合物。

如本文所用，术语“酰胺分解活性”是指多肽催化另一多肽中的 至少一个肽键水解的能力。IgG免疫球蛋白组合物的酰胺分解活性特 征可通过使用各种显色底物进行分析来测定，这些显色底物对人血浆 中发现的蛋白酶具有不同特异性，包括(但不限于)：PL-1(广谱)、 S-2288(广谱)、S-2266(FXIa，腺性激肽释放酶)、S-2222(FXa，胰蛋 白酶)、S-2251(纤维蛋白溶酶)以及S-2302(激肽释放酶、FXIa及 FXIIa)。用于测定组合物的酰胺分解活性的方法在本领域中已众所周 知，例如如M.Etscheid等所述(Identification of kallikrein and FXIa as  impurities in therapeutic immunoglobulins:implications for the safety  and control of intravenous blood products,Vox Sang2011；所述文献的 公开内容以全文引用的方式明确并入本文中用于所有目的)。

如本文所用，术语“抗补体活性(anti-complement  activity/anticomplementary activity)”和“ACA”可互换使用并且是指 蛋白质组合物(例如IgG免疫球蛋白组合物)在补体分析中消耗潜在补 体的能力，例如大致上根据以下文献所述的方法的方法：“Public  Health Monograph”第74期；Standardized Diagnostic Complement  Fixation Method and Adaptation to Microtest,Washington,1965；以及 E.A.Kabat及M.Mayer,Experimental Immunochemistry;第二版, Thomas Springfield1961，所述文献的内容以全文引用的方式明确并 入本文中用于所有目的。补体活性的典型单位为以本文所述的补体活 性使总共5x10⁸个最佳致敏红细胞中的2.5x10⁸个发生溶解的补体的 量。

在一个实施方案中，使用抗体致敏羊红细胞标准化混悬液测量 ACA，抗体致敏羊红细胞标准化混悬液与充当补体来源的豚鼠血清的 不同稀释液一起孵育。对溶血程度进行分光光度测量。举例来说，为 测定免疫球蛋白产品的抗补体活性，制备含有不同量的免疫球蛋白产 品和每毫升2C'H₅₀单位的豚鼠血清的测试溶液。在一个特定实施方 案中，通过将限定量的测试物质(例如10mg IgG免疫球蛋白)与限定 量的豚鼠补体(例如20C'H₅₀)一起孵育来测量抗补体活性并滴定剩余 补体。抗补体活性表示为相对于补体对照物(视为100%)的补体消耗 百分比。在一个实施方案中，根据以下文献中所述的标准来测量 ACA：European Pharmacopoeia:Human normal immunoglobulin for  intravenous administration.European Pharmacopoeia6.3,专论2.6.17, 4166-4168.Council of Europe，Strasbourg Cedex,France,所述文献的 内容以全文引用的方式明确并入本文中用于所有目的。

降低意图用于静脉内施用的组合物的抗补体活性的方法描述于 以下文献中(Schultz,H.E.及Schwick,G.,Dtsch.med.Wochenschrift87 (1962),1643；Barandun,S.等,Vox Sang.28(1957),157；Barandun,S. 等,Vox Sang.7(1962),187；以及Stephen,W.,Z.Klin.Chem.Klin. Biochem.7(1969),282，其内容以全文引用的方式明确并入本文中用 于所有目的)。

如本文所用，“冷贫血浆(cryo-poor plasma)”是指血浆或汇集的 血浆在接近冷冻的温度(例如低于约10℃的温度)下冷沉淀(低温沉淀) 之后所形成的上清液。在本发明的上下文中，血浆可互换地指代回收 的血浆(即已与全血活体外分离的血浆)或源血浆(即经由血浆清除术 收集的血浆)。冷沉淀通常通过例如将先前经冷冻的汇集血浆解冻来 执行，先前经冷冻的汇集血浆出于安全与质量考虑已加以分析，但也 可使用新鲜血浆。解冻典型地在不高于6℃的温度下进行。冷冻血浆 在低温下完全解冻之后，在冷却下(例如≤6℃)执行离心，以从液体上 清液中分离固体冷沉淀物。或者，可通过过滤而非离心来执行分离步 骤。

如本文所用，“科恩池(Cohn pool)”是指用于分离血浆样品或血 浆样品池的起始物质。科恩池包括可能已或可能尚未经受预处理步骤 的全血浆、冷贫血浆样品和冷贫血浆样品池。在某些实施方案中，科 恩池为已在预处理步骤(例如吸附于固相上(例如氢氧化铝、精细粉碎 的二氧化硅等))或色谱步骤(例如离子交换或肝素亲和色谱)中除去一 种或多种血液因子的冷贫血浆样品。可从冷贫血浆样品中分离各种血 液因子，包括(但不限于)因子XIII抑制剂旁路活性(FEIBA)、因子IX 复合物、因子VII浓缩物或抗凝血酶III复合物，从而形成科恩池。

如本文所用，术语“洗脱液的前导部分”是指免疫球蛋白组合物 从阳离子交换树脂洗脱的第一洗脱份，所述洗脱份的特征为免疫球蛋 白产率高和酰胺分解活性低于洗脱之前结合至树脂的总酰胺分解活 性。洗脱液的前导部分为洗脱液从阳离子交换柱释放的第一洗脱份， 其出现先于免疫球蛋白组合物的第二洗脱份(称为“洗脱液的滞后部 分”)的释放(即洗脱)。洗脱液的滞后部分仅含有少量免疫球蛋白(典 型地不超过结合至管柱的免疫球蛋白的25%，优选不超过结合至管柱 的免疫球蛋白的10%)，并且特征为酰胺分解活性浓度高于洗脱液的 前导部分。在不同实施方案中，洗脱液的前导部分和滞后部分可由不 同特征定义，包括(但不限于)洗脱液的pH、洗脱液的蛋白质产率(例 如表示为与树脂结合的蛋白质百分比)、蛋白质浓度(例如依据光学密 度所测定)、洗脱液体积和其类似特征。

如本文所用，术语“超滤(UF)”涵盖流体静压力逆着半透膜压迫 液体的多种膜滤方法。混悬固体和高分子量溶质滞留，而水和低分子 量溶质穿过薄膜。这种分离方法常用于纯化和浓缩高分子(10³-10⁶Da) 溶液，尤其是蛋白质溶液。多种超滤膜可供使用，这取决于其滞留的 分子大小。超滤典型地以1kDa与1000kDa之间的孔尺寸的膜和0.01 巴与10巴之间的操作压力为特征，并且特别适用于将蛋白质从小分 子(如糖和盐)中分离。

如本文所用，术语“渗滤”是用与超滤相同的膜来执行，并且可 以切向流过滤或死端过滤模式操作。在渗滤期间，向再循环槽中引入 缓冲液，同时从单元操作除去滤液。在产物(例如IgG免疫球蛋白)存 在于滞留物中的过程中，渗滤可将产物池中的组分洗入滤液中，从而 进行缓冲液交换并且降低不需要物质的浓度。

如本文所用，术语“清洁剂”在本申请中可与术语“界面活性剂” 或“表面活性剂”互换使用。界面活性剂典型地为含有疏水基(“尾”) 与亲水基(“头”)的两亲性有机化合物，疏水基与亲水基使得界面活 性剂可溶于有机溶剂与水中。界面活性剂可依据其头部存在的形式上 带电荷的基团分类。非离子型界面活性剂的头部无带电荷基团，而离 子型界面活性剂的头部携带净电荷。两性离子型界面活性剂的头部具 有两个带相反带电基团。常见界面活性剂的一些实例包括：阴离子型 (根据硫酸根、磺酸根或羧酸根阴离子)：全氟辛酸盐(PFOA或PFO)、 全氟辛烷磺酸盐(PFOS)、十二烷基硫酸钠(SDS)、月桂基硫酸铵以及 其它烷基硫酸盐、月桂醇醚硫酸钠(又称为月桂基醚硫酸钠或SLES)、 烷基苯磺酸盐；阳离子型(根据四级铵阳离子)：溴化十六烷基三甲基 铵(CTAB)(又称为十六烷基三甲基溴化铵)以及其它烷基三甲基铵盐、 氯化十六烷基吡锭(CPC)、聚乙氧基化牛油胺(POEA)、氯化苯甲烃铵 (BAC)、苄索氯铵(BZT)；长链脂肪酸及其盐：包括辛酸盐、辛酸、 庚酸盐、己酸、庚酸、壬酸、癸酸及其类似物；两性离子型(两性)： 十二基甜菜碱；椰油酰胺基丙基甜菜碱；椰油酰胺两性基甘氨酸盐； 非离子型：烷基聚(氧化乙烯)、烷基酚聚(氧化乙烯)、聚(氧化乙烯) 与聚(氧化丙烯)的共聚物(商业上被称为泊洛沙姆(Poloxamers)或泊洛 沙胺(Poloxamines))、烷基聚葡糖苷(包括辛基葡糖苷、癸基麦芽糖苷)、 脂肪醇(例如鲸蜡醇和油醇)、椰油酰胺MEA、椰油酰胺DEA、聚山 梨醇酯(吐温(Tween)20、吐温80等)、曲通清洁剂(Triton detergents) 和氧化十二烷基二甲基胺。

如本申请中所使用，术语“喷雾”是指使液体物质以液体物质的 雾滴或薄雾形式递送至系统内的手段，例如在醇法沉淀步骤期间，如 修改的科恩分级分离I或II+III沉淀步骤。喷雾可由任何加压装置完 成，如容器(例如喷雾瓶)，其具有喷头或喷嘴并且可手动或自动操作 以便从液体产生细雾。典型地，执行喷雾的同时，连续搅拌或以其它 方式混合接收液体物质的系统，以确保液体快速并均匀分布于系统内 部。

“治疗有效量或剂量”或“足量/有效量或剂量”意指施用其而 产生效果的剂量。精确剂量将取决于治疗目的，并且可由本领域技术 人员利用已知技术确定(参见例如Lieberman,Pharmaceutical Dosage  Forms(第1-3卷,1992)；Lloyd,The Art,Science and Technology of  Pharmaceutical Compounding(1999)；Pickar,Dosage Calculations (1999)；和Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第20版, 2003,Gennaro编著,Lippincott,Williams&Wilkins)。

III.降低酰胺分解活性

在一个方面中，本发明提供降低血浆来源IgG免疫球蛋白组合物 的酰胺分解活性(例如通过降低FXI/FXIa和/或FXII/FXIIa含量)的色 谱法。同样，本发明还提供根据本文提供的方法制备的含有低水平酰 胺分解活性(例如低含量的FXI/FXIa和/或FXII/FXIIa)的血浆来源IgG 免疫球蛋白组合物。有利的是，本文所述方法提供安全特征改善的血 浆来源IgG免疫球蛋白组合物。明确来说，这些方法所提供的组合物 引起非所需血栓栓塞事件的可能性低于目前制造的IgG免疫球蛋白 组合物。

A.分级分离方法

本发明部分地基于以下发现：存在于血浆来源免疫球蛋白组合物 中的酰胺分解活性大部分在由一步洗脱产生的洗脱液的滞后部分中 从阳离子交换树脂洗脱，而洗脱份中所含的免疫球蛋白大部分在所述 洗脱液的前导部分中洗脱。因此，通过分别收集洗脱液的前导部分和 洗脱液的滞后部分，可显著降低所得免疫球蛋白制剂的酰胺分解活 性。明确来说，本文已证实在根据本文提供的方法制备的免疫球蛋白 组合物中，因子XIa含量和因此与因子XIa含量有关的酰胺分解活性 显著降低。

因此，在一个实施方案中，本发明提供一种降低血浆来源免疫球 蛋白组合物中的酰胺分解活性的量的方法，所述方法包括以下步骤： (a)使IgG免疫球蛋白和酰胺分解活性(即具有酰胺分解活性的蛋白 质污染物)结合于阳离子交换树脂上；(b)任选地用洗涤缓冲液洗涤结 合有蛋白质的阳离子交换树脂以除去松散缔合的污染物；(c)对IgG 免疫球蛋白和酰胺分解活性执行单步洗脱；以及(d)分别收集洗脱液 的前导部分和洗脱液的滞后部分，其中洗脱液的前导部分包含酰胺分 解活性的量低于起始组合物的IgG免疫球蛋白组合物，并且洗脱液的 滞后部分含有高浓度的酰胺分解活性。在一个特定实施方案中，酰胺 分解活性为存在于组合物中的因子XIa活性。在一个优选实施方案 中，阳离子交换树脂为弱阳离子交换树脂。在一个特定实施方案中， 弱阳离子交换树脂为羧甲基(CM)树脂。

在一个特定实施方案中，本发明提供一种降低血浆来源免疫球蛋 白组合物中的因子XI(FXI)和/或因子XIa(FXIa)的量的方法，所述方 法包括以下步骤：(a)使包含IgG免疫球蛋白和FXI和/或FXIa的血 浆来源免疫球蛋白组合物与安置在色谱柱中的阳离子交换树脂在包 括pH不超过6.0并且电导率不超过11mS/cm的第一溶液条件下接 触，以便使免疫球蛋白和至少一部分FXI和/或FXIa与阳离子交换树 脂结合；(b)通过使阳离子交换树脂与包括pH为至少7.5并且电导率 为至少15mS/cm的洗脱缓冲液接触来形成洗脱液从而使免疫球蛋白 从阳离子交换树脂洗脱；以及(c)分别收集洗脱液的前导部分和洗脱液 的滞后部分，其中洗脱液的前导部分包含酰胺分解活性的量低于起始 组合物的IgG免疫球蛋白组合物，并且洗脱液的滞后部分含有高浓度 的酰胺分解活性。在另一个特定实施方案中，洗脱缓冲液的电导率为 至少20mS/cm。在又一个特定实施方案中，洗脱缓冲液的电导率为 至少22mS/cm。在又一个特定实施方案中，洗脱缓冲液的电导率为 至少25mS/cm。在一个优选实施方案中，阳离子交换树脂为弱阳离 子交换树脂。在一个特定实施方案中，弱阳离子交换树脂为羧甲基 (CM)树脂。

在一个特定实施方案中，所述方法包括以下步骤：(a)使包含IgG 免疫球蛋白和FXI和/或FXIa的血浆来源免疫球蛋白组合物与安置在 色谱柱中的阳离子交换树脂在包括pH介于4.8与5.6之间并且电导 率不超过11mS/cm的第一溶液条件下接触，以便使免疫球蛋白和至 少一部分FXI和/或FXIa与阳离子交换树脂结合；(b)通过使阳离子交 换树脂与包括pH为至少7.5并且电导率为至少15mS/cm的洗脱缓冲 液接触来形成洗脱液从而使免疫球蛋白从阳离子交换树脂洗脱；以及 (c)分别收集洗脱液的前导部分和洗脱液的滞后部分，其中洗脱液的前 导部分包含酰胺分解活性的量低于起始组合物的IgG免疫球蛋白组 合物，并且洗脱液的滞后部分含有高浓度的酰胺分解活性。在一个特 定实施方案中，第一溶液条件的pH为5.2±0.3。在另一个特定实施方 案中，第一溶液条件的pH为5.2±0.2。在另一个特定实施方案中，第 一溶液条件的pH为5.2±0.1。在又一个特定实施方案中，第一溶液条 件的pH为5.2。在其它实施方案中，第一溶液条件的pH为4.8、4.9、 5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0。在另一个 特定实施方案中，洗脱缓冲液的电导率为至少20mS/cm。在又一个 特定实施方案中，洗脱缓冲液的电导率为至少22mS/cm。在又一个 特定实施方案中，洗脱缓冲液的电导率为至少25mS/cm。在一个优 选实施方案中，阳离子交换树脂为弱阳离子交换树脂。在一个特定实 施方案中，弱阳离子交换树脂为羧甲基(CM)树脂。

在一个特定实施方案中，所述方法包括以下步骤：(a)使包含IgG 免疫球蛋白和FXI和/或FXIa的血浆来源免疫球蛋白组合物与安置在 色谱柱中的阳离子交换树脂在包括pH不超过6.0并且电导率不超过 11mS/cm的第一溶液条件下接触，以便使免疫球蛋白和至少一部分 FXI和/或FXIa与阳离子交换树脂结合；(b)用具有足够低以使免疫球 蛋白不能从树脂洗脱的电导率和介于5.1与5.9之间的pH的缓冲液 洗涤结合有免疫球蛋白和FXI和/或FXIa的树脂；(c)通过使阳离子交 换树脂与包括pH为至少7.5并且电导率为至少15mS/cm的洗脱缓冲 液接触来形成洗脱液从而使免疫球蛋白从阳离子交换树脂洗脱；以及 (d)分别收集洗脱液的前导部分和洗脱液的滞后部分，其中洗脱液的 前导部分包含酰胺分解活性的量低于起始组合物的IgG免疫球蛋白 组合物，并且洗脱液的滞后部分含有高浓度的酰胺分解活性。在一个 特定实施方案中，洗涤缓冲液的pH为5.5±0.3。在另一个特定实施方 案中，洗涤缓冲液的pH为5.5±0.2。在另一个特定实施方案中，洗涤 缓冲液的pH为5.5±0.1。在另一个特定实施方案中，洗涤缓冲液的 pH为5.5。在其它实施方案中，洗涤缓冲液的pH为5.0、5.1、5.2、 5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0。在另一个特定实施方案中， 洗脱缓冲液的电导率为至少20mS/cm。在又一个特定实施方案中， 洗脱缓冲液的电导率为至少22mS/cm。在又一个特定实施方案中， 洗脱缓冲液的电导率为至少25mS/cm。在一个优选实施方案中，阳 离子交换树脂为弱阳离子交换树脂。在一个特定实施方案中，弱阳离 子交换树脂为羧甲基(CM)树脂。

在一个特定实施方案中，所述方法包括以下步骤：(a)使包含IgG 免疫球蛋白和FXI和/或FXIa的血浆来源免疫球蛋白组合物与安置在 色谱柱中的阳离子交换树脂在包括pH不超过6.0并且电导率不超过 11mS/cm的第一溶液条件下接触，以便使免疫球蛋白和至少一部分 FXI和/或FXIa与阳离子交换树脂结合；(b)通过使阳离子交换树脂与 包括pH为7.8±0.4并且电导率为至少20mS/cm的洗脱缓冲液接触来 形成洗脱液从而使免疫球蛋白从阳离子交换树脂洗脱；以及(c)分别收 集洗脱液的前导部分和洗脱液的滞后部分，其中洗脱液的前导部分包 含酰胺分解活性的量低于起始组合物的IgG免疫球蛋白组合物，并且 洗脱液的滞后部分含有高浓度的酰胺分解活性。在一个特定实施方案 中，洗脱缓冲液的pH为7.8±0.3。在另一个特定实施方案中，洗脱缓 冲液的pH为7.8±0.2。在另一个特定实施方案中，洗脱缓冲液的pH 为7.8±0.1。在另一个特定实施方案中，洗脱缓冲液的pH为7.8。在 其它实施方案中，洗脱缓冲液的pH为7.0、7.1、7.2、7.36、7.4、7.5、 7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4或8.5。在又一个特定实 施方案中，洗脱缓冲液的电导率为至少22mS/cm。在又一个特定实 施方案中，洗脱缓冲液的电导率为至少25mS/cm。在一个优选实施 方案中，阳离子交换树脂为弱阳离子交换树脂。在一个特定实施方案 中，弱阳离子交换树脂为羧甲基(CM)树脂。

一般而言，用于本文提供的方法的起始物质包括包含IgG免疫球 蛋白和酰胺分解活性的任何血浆洗脱份或组合物。因而，在一个实施 方案中，根据本领域中已知的任一种纯化方案对血浆进行部分或完全 分级分离。在一个特定实施方案中，将血浆分级分离来产生洗脱份I 沉淀物、洗脱份II沉淀物、洗脱份I+II+III沉淀物、洗脱份II+III沉 淀物、洗脱份IV-1、Kistler-Nitschmann沉淀物A、Kistler-Nitschmann 沉淀物B、或其被修饰沉淀物，其可用作本文提供的方法的起始物质。

在一个优选实施方案中，通过一个或多个乙醇沉淀步骤分级分离 血浆。乙醇沉淀步骤可用于使所要免疫球蛋白从溶液沉淀，同时使至 少一种非免疫球蛋白滞留于上清液中，或使至少一种非免疫球蛋白从 溶液沉淀，同时使所需免疫球蛋白滞留于上清液中。以这种方式分级 分离免疫球蛋白的方法在本领域中是众所周知的。示例性乙醇沉淀物 包括(但不限于)洗脱份I沉淀物、洗脱份I+II+III沉淀物、洗脱份II+III 沉淀物、洗脱份IV-1、Kistler-Nitschmann沉淀物A、Kistler-Nitschmann 沉淀物B以及其被修饰沉淀物。在一个特别优选实施方案中，存在 于冷贫血浆中的免疫球蛋白通过四步乙醇法富集，所述四步乙醇法包 括洗脱份I+II+III沉淀步骤、A沉淀步骤、B沉淀步骤以及洗脱份II 沉淀步骤。

在一个实施方案中，用于本文提供的降低酰胺分解活性的方法的 起始物质是通过乙醇分级分离汇集的人血浆(例如冷贫血浆)来制备。 在一个特定实施方案中，乙醇分级分离包括冷贫血浆的洗脱份 I+II+III沉淀、混悬洗脱份I+II+III沉淀物的洗脱份A沉淀、混悬洗 脱份A沉淀物的洗脱份B沉淀以及洗脱份A上清液的洗脱份II沉淀， 如下文所述。在另一个特定实施方案中，乙醇分级分离包括冷贫血浆 的洗脱份I沉淀、洗脱份I上清液的洗脱份II+III沉淀以及混悬洗脱 份II+III沉淀物的洗脱份II沉淀。

如本文所证明，本文提供的方法在应用于大规模制造程序时保留 了其有利特征。就制备IgG免疫球蛋白组合物而言，大规模制造是指 从至少100L汇集血浆(例如冷贫血浆)起始物质中富集免疫球蛋白的 工艺。一般而言，大规模免疫球蛋白制造工艺每批次可分级分离100 L与20,000L之间的汇集血浆。在某些实施方案中，大规模IgG免疫 球蛋白制造工艺是指分级分离至少100L汇集血浆(例如冷贫血浆)。 在另一个实施方案中，大规模IgG免疫球蛋白制造工艺是指分级分离 至少500L汇集血浆(例如冷贫血浆)。在另一个实施方案中，大规模 IgG免疫球蛋白制造工艺是指分级分离至少1,000L汇集血浆(例如冷 贫血浆)。在另一个实施方案中，大规模IgG免疫球蛋白制造工艺是 指分级分离至少5,000L汇集血浆(例如冷贫血浆)。在又一个实施方 案中，大规模IgG免疫球蛋白制造工艺是指分级分离至少10,000L 汇集血浆(例如冷贫血浆)。

一般而言，涵盖包含上述装载条件、洗涤条件与洗脱条件的所有 组合的方法。此外，涵盖包含特定色谱条件的所有组合的方法以及用 于定义及收集洗脱液的前导部分的所有可能方案，如下文所述。

1.阳离子交换洗脱液的前导部分和滞后部分

在一个方面中，本发明提供通过收集阳离子交换洗脱液的前导部 分来降低酰胺分解活性、尤其是存在于免疫球蛋白制剂中的FXIa杂 质所引起的酰胺分解活性的方法。有利的是，本文已证实通过阳离子 交换色谱步骤的单步洗脱所形成的洗脱液的前导部分含有大部分所 要免疫球蛋白内容物，而洗脱液的滞后部分含有大部分非所需酰胺分 解活性。因为洗脱的免疫球蛋白和酰胺分解活性无法完全分离，所以 必须确定洗脱液的前导部分与滞后部分之间的区分。有两个主要考虑 因素可决定何时作出这种区分，即：(i)取决于如何定义洗脱液的前导 部分和滞后部分，前导部分中将回收较多或较少的酰胺分解活性，即 当洗脱液的前导部分被定义为总洗脱液的较小部分时，可从免疫球蛋 白内容物分离较大部分的酰胺分解活性，反之亦然；以及(ii)取决于 如何定义洗脱液的前导部分和滞后部分，前导部分中将存在较大或较 小的免疫球蛋白回收率，即当洗脱液的前导部分被定义为总洗脱液的 较小部分时，实现较低免疫球蛋白产率，反之亦然。

因此，本领域技术人员将根据其个别的需要，就在何处划分阳离 子交换洗脱液的前导部分与滞后部分之间的边界作出决定。举例来 说，当为了研究或专门治疗目的而准备小规模纯化时，本领域技术人 员可通过收集洗脱液的较小前导部分同时牺牲最终免疫球蛋白产率 来最佳化所述方法的分离能力。相比之下，当进行大规模制造(例如 处理超过500L冷贫血浆)时，机会成本(opportunity cost)可能要求收 集洗脱液的较大前导部分来提高免疫球蛋白回收率，但以组合物的酰 胺分解活性的较小降低为代价。

在不同实施方案中，洗脱液的前导部分和滞后部分可通过不同特 征定义，包括(但不限于)洗脱液的pH、洗脱液的蛋白质产率(例如表 示为与树脂结合的蛋白质百分比)、蛋白质浓度(例如由光学密度所测 定)、洗脱液体积以及其类似特征。

a.洗脱液的pH

如本文提供的实施例所证明，阳离子交换洗脱步骤开始的标志为 来自管柱的溶液的pH下降至低于5.0的pH，尽管洗脱缓冲液的pH (通常>7.0)高于管柱装载和洗涤步骤的pH(通常为5.0至6.0)。pH的 这种降低对应于具有低酰胺分解活性和因子XIa含量的IgG免疫球蛋 白组合物的洗脱(分别参见例如表4和表11)。在洗脱后期，来自管柱 的溶液的pH急剧上升至大于6.0至8.0。pH的这种移位与洗脱液的 酰胺分解活性和因子XIa含量的显著增加同时发生(分别参见例如表 4和表11)。因此，虽然一步洗脱是通过使用单一高pH洗脱缓冲液(通 常大于7.0)来执行，但洗脱特征类似于首先从管柱洗脱IgG免疫球蛋 白、随后洗脱伴随酰胺分解活性(例如因子XI和/或因子XIa)的两步 洗脱。因此，在某些实施方案中，洗脱液的前导部分和滞后部分是根 据洗脱液在柱出口处的pH来定义。

因此，在一个方面中，本发明提供一种降低血浆来源免疫球蛋白 组合物中的酰胺分解活性的量的方法，所述方法包括以下步骤：(a) 使IgG免疫球蛋白和酰胺分解活性(即具有酰胺分解活性的蛋白质污 染物)结合于阳离子交换树脂上；(b)任选地用洗涤缓冲液洗涤结合有 蛋白质的阳离子交换树脂以除去松散缔合的污染物；(c)对IgG免疫 球蛋白和酰胺分解活性执行单步洗脱；以及(d)分别收集洗脱液的前 导部分和洗脱液的滞后部分，其中洗脱液的前导部分由pH不超过7.0 的洗脱液部分组成。在一个特定实施方案中，洗脱液的前导部分由 pH不超过6.5的洗脱液部分组成。在另一个特定实施方案中，洗脱 液的前导部分由pH不超过6.0的洗脱液部分组成。在另一个特定实 施方案中，洗脱液的前导部分由pH不超过5.5的洗脱液部分组成。 在另一个特定实施方案中，洗脱液的前导部分由pH不超过5.0的洗 脱液部分组成。在其它实施方案中，洗脱液的前导部分由具有以下 pH的洗脱液部分组成：不超过7.0、6.9、6.8、6.7、6.6、6.5、6.4、 6.3、6.2、6.1、6.0、5.9、5.8、5.7、5.6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、 5.0或小于5.0。在一个优选实施方案中，阳离子交换树脂为弱阳离子 交换树脂。在一个特定实施方案中，弱阳离子交换树脂为羧甲基(CM) 树脂。

在一个特定实施方案中，本发明提供一种降低血浆来源免疫球蛋 白组合物中的因子XI(FXI)和/或因子XIa(FXIa)的量的方法，所述方 法包括以下步骤：(a)使包含IgG免疫球蛋白和FXI和/或FXIa的血浆 来源免疫球蛋白组合物与安置在色谱柱中的阳离子交换树脂在包括 pH不超过6.0并且电导率不超过11mS/cm的第一溶液条件下接触， 以便使免疫球蛋白和至少一部分FXI和/或FXIa与阳离子交换树脂结 合；(b)通过使阳离子交换树脂与包括pH为至少7.5并且电导率为至 少15mS/cm的洗脱缓冲液接触来形成洗脱液从而使免疫球蛋白从阳 离子交换树脂洗脱；以及(c)分别收集洗脱液的前导部分和洗脱液的滞 后部分，其中洗脱液的前导部分由pH不超过7.0的洗脱液部分组成。 在一个特定实施方案中，洗脱液的前导部分由pH不超过6.5的洗脱 液部分组成。在另一个特定实施方案中，洗脱液的前导部分由pH不 超过6.0的洗脱液部分组成。在另一个特定实施方案中，洗脱液的前 导部分由pH不超过5.5的洗脱液部分组成。在另一个特定实施方案 中，洗脱液的前导部分由pH不超过5.0的洗脱液部分组成。在其它 实施方案中，在另一个特定实施方案中，洗脱液的前导部分由具有以 下pH的洗脱液部分组成：不超过7.0、6.9、6.8、6.7、6.6、6.5、6.4、 6.3、6.2、6.1、6.0、5.9、5.8、5.7、5.6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、 5.0或小于5.0。在另一个特定实施方案中，洗脱缓冲液的电导率为至 少20mS/cm。在又一个特定实施方案中，洗脱缓冲液的电导率为至 少22mS/cm。在又一个特定实施方案中，洗脱缓冲液的电导率为至 少25mS/cm。在一个优选实施方案中，阳离子交换树脂为弱阳离子 交换树脂。在一个特定实施方案中，弱阳离子交换树脂为羧甲基(CM) 树脂。

b.洗脱液的吸光度

在又一个特别适合于大规模制造免疫球蛋白组合物的实施方案 中，洗脱液的前导部分和滞后部分是根据从阳离子交换柱洗脱的免疫 球蛋白浓度来定义。举例来说，在大规模制造期间，免疫球蛋白组合 物可以足够高的蛋白质负荷(例如每毫升树脂>80mg蛋白质)装载于 阳离子交换树脂上，使得洗脱液峰被高度浓缩。在这些情况下，洗脱 液的前导部分可定义为先于OD₂₈₀降至阈值以下洗脱的洗脱液的洗脱 份。以这种方式，可以大致相同产率将免疫球蛋白从一个制剂再生式 回收至下一个制剂中，不考虑制造轮次之间的微小差异。如实施例9 中所证明，将这个收集方案应用于大规模制造工艺可以高产率回收其 中TGA和酰胺分解活性含量显著降低的IgG免疫球蛋白组合物。

因此，在一个方面中，本发明提供一种降低血浆来源免疫球蛋白 组合物中的酰胺分解活性的量的方法，所述方法包括以下步骤：(a) 使IgG免疫球蛋白和酰胺分解活性(即具有酰胺分解活性的蛋白质污 染物)结合于阳离子交换树脂上；(b)任选地用洗涤缓冲液洗涤结合有 蛋白质的阳离子交换树脂以除去松散缔合的污染物；(c)对IgG免疫 球蛋白和酰胺分解活性执行单步洗脱；以及(d)分别收集洗脱液的前 导部分和洗脱液的滞后部分，其中洗脱液的前导部分由OD₂₈₀为至少 0.5AU的洗脱液部分组成。在一个特定实施方案中，洗脱液的前导 部分由OD₂₈₀为至少1.0AU的洗脱液部分组成。在另一个特定实施 方案中，洗脱液的前导部分由OD₂₈₀为至少1.5AU的洗脱液部分组 成。在另一个特定实施方案中，洗脱液的前导部分由OD₂₈₀为至少2.0 AU的洗脱液部分组成。在其它特定实施方案中，洗脱液的前导部分 由具有以下OD₂₈₀的洗脱液部分组成：至少0.1AU、0.2AU、0.3AU、 0.4AU、0.5AU、0.6AU、0.7AU、0.8AU、0.9AU、1.0AU、1.1AU、 1.2AU、1.3AU、1.4AU、1.5AU、1.6AU、1.7AU、1.8AU、1.9AU、 2.0AU或大于2.0AU。在一个优选实施方案中，阳离子交换树脂为 弱阳离子交换树脂。在一个特定实施方案中，弱阳离子交换树脂为羧 甲基(CM)树脂。

在一个特定实施方案中，本发明提供一种降低血浆来源免疫球蛋 白组合物中的因子XI(FXI)和/或因子XIa(FXIa)的量的方法，所述方 法包括以下步骤：(a)使包含IgG免疫球蛋白和FXI和/或FXIa的血浆 来源免疫球蛋白组合物与安置在色谱柱中的阳离子交换树脂在包括 pH不超过6.0并且电导率不超过11mS/cm的第一溶液条件下接触， 以便使免疫球蛋白和至少一部分FXI和/或FXIa与阳离子交换树脂结 合；(b)通过使阳离子交换树脂与包括pH为至少7.5并且电导率为至 少15mS/cm的洗脱缓冲液接触来形成洗脱液从而使免疫球蛋白从阳 离子交换树脂洗脱；以及(c)分别收集洗脱液的前导部分和洗脱液的滞 后部分，其中洗脱液的前导部分由OD₂₈₀为至少2.0AU的洗脱液部 分组成。在一个特定实施方案中，洗脱液的前导部分由OD₂₈₀为至少 1.5AU的洗脱液部分组成。在另一个特定实施方案中，洗脱液的前 导部分由OD₂₈₀为至少1.0AU的洗脱液部分组成。在另一个特定实 施方案中，洗脱液的前导部分由OD₂₈₀为至少0.5AU的洗脱液部分 组成。在其它特定实施方案中，洗脱液的前导部分由具有以下OD₂₈₀的洗脱液部分组成：至少0.1AU、0.2AU、0.3AU、0.4AU、0.5AU、 0.6AU、0.7AU、0.8AU、0.9AU、1.0AU、1.1AU、1.2AU、1.3AU、 1.4AU、1.5AU、1.6AU、1.7AU、1.8AU、1.9AU、2.0AU或大于 2.0AU。在另一个特定实施方案中，洗脱缓冲液的电导率为至少20 mS/cm。在又一个特定实施方案中，洗脱缓冲液的电导率为至少22 mS/cm。在又一个特定实施方案中，洗脱缓冲液的电导率为至少25 mS/cm。在一个优选实施方案中，阳离子交换树脂为弱阳离子交换树 脂。在一个特定实施方案中，弱阳离子交换树脂为羧甲基(CM)树脂。

c.总洗脱液的百分比

在又一个特别适合于大规模制造免疫球蛋白组合物的实施方案 中，洗脱液的前导部分和滞后部分被定义为洗脱液的总蛋白质含量的 百分比(例如以体积或总蛋白质计)。通过预先确定以前导部分收集的 洗脱液的百分比，可严格控制免疫球蛋白的回收率。用于定义洗脱液 的前导部分和滞后部分的这种方法特别适用于需要最少步骤产率的 制造工艺和根据免疫球蛋白产率降低的成本与制造具有酰胺分解活 性和因子XI和/或因子XIa含量降低的组合物的收益的权衡来作出决 定的工艺。以这种方式，可以大致相同产率将免疫球蛋白从一个制剂 再生式回收至下一个制剂中，不考虑制造轮次之间的微小差异。如实 施例8中所证明，应用这种收集方案可以高产率回收其中TGA何酰 胺分解活性含量显著降低的IgG免疫球蛋白组合物。

因此，在一个方面中，本发明提供一种降低血浆来源免疫球蛋白 组合物中的酰胺分解活性的量的方法，所述方法包括以下步骤：(a) 使IgG免疫球蛋白和酰胺分解活性(即具有酰胺分解活性的蛋白质污 染物)结合于阳离子交换树脂上；(b)任选地用洗涤缓冲液洗涤结合有 蛋白质的阳离子交换树脂以除去松散缔合的污染物；(c)对IgG免疫 球蛋白和酰胺分解活性执行单步洗脱；以及(d)分别收集洗脱液的前 导部分和洗脱液的滞后部分，其中洗脱液的前导部分由不超过80% 的总洗脱液组成。在一个特定实施方案中，洗脱液的前导部分占总洗 脱液的70%至80%。在另一个特定实施方案中，洗脱液的前导部分 占总洗脱液的60%至80%。在另一个特定实施方案中，洗脱液的前 导部分占总洗脱液的50%至80%。在另一个特定实施方案中，洗脱 液的前导部分占总洗脱液的70%至75%。在又一个特定实施方案中， 洗脱液的前导部分占总洗脱液的75%至80%。在其它实施方案中， 洗脱液的前导部分占总洗脱液的70%、71%、72%、73%、74%、75%、 76%、77%、78%、79%或80%。在另一个实施方案中，洗脱液的前 导部分(即所收集或汇集的目标洗脱份)占总洗脱液的至多70%。在一 个特定实施方案中，洗脱液的前导部分占总洗脱液的60%至70%。 在另一个特定实施方案中，洗脱液的前导部分占总洗脱液的50%至 70%。在另一个特定实施方案中，洗脱液的前导部分占总洗脱液的 60%至65%。在又一个特定实施方案中，洗脱液的前导部分占总洗脱 液的65%至70%。在其它实施方案中，洗脱液的前导部分占总洗脱 液的60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69% 或70%。在另一个实施方案中，洗脱液的前导部分(即所收集或汇集 的目标洗脱份)占总洗脱液的至多60%。在一个特定实施方案中，洗 脱液的前导部分占总洗脱液的50%至60%。在另一个特定实施方案 中，洗脱液的前导部分占总洗脱液的50%至55%。在又一个特定实 施方案中，洗脱液的前导部分占总洗脱液的55%至60%。在其它实 施方案中，洗脱液的前导部分占总洗脱液的50%、51%、52%、53%、 54%、55%、56%、57%、58%、59%或60%。在一个优选实施方案中， 阳离子交换树脂为弱阳离子交换树脂。在一个特定实施方案中，弱阳 离子交换树脂为羧甲基(CM)树脂。

在一个特定实施方案中，本发明提供一种降低血浆来源免疫球蛋 白组合物中的因子XI(FXI)和/或因子XIa(FXIa)的量的方法，所述方 法包括以下步骤：(a)使包含IgG免疫球蛋白和FXI和/或FXIa的血浆 来源免疫球蛋白组合物与安置在色谱柱中的阳离子交换树脂在包括 pH不超过6.0并且电导率不超过11mS/cm的第一溶液条件下接触， 以便使免疫球蛋白和至少一部分FXI和/或FXIa与阳离子交换树脂结 合；(b)通过使阳离子交换树脂与包括pH为至少7.5并且电导率为至 少15mS/cm的洗脱缓冲液接触形成洗脱液来使免疫球蛋白从阳离子 交换树脂洗脱；以及(c)分别收集洗脱液的前导部分和洗脱液的滞后部 分，其中洗脱液的前导部分由不超过80%的总洗脱液组成。在一个特 定实施方案中，洗脱液的前导部分占总洗脱液的70%至80%。在另 一个特定实施方案中，洗脱液的前导部分占总洗脱液的60%至80%。 在另一个特定实施方案中，洗脱液的前导部分占总洗脱液的50%至 80%。在另一个特定实施方案中，洗脱液的前导部分占总洗脱液的 70%至75%。在又一个特定实施方案中，洗脱液的前导部分占总洗脱 液的75%至80%。在其它实施方案中，洗脱液的前导部分占总洗脱 液的70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79% 或80%。在另一个实施方案中，洗脱液的前导部分(即所收集或汇集 的目标洗脱份)占总洗脱液的至多70%。在一个特定实施方案中，洗 脱液的前导部分占总洗脱液的60%至70%。在另一个特定实施方案 中，洗脱液的前导部分占总洗脱液的50%至70%。在另一个特定实 施方案中，洗脱液的前导部分占总洗脱液的60%至65%。在又一个 特定实施方案中，洗脱液的前导部分占总洗脱液的65%至70%。在 其它实施方案中，洗脱液的前导部分占总洗脱液的60%、61%、62%、 63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%或70%。在另一个实施方 案中，洗脱液的前导部分(即所收集或汇集的目标洗脱份)占总洗脱液 的至多60%。在一个特定实施方案中，洗脱液的前导部分占总洗脱液 的50%至60%。在另一个特定实施方案中，洗脱液的前导部分占总 洗脱液的50%至55%。在又一个特定实施方案中，洗脱液的前导部 分占总洗脱液的55%至60%。在其它实施方案中，洗脱液的前导部 分占总洗脱液的50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、 58%、59%或60%。在另一个特定实施方案中，洗脱缓冲液的电导率 为至少20mS/cm。在又一个特定实施方案中，洗脱缓冲液的电导率 为至少22mS/cm。在又一个特定实施方案中，洗脱缓冲液的电导率 为至少25mS/cm。在一个优选实施方案中，阳离子交换树脂为弱阳 离子交换树脂。在一个特定实施方案中，弱阳离子交换树脂为羧甲基 (CM)树脂。

d.总洗脱液的体积

在另一个特别适合于大规模制造免疫球蛋白组合物的实施方案 中，洗脱液的前导部分和滞后部分被定义为洗脱液峰的体积与阳离子 交换柱的尺寸(例如设定柱体积数目)的比率。通过预先确定以前导部 分收集的洗脱液体积，免疫球蛋白的回收率可加以严格控制并且可再 现。用于定义洗脱液的前导部分和滞后部分的这种方法特别适用于需 要最少步骤产率的制造工艺和根据免疫球蛋白产率降低的成本与制 造具有酰胺分解活性和因子XI和/或因子XIa含量降低的组合物的收 益的权衡来作出决定的工艺。以这种方式，可以大致相同产率将免疫 球蛋白从一个制剂再生式回收至下一个制剂中，不考虑制造轮次之间 的微小差异。如实施例11至13中所证明，应用这种收集方案可以高 产率回收其中TGA和酰胺分解活性含量显著降低的IgG免疫球蛋白 组合物。

在一个实施方案中，前导部分的开始是通过基线吸光度定义。在 一些实施方案中，洗脱液峰的吸光度一旦跨越第一阈值，就开始收集 前导部分。在一个实施方案中，当洗脱液的OD₂₈₀达到至少2.0AU 时，开始收集前导部分。在一个特定实施方案中，当洗脱液的OD₂₈₀达到至少1.5AU时，开始收集前导部分。在另一个特定实施方案中， 当洗脱液的OD₂₈₀达到至少1.0AU时，开始收集前导部分。在另一 个特定实施方案中，当洗脱液的OD₂₈₀达到至少0.5AU时，开始收 集前导部分。在其它特定实施方案中，当洗脱液的OD₂₈₀达到至少0.1 AU、0.2AU、0.3AU、0.4AU、0.5AU、0.6AU、0.7AU、0.8AU、 0.9AU、1.0AU、1.1AU、1.2AU、1.3AU、1.4AU、1.5AU、1.6AU、 1.7AU、1.8AU、1.9AU、2.0AU或大于2.0AU时，开始收集前导 部分。

在一些实施方案中，一旦开始收集前导部分，就先收集预定柱体 积数目，随后切换为收集(或处置)洗脱液的滞后部分。在一个实施方 案中，以前导部分收集不超过5个柱体积(CV)的洗脱液。在另一个实 施方案中，前导部分中收集不超过4个CV的洗脱液。在另一个实施 方案中，前导部分中收集不超过3个CV的洗脱液。在另一个实施方 案中，前导部分中收集不超过2.7个CV的洗脱液。在另一个实施方 案中，前导部分中收集不超过2.5个CV的洗脱液。在另一个实施方 案中，前导部分中收集不超过2个CV的洗脱液。在另一个实施方案 中，前导部分中收集不超过1个CV的洗脱液。在其它实施方案中， 前导部分中收集不超过0.5个CV、0.6个CV、0.7个CV、0.8个CV、 0.9个CV、1.0个CV、1.1个CV、1.2个CV、1.3个CV、1.4个CV、 1.5个CV、1.6个CV、1.7个CV、1.8个CV、1.9个CV、2.0个CV、 2.1个CV、2.2个CV、2.3个CV、2.4个CV、2.5个CV、2.6个CV、 2.7个CV、2.8个CV、2.9个CV、3.0个CV、3.1个CV、3.2个CV、 3.3个CV、3.4个CV、3.5个CV、3.6个CV、3.7个CV、3.8个CV、 3.9个CV、4.0个CV、4.1个CV、4.2个CV、4.3个CV、4.4个CV、 4.5个CV、4.6个CV、4.7个CV、4.8个CV、4.9个CV、5.0个CV、 5.1个CV、5.2个CV、5.3个CV、5.4个CV、5.5个CV、5.6个CV、 5.7个CV、5.8个CV、5.9个CV、6.0个CV或大于6.0个CV柱体 积的洗脱液。

因此，在一个方面中，本发明提供一种降低血浆来源免疫球蛋白 组合物中的酰胺分解活性的量的方法，所述方法包括以下步骤：(a) 使IgG免疫球蛋白和酰胺分解活性(即具有酰胺分解活性的蛋白质污 染物)结合于阳离子交换树脂上；(b)任选地用洗涤缓冲液洗涤结合有 蛋白质的阳离子交换树脂以除去松散缔合的污染物；(c)对IgG免疫 球蛋白和酰胺分解活性执行单步洗脱；以及(d)分别收集洗脱液的前 导部分和洗脱液的滞后部分，其中洗脱液的前导部分由不超过4个柱 体积(CV)的总洗脱液组成。在一个特定实施方案中，洗脱液的前导部 分为2.5个CV至3.0个CV的总洗脱液。在另一个特定实施方案中， 洗脱液的前导部分为2.0个CV至3.0个CV的总洗脱液。在另一个 特定实施方案中，洗脱液的前导部分为2.0个CV至3.5个CV的总 洗脱液。在另一个特定实施方案中，洗脱液的前导部分为2.0个CV 至4.0个CV的总洗脱液。在又一个特定实施方案中，洗脱液的前导 部分为2.5个CV至3.5个CV的总洗脱液。在其它实施方案中，洗 脱液的前导部分为0.5个CV、0.6个CV、0.7个CV、0.8个CV、0.9 个CV、1.0个CV、1.1个CV、1.2个CV、1.3个CV、1.4个CV、 1.5个CV、1.6个CV、1.7个CV、1.8个CV、1.9个CV、2.0个CV、 2.1个CV、2.2个CV、2.3个CV、2.4个CV、2.5个CV、2.6个CV、 2.7个CV、2.8个CV、2.9个CV、3.0个CV、3.1个CV、3.2个CV、 3.3个CV、3.4个CV、3.5个CV、3.6个CV、3.7个CV、3.8个CV、 3.9个CV、4.0个CV、4.1个CV、4.2个CV、4.3个CV、4.4个CV、 4.5个CV、4.6个CV、4.7个CV、4.8个CV、4.9个CV、5.0个CV、 5.1个CV、5.2个CV、5.3个CV、5.4个CV、5.5个CV、5.6个CV、 5.7个CV、5.8个CV、5.9个CV或6.0个CV的总洗脱液。在一个 优选实施方案中，阳离子交换树脂为弱阳离子交换树脂。在一个特定 实施方案中，弱阳离子交换树脂为羧甲基(CM)树脂。

在一个特定实施方案中，本发明提供一种降低血浆来源免疫球蛋 白组合物中的因子XI(FXI)和/或因子XIa(FXIa)的量的方法，所述方 法包括以下步骤：(a)使包含IgG免疫球蛋白和FXI和/或FXIa的血浆 来源免疫球蛋白组合物与安置在色谱柱中的阳离子交换树脂在包括 pH不超过6.0并且电导率不超过11mS/cm的第一溶液条件下接触， 以便使免疫球蛋白和至少一部分FXI和/或FXIa与阳离子交换树脂结 合；(b)通过使阳离子交换树脂与包括pH为至少7.5并且电导率为至 少15mS/cm的洗脱缓冲液接触来形成洗脱液从而使免疫球蛋白从阳 离子交换树脂洗脱；以及(c)分别收集洗脱液的前导部分和洗脱液的滞 后部分，其中洗脱液的前导部分由不超过4个柱体积(CV)的总洗脱液 组成。在一个特定实施方案中，洗脱液的前导部分为2.5个CV至3.0 个CV的总洗脱液。在另一个特定实施方案中，洗脱液的前导部分为 2.0个CV至3.0个CV的总洗脱液。在另一个特定实施方案中，洗脱 液的前导部分为2.0个CV至3.5个CV的总洗脱液。在另一个特定 实施方案中，洗脱液的前导部分为2.0个CV至4.0个CV的总洗脱 液。在又一个特定实施方案中，洗脱液的前导部分为2.5个CV至3.5 个CV的总洗脱液。在其它实施方案中，洗脱液的前导部分为0.5个 CV、0.6个CV、0.7个CV、0.8个CV、0.9个CV、1.0个CV、1.1 个CV、1.2个CV、1.3个CV、1.4个CV、1.5个CV、1.6个CV、 1.7个CV、1.8个CV、1.9个CV、2.0个CV、2.1个CV、2.2个CV、 2.3个CV、2.4个CV、2.5个CV、2.6个CV、2.7个CV、2.8个CV、 2.9个CV、3.0个CV、3.1个CV、3.2个CV、3.3个CV、3.4个CV、 3.5个CV、3.6个CV、3.7个CV、3.8个CV、3.9个CV、4.0个CV、 4.1个CV、4.2个CV、4.3个CV、4.4个CV、4.5个CV、4.6个CV、 4.7个CV、4.8个CV、4.9个CV、5.0个CV、5.1个CV、5.2个CV、 5.3个CV、5.4个CV、5.5个CV、5.6个CV、5.7个CV、5.8个CV、 5.9个CV或6.0个CV的总洗脱液。在另一个特定实施方案中，洗脱 缓冲液的电导率为至少20mS/cm。在又一个特定实施方案中，洗脱 缓冲液的电导率为至少22mS/cm。在又一个特定实施方案中，洗脱 缓冲液的电导率为至少25mS/cm。在一个优选实施方案中，阳离子 交换树脂为弱阳离子交换树脂。在一个特定实施方案中，弱阳离子交 换树脂为羧甲基(CM)树脂。

IV.降低抗补体活性(ACA)

在一个方面中，本发明提供降低血浆来源IgG免疫球蛋白组合物 的抗补体活性(ACA)含量的色谱方法。同样，本发明还提供根据本文 提供的方法制备的含有低含量的抗补体活性(ACA)的血浆来源IgG免 疫球蛋白组合物。有利的是，本文所述方法提供安全特征改善的血浆 来源IgG免疫球蛋白组合物。明确来说，这些方法所提供的组合物引 起与抗补体活性有关的不良反应的可能性低于目前制造的IgG免疫 球蛋白组合物(参见例如Buchacher A.等，Vox Sang.2010年4月；98(3 Pt1):e209-18，所述文献的内容以全文引用的方式明确并入本文中用 于所有目的)。

A.分级分离方法

本发明部分地基于以下发现：存在于血浆来源免疫球蛋白组合物 中的抗补体活性(ACA)大部分在由一步洗脱产生的洗脱液的滞后部 分中从阳离子交换树脂洗脱，而洗脱份中所含的免疫球蛋白大部分在 所述洗脱液的前导部分中洗脱。因此，通过分别收集洗脱液的前导部 分和洗脱液的滞后部分，可显著降低所得免疫球蛋白制剂的抗补体活 性。明确来说，本文显示，在根据本文提供的方法制备的免疫球蛋白 组合物中，ACA含量显著降低。

因此，在一个实施方案中，本发明提供一种降低血浆来源免疫球 蛋白组合物中的抗补体活性(ACA)的量的方法，所述方法包括以下步 骤：(a)使IgG免疫球蛋白和抗补体活性(即具有抗补体活性的污染物) 结合于阳离子交换树脂上；(b)任选地用洗涤缓冲液洗涤结合有蛋白 质的阳离子交换树脂以除去松散缔合的污染物；(c)对IgG免疫球蛋 白和ACA执行单步洗脱；以及(d)分别收集洗脱液的前导部分和洗脱 液的滞后部分，其中洗脱液的前导部分包含其中ACA的量低于起始 组合物的IgG免疫球蛋白组合物，并且洗脱液的滞后部分含有高浓度 的ACA活性。在一个优选实施方案中，阳离子交换树脂为弱阳离子 交换树脂。在一个特定实施方案中，弱阳离子交换树脂为羧甲基(CM) 树脂。

在一个特定实施方案中，本发明提供一种降低血浆来源免疫球蛋 白组合物中的抗补体活性(ACA)的量的方法，所述方法包括以下步 骤：(a)使包含IgG免疫球蛋白和第一量的ACA的血浆来源免疫球蛋 白组合物与安置在色谱柱中的阳离子交换树脂在包括pH不超过6.0 并且电导率不超过11mS/cm的第一溶液条件下接触，以便使免疫球 蛋白和至少一部分第一量的ACA与阳离子交换树脂结合；(b)通过使 阳离子交换树脂与包括pH为至少7.5并且电导率为至少15mS/cm的 洗脱缓冲液接触来形成洗脱液从而使免疫球蛋白从阳离子交换树脂 洗脱；以及(c)分别收集洗脱液的前导部分和洗脱液的滞后部分，其中 洗脱液的前导部分包含其中ACA浓度对IgG免疫球蛋白浓度的比率 低于起始组合物的IgG免疫球蛋白组合物，并且洗脱液的滞后部分含 有相对于IgG免疫球蛋白浓度较高浓度的ACA。在一个优选实施方 案中，阳离子交换树脂为弱阳离子交换树脂。在一个特定实施方案中， 弱阳离子交换树脂为羧甲基(CM)树脂。在另一个特定实施方案中， 洗脱缓冲液的电导率为至少20mS/cm。在又一个特定实施方案中， 洗脱缓冲液的电导率为至少22mS/cm。在又一个特定实施方案中， 洗脱缓冲液的电导率为至少25mS/cm。

在一个特定实施方案中，所述方法包括以下步骤：(a)使包含IgG 免疫球蛋白和第一量的ACA的血浆来源免疫球蛋白组合物与安置在 色谱柱中的阳离子交换树脂在包括pH介于4.8与5.6之间并且电导 率不超过11mS/cm的第一溶液条件下接触，以便使免疫球蛋白和至 少一部分第一量的ACA与阳离子交换树脂结合；(b)通过使阳离子交 换树脂与包括pH为至少7.5并且电导率为至少15mS/cm的洗脱缓冲 液接触形成洗脱液来使免疫球蛋白从阳离子交换树脂洗脱；以及(c) 分别收集洗脱液的前导部分和洗脱液的滞后部分，其中洗脱液的前导 部分包含ACA的量对IgG免疫球蛋白的量的比率低于起始组合物的 IgG免疫球蛋白组合物，并且洗脱液的滞后部分含有相对于IgG免疫 球蛋白的量较高量的ACA。在一个特定实施方案中，第一溶液条件 的pH为5.2±0.3。在另一个特定实施方案中，第一溶液条件的pH为 5.2±0.2。在另一个特定实施方案中，第一溶液条件的pH为5.2±0.1。 在又一个特定实施方案中，第一溶液条件的pH为5.2。在其它实施 方案中，第一溶液条件的pH为4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、 5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0。在另一个特定实施方案中，洗脱缓冲 液的电导率为至少20mS/cm。在又一个特定实施方案中，洗脱缓冲 液的电导率为至少22mS/cm。在又一个特定实施方案中，洗脱缓冲 液的电导率为至少25mS/cm。在一个优选实施方案中，阳离子交换 树脂为弱阳离子交换树脂。在一个特定实施方案中，弱阳离子交换树 脂为羧甲基(CM)树脂。

在一个特定实施方案中，所述方法包括以下步骤：(a)使包含IgG 免疫球蛋白和第一量的ACA的血浆来源免疫球蛋白组合物与安置在 色谱柱中的阳离子交换树脂在包括pH不超过6.0并且电导率不超过 11mS/cm的第一溶液条件下接触，以便使免疫球蛋白和至少一部分 第一量的ACA与阳离子交换树脂结合；(b)用具有足够低以使免疫球 蛋白不能从树脂洗脱的电导率和介于5.1与5.9之间的pH的缓冲液 洗涤结合有免疫球蛋白和ACA的树脂；(c)通过使阳离子交换树脂与 包括pH为至少7.5并且电导率为至少15mS/cm的洗脱缓冲液接触来 形成洗脱液从而使免疫球蛋白从阳离子交换树脂洗脱；以及(d)分别 收集洗脱液的前导部分和洗脱液的滞后部分，其中洗脱液的前导部分 包含其中ACA浓度对IgG免疫球蛋白浓度的比率低于起始组合物的 IgG免疫球蛋白组合物，并且洗脱液的滞后部分含有相对于IgG免疫 球蛋白浓度较高浓度的ACA。在一个特定实施方案中，洗涤缓冲液 的pH为5.5±0.3。在另一个特定实施方案中，洗涤缓冲液的pH为 5.5±0.2。在另一个特定实施方案中，洗涤缓冲液的pH为5.5±0.1。在 另一个特定实施方案中，洗涤缓冲液的pH为5.5。在其它实施方案 中，洗涤缓冲液的pH为5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、 5.9或6.0。在另一个特定实施方案中，洗脱缓冲液的电导率为至少 20mS/cm。在又一个特定实施方案中，洗脱缓冲液的电导率为至少 22mS/cm。在又一个特定实施方案中，洗脱缓冲液的电导率为至少 25mS/cm。在一个优选实施方案中，阳离子交换树脂为弱阳离子交换 树脂。在一个特定实施方案中，弱阳离子交换树脂为羧甲基(CM)树 脂。

在一个特定实施方案中，所述方法包括以下步骤：(a)使包含IgG 免疫球蛋白和第一量的ACA的血浆来源免疫球蛋白组合物与安置在 色谱柱中的阳离子交换树脂在包括pH不超过6.0并且电导率不超过 11mS/cm的第一溶液条件下接触，以便使免疫球蛋白和至少一部分 第一量的ACA与阳离子交换树脂结合；(b)通过使阳离子交换树脂与 包括pH为7.8±0.4并且电导率为至少20mS/cm的洗脱缓冲液接触来 形成洗脱液从而使免疫球蛋白从阳离子交换树脂洗脱；以及(c)分别收 集洗脱液的前导部分和洗脱液的滞后部分，其中洗脱液的前导部分包 含其中ACA浓度对IgG免疫球蛋白浓度的比率低于起始组合物的 IgG免疫球蛋白组合物，并且洗脱液的滞后部分含有相对于IgG免疫 球蛋白浓度较高浓度的ACA。在一个特定实施方案中，洗脱缓冲液 的pH为7.8±0.3。在另一个特定实施方案中，洗脱缓冲液的pH为 7.8±0.2。在另一个特定实施方案中，洗脱缓冲液的pH为7.8±0.1。在 另一个特定实施方案中，洗脱缓冲液的pH为7.8。在其它实施方案 中，洗脱缓冲液的pH为7.0、7.1、7.2、7.36、7.4、7.5、7.6、7.7、 7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4或8.5。在又一个特定实施方案中， 洗脱缓冲液的电导率为至少22mS/cm。在又一个特定实施方案中， 洗脱缓冲液的电导率为至少25mS/cm。在一个优选实施方案中，阳 离子交换树脂为弱阳离子交换树脂。在一个特定实施方案中，弱阳离 子交换树脂为羧甲基(CM)树脂。

一般而言，本文提供的方法所用的起始物质包括包含IgG免疫球 蛋白和抗补体活性的任何血浆洗脱份或组合物。因而，在一个实施方 案中，根据本领域中已知的任一种纯化方案将血浆部分地或完全地分 级分离。在一个特定实施方案中，血浆经分级分离而产生洗脱份I沉 淀物、洗脱份II沉淀物、洗脱份I+II+III沉淀物、洗脱份II+III沉淀 物、洗脱份IV-1、Kistler-Nitschmann沉淀物A、Kistler-Nitschmann 沉淀物B或其被修饰沉淀物，其可用作本文提供的方法的起始物质。

在一个优选实施方案中，通过一个或多个乙醇沉淀步骤分级分离 血浆。乙醇沉淀步骤可用于使所要免疫球蛋白从溶液沉淀，同时使至 少一种非免疫球蛋白滞留于上清液中，或使至少一种非免疫球蛋白从 溶液沉淀，同时使所要免疫球蛋白滞留于上清液中。以这种方式分级 分离免疫球蛋白的方法在本领域中已众所周知。示例性乙醇沉淀物包 括(但不限于)洗脱份I沉淀物、洗脱份I+II+III沉淀物、洗脱份II+III 沉淀物、洗脱份IV-1、Kistler-Nitschmann沉淀物A、Kistler-Nitschmann 沉淀物B以及其被修饰沉淀物。在一个特别优选实施方案中，存在 于冷贫血浆中的免疫球蛋白通过四步乙醇法富集，所述四步乙醇法包 括洗脱份I+II+III沉淀步骤、A沉淀步骤、B沉淀步骤及洗脱份II沉 淀步骤。

如本文所证明，本文提供的方法在应用于大规模制造程序时保留 了其有利特征。就制备IgG免疫球蛋白组合物而言，大规模制造是指 从至少100L汇集血浆(例如冷贫血浆)起始物质中富集免疫球蛋白的 工艺。一般而言，大规模免疫球蛋白制造工艺每批次可分级分离100 L与20,000L之间的汇集血浆。在某些实施方案中，大规模IgG免疫 球蛋白制造工艺是指分级分离至少100L汇集血浆(例如冷贫血浆)。 在另一个实施方案中，大规模IgG免疫球蛋白制造工艺是指分级分离 至少500L汇集血浆(例如冷贫血浆)。在另一个实施方案中，大规模 IgG免疫球蛋白制造工艺是指分级分离至少1,000L汇集血浆(例如冷 贫血浆)。在另一个实施方案中，大规模IgG免疫球蛋白制造工艺是 指分级分离至少5,000L汇集血浆(例如冷贫血浆)。在又一个实施方 案中，大规模IgG免疫球蛋白制造工艺是指分级分离至少10,000L 汇集血浆(例如冷贫血浆)。

在一个实施方案中，本文提供的降低抗补体活性(ACA)的方法所 用的起始物质是通过乙醇分级分离汇集的人血浆(例如冷贫血浆)来 制备。在一个特定实施方案中，乙醇分级分离包括冷贫血浆的洗脱份 I+II+III沉淀、混悬洗脱份I+II+III沉淀物的洗脱份A沉淀、混悬洗 脱份A沉淀物的洗脱份B沉淀以及洗脱份A上清液的洗脱份II沉淀， 如下文所述。在另一个特定实施方案中，乙醇分级分离包括冷贫血浆 的洗脱份I沉淀、洗脱份I上清液的洗脱份II+III沉淀以及混悬洗脱 份II+III沉淀物的洗脱份II沉淀。

一般而言，涵盖包含上述装载条件、洗涤条件与洗脱条件的所有 组合的方法。此外，涵盖包含特定色谱条件的所有组合的方法以及用 于定义和收集洗脱液的前导部分的所有可能方案，如下文所述。

1.阳离子交换洗脱液的前导部分和滞后部分

在一个方面中，本发明提供通过收集阳离子交换洗脱液的前导部 分来降低存在于免疫球蛋白制剂中的抗补体活性(ACA)的方法。有利 的是，本文已证实通过阳离子交换色谱步骤的单步洗脱所形成的洗脱 液的前导部分含有大部分所要免疫球蛋白内容物，而洗脱液的滞后部 分含有大部分的非所需ACA。因为洗脱的免疫球蛋白与ACA无法完 全分离，所以必须确定洗脱液的前导部分与滞后部分之间的区分。有 两个主要考虑因素可决定何时作出这种区分，即：(i)取决于洗脱液的 前导部分和滞后部分如何定义，前导部分中将回收较多或较少的 ACA，即当洗脱液的前导部分被定义为总洗脱液的较小部分时，可从 免疫球蛋白内容物中分离较大部分的ACA，反之亦然；和(ii)取决于 洗脱液的前导部分和滞后部分如何定义，前导部分中将存在较大或较 小的免疫球蛋白回收率，即当洗脱液的前导部分被定义为总洗脱液的 较小部分时，实现较低免疫球蛋白产率，反之亦然。

因此，本领域技术人员将根据其个别的需要，就在何处划分阳离 子交换洗脱液的前导部分与滞后部分之间的边界作出决定。举例来 说，当为了研究或专门治疗目的而准备小规模纯化时，本领域技术人 员可通过收集洗脱液的较小前导部分同时牺牲最终免疫球蛋白产率 来最佳化所述方法的分离能力。相比之下，当进行大规模制造(例如 处理超过500L冷贫血浆)时，机会成本可能要求收集洗脱液的较大 前导部分以提高免疫球蛋白回收率，但以组合物的ACA的较小降低 为代价。

在不同实施方案中，洗脱液的前导部分和滞后部分可通过不同特 征定义，包括(但不限于)洗脱液的pH、洗脱液的蛋白质产率(例如表 示为与树脂结合的蛋白质百分比)、蛋白质浓度(例如由光学密度所测 定)、洗脱液体积以及其类似特征。

a.洗脱液的pH

如本文提供的实施例所证明，阳离子交换洗脱步骤开始的标志为 来自管柱的溶液的pH下降至低于5.0的pH，尽管洗脱缓冲液的pH (通常>7.0)高于管柱装载和洗涤步骤的pH(通常为5.0-6.0)。pH的这 种降低对应于具有低ACA的IgG免疫球蛋白组合物的洗脱(参见例如 表3、表11和表15)。在洗脱后期，来自管柱的溶液的pH急剧上升 至大于6.0-8.0。pH的这种移位与洗脱液的ACA含量的显著增加同 时发生(参见例如表3、表11和表15)。因此，虽然一步洗脱是通过 使用单一高pH洗脱缓冲液(通常大于7.0)来执行，但洗脱特征类似于 其中IgG免疫球蛋白首先从管柱洗脱、随后洗脱伴随抗补体活性的两 步洗脱。因此，在某些实施方案中，洗脱液的前导部分和滞后部分是 根据洗脱液在柱出口处的pH来定义。

因此，在一个方面中，本发明提供一种降低血浆来源免疫球蛋白 组合物中的抗补体活性(ACA)的量的方法，所述方法包括以下步骤： (a)使IgG免疫球蛋白和抗补体活性(即具有抗补体活性的污染物)结合 于阳离子交换树脂上；(b)任选地用洗涤缓冲液洗涤结合有IgG免疫 球蛋白和ACA的阳离子交换树脂以除去松散缔合的污染物；(c)对IgG 免疫球蛋白和ACA执行单步洗脱；以及(d)分别收集洗脱液的前导部 分和洗脱液的滞后部分，其中洗脱液的前导部分由pH不超过7.0的 洗脱液部分组成。在一个特定实施方案中，洗脱液的前导部分由pH 不超过6.5的洗脱液部分组成。在另一个特定实施方案中，洗脱液的 前导部分由pH不超过6.0的洗脱液部分组成。在另一个特定实施方 案中，洗脱液的前导部分由pH不超过5.5的洗脱液部分组成。在另 一个特定实施方案中，洗脱液的前导部分由pH不超过5.0的洗脱液 部分组成。在其它实施方案中，洗脱液的前导部分由具有以下pH的 洗脱液部分组成：不超过7.0、6.9、6.8、6.7、6.6、6.5、6.4、6.3、 6.2、6.1、6.0、5.9、5.8、5.7、5.6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5.0或 小于5.0。在一个优选实施方案中，阳离子交换树脂为弱阳离子交换 树脂。在一个特定实施方案中，弱阳离子交换树脂为羧甲基(CM)树 脂。

在一个特定实施方案中，本发明提供一种降低血浆来源免疫球蛋 白组合物中的抗补体活性(ACA)的量的方法，所述方法包括以下步 骤：(a)使包含IgG免疫球蛋白和第一量的ACA的血浆来源免疫球蛋 白组合物与安置在色谱柱中的阳离子交换树脂在包括pH不超过6.0 并且电导率不超过11mS/cm的第一溶液条件下接触，以便使免疫球 蛋白和至少一部分ACA与阳离子交换树脂结合；(b)通过使阳离子交 换树脂与包括pH为至少7.5并且电导率为至少15mS/cm的洗脱缓冲 液接触来形成洗脱液从而使免疫球蛋白从阳离子交换树脂洗脱；以及 (c)分别收集洗脱液的前导部分和洗脱液的滞后部分，其中洗脱液的前 导部分由pH不超过7.0的洗脱液部分组成。在一个特定实施方案中， 洗脱液的前导部分由pH不超过6.5的洗脱液部分组成。在另一个特 定实施方案中，洗脱液的前导部分由pH不超过6.0的洗脱液部分组 成。在另一个特定实施方案中，洗脱液的前导部分由pH不超过5.5 的洗脱液部分组成。在另一个特定实施方案中，洗脱液的前导部分由 pH不超过5.0的洗脱液部分组成。在其它实施方案中，洗脱液的前 导部分由具有以下pH的洗脱液部分组成：不超过7.0、6.9、6.8、6.7、 6.6、6.5、6.4、6.3、6.2、6.1、6.0、5.9、5.8、5.7、5.6、5.5、5.4、 5.3、5.2、5.1、5.0或小于5.0。在一个特定实施方案中，第一溶液条 件的pH为5.2±0.3。在另一个特定实施方案中，第一溶液条件的pH 为5.2±0.2。在另一个特定实施方案中，第一溶液条件的pH为5.2±0.1。 在又一个特定实施方案中，第一溶液条件的pH为5.2。在其它实施 方案中，第一溶液条件的pH为4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、 5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0。在另一个特定实施方案中，洗脱缓冲 液的电导率为至少20mS/cm。在又一个特定实施方案中，洗脱缓冲 液的电导率为至少22mS/cm。在又一个特定实施方案中，洗脱缓冲 液的电导率为至少25mS/cm。在一个优选实施方案中，阳离子交换 树脂为弱阳离子交换树脂。在一个特定实施方案中，弱阳离子交换树 脂为羧甲基(CM)树脂。

b.洗脱液的吸光度

在又一个特别适合于大规模制造免疫球蛋白组合物的实施方案 中，洗脱液的前导部分和滞后部分是根据从阳离子交换柱洗脱的免疫 球蛋白浓度来定义。举例来说，在大规模制造期间，免疫球蛋白组合 物可以足够高的蛋白质负荷(例如每毫升树脂>80mg蛋白质)装载于 阳离子交换树脂上，使得洗脱液峰被高度浓缩。在这些情况下，洗脱 液的前导部分可定义为先于OD₂₈₀降至阈值以下洗脱的洗脱液的洗脱 份。以这种方式，可以大致相同产率将免疫球蛋白从一个制剂再生式 回收至下一个制剂中，不考虑制造轮次之间的微小差异。如实施例9 中所证明，将这种收集方案应用于大规模制造过程可以高产率回收其 中抗补体活性(ACA)含量显著降低的IgG免疫球蛋白组合物。

因此，在一个方面中，本发明提供一种降低血浆来源免疫球蛋白 组合物中的抗补体活性(ACA)的量的方法，所述方法包括以下步骤： (a)使IgG免疫球蛋白和抗补体活性(即具有抗补体活性的污染物)结合 于阳离子交换树脂上；(b)任选地用洗涤缓冲液洗涤结合有蛋白质的 阳离子交换树脂以除去松散缔合的污染物；(c)对IgG免疫球蛋白和 ACA执行单步洗脱；以及(d)分别收集洗脱液的前导部分和洗脱液的 滞后部分，其中洗脱液的前导部分由OD₂₈₀为至少0.5AU的洗脱液 部分组成。在一个特定实施方案中，洗脱液的前导部分由OD₂₈₀为至 少1.0AU的洗脱液部分组成。在另一个特定实施方案中，洗脱液的 前导部分由OD₂₈₀为至少1.5AU的洗脱液部分组成。在另一个特定 实施方案中，洗脱液的前导部分由OD₂₈₀为至少2.0AU的洗脱液部 分组成。在其它特定实施方案中，洗脱液的前导部分由具有以下OD₂₈₀的洗脱液部分组成：至少0.1AU、0.2AU、0.3AU、0.4AU、0.5AU、 0.6AU、0.7AU、0.8AU、0.9AU、1.0AU、1.1AU、1.2AU、1.3AU、 1.4AU、1.5AU、1.6AU、1.7AU、1.8AU、1.9AU、2.0AU或大于 2.0AU。在一个优选实施方案中，阳离子交换树脂为弱阳离子交换树 脂。在一个特定实施方案中，弱阳离子交换树脂为羧甲基(CM)树脂。

在一个特定实施方案中，本发明提供一种降低血浆来源免疫球蛋 白组合物中的抗补体活性(ACA)的量的方法，所述方法包括以下步 骤：(a)使包含IgG免疫球蛋白和第一量的ACA的血浆来源免疫球蛋 白组合物与安置在色谱柱中的阳离子交换树脂在包括pH不超过6.0 并且电导率不超过11mS/cm的第一溶液条件下接触，以便使免疫球 蛋白和至少一部分第一量的ACA与阳离子交换树脂结合；(b)通过使 阳离子交换树脂与包括pH为至少7.5并且电导率为至少15mS/cm的 洗脱缓冲液接触来形成洗脱液从而使免疫球蛋白从阳离子交换树脂 洗脱；以及(c)分别收集洗脱液的前导部分和洗脱液的滞后部分，其中 洗脱液的前导部分由OD₂₈₀为至少0.5AU的洗脱液部分组成。在一 个特定实施方案中，洗脱液的前导部分由OD₂₈₀为至少1.0AU的洗 脱液部分组成。在另一个特定实施方案中，洗脱液的前导部分由OD₂₈₀为至少1.5AU的洗脱液部分组成。在另一个特定实施方案中，洗脱 液的前导部分由OD₂₈₀为至少2.0AU的洗脱液部分组成。在其它特 定实施方案中，洗脱液的前导部分由具有以下OD₂₈₀的洗脱液部分组 成：至少0.1AU、0.2AU、0.3AU、0.4AU、0.5AU、0.6AU、0.7AU、 0.8AU、0.9AU、1.0AU、1.1AU、1.2AU、1.3AU、1.4AU、1.5AU、 1.6AU、1.7AU、1.8AU、1.9AU、2.0AU或大于2.0AU。在一个 特定实施方案中，第一溶液条件的pH为5.2±0.3。在另一个特定实施 方案中，第一溶液条件的pH为5.2±0.2。在另一个特定实施方案中， 第一溶液条件的pH为5.2±0.1。在又一个特定实施方案中，第一溶液 条件的pH为5.2。在其它实施方案中，第一溶液条件的pH为4.8、 4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0。在另 一个特定实施方案中，洗脱缓冲液的电导率为至少20mS/cm。在又 一个特定实施方案中，洗脱缓冲液的电导率为至少22mS/cm。在又 一个特定实施方案中，洗脱缓冲液的电导率为至少25mS/cm。在一 个优选实施方案中，阳离子交换树脂为弱阳离子交换树脂。在一个特 定实施方案中，弱阳离子交换树脂为羧甲基(CM)树脂。

c.总洗脱液的百分比

在又一个特别适合于大规模制造免疫球蛋白组合物的实施方案 中，洗脱液的前导部分和滞后部分被定义为洗脱液的总蛋白质含量的 百分比(例如以体积或总蛋白质计)。通过预先确定以前导部分收集的 洗脱液百分比，可严格控制免疫球蛋白的回收率。用于定义洗脱液的 前导部分和滞后部分的这种方法特别适用于需要最少步骤产率的制 造工艺和根据免疫球蛋白产率降低的成本与制造抗补体活性(ACA) 含量降低的组合物的收益的权衡来作出决定的工艺。以这种方式，可 以大致相同产率将免疫球蛋白从一个制剂再生式回收至下一个制剂 中，不考虑制造轮次之间的微小差异。如实施例8中所证明，应用此 收集方案可以高产率回收其中抗补体活性含量显著降低的IgG免疫 球蛋白组合物。

因此，在一个方面中，本发明提供一种降低血浆来源免疫球蛋白 组合物中的抗补体活性(ACA)的量的方法，所述方法包括以下步骤： (a)使IgG免疫球蛋白和抗补体活性(即具有抗补体活性的污染物)结合 于阳离子交换树脂上；(b)任选地用洗涤缓冲液洗涤结合有蛋白质的 阳离子交换树脂以除去松散缔合的污染物；(c)对IgG免疫球蛋白和 ACA执行单步洗脱；以及(d)分别收集洗脱液的前导部分和洗脱液的 滞后部分，其中洗脱液的前导部分由不超过80%的总洗脱液组成。在 一个特定实施方案中，洗脱液的前导部分占总洗脱液的70%至80%。 在另一个特定实施方案中，洗脱液的前导部分占总洗脱液的60%至 80%。在另一个特定实施方案中，洗脱液的前导部分占总洗脱液的 50%至80%。在另一个特定实施方案中，洗脱液的前导部分占总洗脱 液的70%至75%。在又一个特定实施方案中，洗脱液的前导部分占 总洗脱液的75%至80%。在其它实施方案中，洗脱液的前导部分占 总洗脱液的70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、 79%或80%。在另一个实施方案中，洗脱液的前导部分(即所收集或 汇集的目标洗脱份)占不超过总洗脱液的70%。在一个特定实施方案 中，洗脱液的前导部分占总洗脱液的60%至70%。在另一个特定实 施方案中，洗脱液的前导部分占总洗脱液的50%至70%。在另一个 特定实施方案中，洗脱液的前导部分占总洗脱液的60%至65%。在 又一个特定实施方案中，洗脱液的前导部分占总洗脱液的65%至 70%。在其它实施方案中，洗脱液的前导部分占总洗脱液的60%、61%、 62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%或70%。在另一个 实施方案中，洗脱液的前导部分(即所收集或汇集的有关洗脱份)占不 超过总洗脱液的60%。在一个特定实施方案中，洗脱液的前导部分占 总洗脱液的50%至60%。在另一个特定实施方案中，洗脱液的前导 部分占总洗脱液的50%至55%。在又一个特定实施方案中，洗脱液 的前导部分占总洗脱液的55%至60%。在其它实施方案中，洗脱液 的前导部分占总洗脱液的50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、 57%、58%、59%或60%。在一个优选实施方案中，阳离子交换树脂 为弱阳离子交换树脂。在一个特定实施方案中，弱阳离子交换树脂为 羧甲基(CM)树脂。

在一个特定实施方案中，本发明提供一种降低血浆来源免疫球蛋 白组合物中的抗补体活性(ACA)的量的方法，所述方法包括以下步 骤：(a)使包含IgG免疫球蛋白和第一量的抗补体活性(ACA)的血浆来 源免疫球蛋白组合物与安置在色谱柱中的阳离子交换树脂在包括pH 不超过6.0并且电导率不超过11mS/cm的第一溶液条件下接触，以 便使免疫球蛋白和至少一部分第一量的ACA与阳离子交换树脂结 合；(b)通过使阳离子交换树脂与包括pH为至少7.5并且电导率为至 少15mS/cm的洗脱缓冲液接触来形成洗脱液从而使免疫球蛋白从阳 离子交换树脂洗脱；以及(c)分别收集洗脱液的前导部分和洗脱液的滞 后部分，其中洗脱液的前导部分由不超过80%的总洗脱液组成。在一 个特定实施方案中，洗脱液的前导部分占总洗脱液的70%至80%。 在另一个特定实施方案中，洗脱液的前导部分占总洗脱液的60%至 80%。在另一个特定实施方案中，洗脱液的前导部分占总洗脱液的 50%至80%。在另一个特定实施方案中，洗脱液的前导部分占总洗脱 液的70%至75%。在又一个特定实施方案中，洗脱液的前导部分占 总洗脱液的75%至80%。在其它实施方案中，洗脱液的前导部分占 总洗脱液的70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、 79%或80%。在另一个实施方案中，洗脱液的前导部分(即所收集或 汇集的目标洗脱份)占不超过总洗脱液的70%。在一个特定实施方案 中，洗脱液的前导部分占总洗脱液的60%至70%。在另一个特定实 施方案中，洗脱液的前导部分占总洗脱液的50%至70%。在另一个 特定实施方案中，洗脱液的前导部分占总洗脱液的60%至65%。在 又一个特定实施方案中，洗脱液的前导部分占总洗脱液的65%至 70%。在其它实施方案中，洗脱液的前导部分占总洗脱液的60%、61%、 62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%或70%。在另一个 实施方案中，洗脱液的前导部分(即所收集或汇集的目标洗脱份)占不 超过总洗脱液的60%。在一个特定实施方案中，洗脱液的前导部分占 总洗脱液的50%至60%。在另一个特定实施方案中，洗脱液的前导 部分占总洗脱液的50%至55%。在又一个特定实施方案中，洗脱液 的前导部分占总洗脱液的55%至60%。在其它实施方案中，洗脱液 的前导部分占总洗脱液的50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、 57%、58%、59%或60%。在一个特定实施方案中，第一溶液条件的 pH为5.2±0.3。在另一个特定实施方案中，第一溶液条件的pH为 5.2±0.2。在另一个特定实施方案中，第一溶液条件的pH为5.2±0.1。 在又一个特定实施方案中，第一溶液条件的pH为5.2。在其它实施 方案中，第一溶液条件的pH为4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、 5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0。在另一个特定实施方案中，洗脱缓冲 液的电导率为至少20mS/cm。在又一个特定实施方案中，洗脱缓冲 液的电导率为至少22mS/cm。在又一个特定实施方案中，洗脱缓冲 液的电导率为至少25mS/cm。在一个优选实施方案中，阳离子交换 树脂为弱阳离子交换树脂。在一个特定实施方案中，弱阳离子交换树 脂为羧甲基(CM)树脂。

d.总洗脱液的体积

在另一个特别适合于大规模制造免疫球蛋白组合物的实施方案 中，洗脱液的前导部分和滞后部分被定义为洗脱液峰的体积与阳离子 交换柱的尺寸(例如设定数目的柱体积)的比率。通过预先确定以前导 部分收集的洗脱液体积，免疫球蛋白的回收率可加以严格控制并且可 再现。用于定义洗脱液的前导部分和滞后部分的这种方法特别适用于 需要最少步骤产率的制造工艺和根据免疫球蛋白产率降低的成本与 制造抗补体活性(ACA)含量降低的组合物的收益的权衡来作出决定 的工艺。以这种方式，可以大致相同产率将免疫球蛋白从一个制剂再 生式回收至下一个制剂中，不考虑制造轮次之间的微小差异。如实施 例11至13中所证明，应用这种收集方案可以高产率回收其中抗补体 活性含量降低的IgG免疫球蛋白组合物。

在一个实施方案中，前导部分的开始是通过基线吸光度定义。在 一些实施方案中，洗脱液峰的吸光度一旦跨越第一阈值时，就开始收 集前导部分。在一个实施方案中，当洗脱液的OD₂₈₀达到至少0.5AU 时，开始收集前导部分。在一个特定实施方案中，当洗脱液的OD₂₈₀达到至少1.0AU时，开始收集前导部分。在另一个特定实施方案中， 当洗脱液的OD₂₈₀达到至少1.5AU时，开始收集前导部分。在另一 个特定实施方案中，当洗脱液的OD₂₈₀达到至少2.0AU时，开始收 集前导部分。在其它特定实施方案中，当洗脱液的OD₂₈₀达到至少0.1 AU、0.2AU、0.3AU、0.4AU、0.5AU、0.6AU、0.7AU、0.8AU、 0.9AU、1.0AU、1.1AU、1.2AU、1.3AU、1.4AU、1.5AU、1.6AU、 1.7AU、1.8AU、1.9AU、2.0AU或大于2.0AU时，开始收集前导 部分。

在一些实施方案中，一旦开始收集前导部分，即先收集预定数目 个柱体积，随后切换为收集(或处置)洗脱液的滞后部分。在一个实施 方案中，以前导部分收集不超过5个柱体积(CV)的洗脱液。在另一个 实施方案中，前导部分收集中不超过4个CV的洗脱液。在另一个实 施方案中，前导部分收集中不超过3个CV的洗脱液。在另一个实施 方案中，前导部分收集中不超过2.7个CV的洗脱液。在另一个实施 方案中，前导部分收集中不超过2.5个CV的洗脱液。在另一个实施 方案中，前导部分收集中不超过2个CV的洗脱液。在另一个实施方 案中，前导部分收集中不超过1个CV的洗脱液。在其它实施方案中， 前导部分收集中不超过0.5个CV、0.6个CV、0.7个CV、0.8个CV、 0.9个CV、1.0个CV、1.1个CV、1.2个CV、1.3个CV、1.4个CV、 1.5个CV、1.6个CV、1.7个CV、1.8个CV、1.9个CV、2.0个CV、 2.1个CV、2.2个CV、2.3个CV、2.4个CV、2.5个CV、2.6个CV、 2.7个CV、2.8个CV、2.9个CV、3.0个CV、3.1个CV、3.2个CV、 3.3个CV、3.4个CV、3.5个CV、3.6个CV、3.7个CV、3.8个CV、 3.9个CV、4.0个CV、4.1个CV、4.2个CV、4.3个CV、4.4个CV、 4.5个CV、4.6个CV、4.7个CV、4.8个CV、4.9个CV、5.0个CV、 5.1个CV、5.2个CV、5.3个CV、5.4个CV、5.5个CV、5.6个CV、 5.7个CV、5.8个CV、5.9个CV、6.0个CV或大于6.0个柱体积的 洗脱液。

因此，在一个方面中，本发明提供一种降低血浆来源免疫球蛋白 组合物中的酰胺分解活性的量的方法，所述方法包括以下步骤：(a) 使IgG免疫球蛋白和抗补体活性(即具有抗补体活性的污染物)结合于 阳离子交换树脂上；(b)任选地用洗涤缓冲液洗涤结合有蛋白质的阳 离子交换树脂以除去松散缔合的污染物；(c)对IgG免疫球蛋白和ACA 执行单步洗脱；以及(d)分别收集洗脱液的前导部分和洗脱液的滞后 部分，其中洗脱液的前导部分由不超过4个柱体积(CV)的总洗脱液组 成。在一个特定实施方案中，洗脱液的前导部分为2.5个CV至3.0 个CV的总洗脱液。在另一个特定实施方案中，洗脱液的前导部分为 2.0个CV至3.0个CV的总洗脱液。在另一个特定实施方案中，洗脱 液的前导部分为2.0个CV至3.5个CV的总洗脱液。在另一个特定 实施方案中，洗脱液的前导部分为2.0个CV至4.0个CV的总洗脱 液。在又一个特定实施方案中，洗脱液的前导部分为2.5个CV至3.5 个CV的总洗脱液。在其它实施方案中，洗脱液的前导部分为0.5个 CV、0.6个CV、0.7个CV、0.8个CV、0.9个CV、1.0个CV、1.1 个CV、1.2个CV、1.3个CV、1.4个CV、1.5个CV、1.6个CV、 1.7个CV、1.8个CV、1.9个CV、2.0个CV、2.1个CV、2.2个CV、 2.3个CV、2.4个CV、2.5个CV、2.6个CV、2.7个CV、2.8个CV、 2.9个CV、3.0个CV、3.1个CV、3.2个CV、3.3个CV、3.4个CV、 3.5个CV、3.6个CV、3.7个CV、3.8个CV、3.9个CV、4.0个CV、 4.1个CV、4.2个CV、4.3个CV、4.4个CV、4.5个CV、4.6个CV、 4.7个CV、4.8个CV、4.9个CV、5.0个CV、5.1个CV、5.2个CV、 5.3个CV、5.4个CV、5.5个CV、5.6个CV、5.7个CV、5.8个CV、 5.9个CV或6.0个CV的总洗脱液。在一个优选实施方案中，阳离子 交换树脂为弱阳离子交换树脂。在一个特定实施方案中，弱阳离子交 换树脂为羧甲基(CM)树脂。

在一个特定实施方案中，本发明提供一种降低血浆来源免疫球蛋 白组合物中的抗补体活性(ACA)的量的方法，所述方法包括以下步 骤：(a)使包含IgG免疫球蛋白和第一量的ACA的血浆来源免疫球蛋 白组合物与安置在色谱柱中的阳离子交换树脂在包括pH不超过6.0 并且电导率不超过11mS/cm的第一溶液条件下接触，以便使免疫球 蛋白和至少一部分第一量的ACA与阳离子交换树脂结合；(b)通过使 阳离子交换树脂与包括pH为至少7.5并且电导率为至少15mS/cm的 洗脱缓冲液接触形成来洗脱液从而使免疫球蛋白从阳离子交换树脂 洗脱；以及(c)分别收集洗脱液的前导部分和洗脱液的滞后部分，其中 洗脱液的前导部分由不超过4个柱体积(CV)的总洗脱液组成。在一个 特定实施方案中，洗脱液的前导部分为2.5个CV至3.0个CV的总 洗脱液。在另一个特定实施方案中，洗脱液的前导部分为2.0个CV 至3.0个CV的总洗脱液。在另一个特定实施方案中，洗脱液的前导 部分为2.0个CV至3.5个CV的总洗脱液。在另一个特定实施方案 中，洗脱液的前导部分为2.0个CV至4.0个CV的总洗脱液。在又 一个特定实施方案中，洗脱液的前导部分为2.5个CV至3.5个CV 的总洗脱液。在其它实施方案中，洗脱液的前导部分为0.5个CV、 0.6个CV、0.7个CV、0.8个CV、0.9个CV、1.0个CV、1.1个CV、 1.2个CV、1.3个CV、1.4个CV、1.5个CV、1.6个CV、1.7个CV、 1.8个CV、1.9个CV、2.0个CV、2.1个CV、2.2个CV、2.3个CV、 2.4个CV、2.5个CV、2.6个CV、2.7个CV、2.8个CV、2.9个CV、 3.0个CV、3.1个CV、3.2个CV、3.3个CV、3.4个CV、3.5个CV、 3.6个CV、3.7个CV、3.8个CV、3.9个CV、4.0个CV、4.1个CV、 4.2个CV、4.3个CV、4.4个CV、4.5个CV、4.6个CV、4.7个CV、 4.8个CV、4.9个CV、5.0个CV、5.1个CV、5.2个CV、5.3个CV、 5.4个CV、5.5个CV、5.6个CV、5.7个CV、5.8个CV、5.9个CV 或6.0个CV的总洗脱液。在一个特定实施方案中，第一溶液条件的 pH为5.2±0.3。在另一个特定实施方案中，第一溶液条件的pH为 5.2±0.2。在另一个特定实施方案中，第一溶液条件的pH为5.2±0.1。 在又一个特定实施方案中，第一溶液条件的pH为5.2。在其它实施 方案中，第一溶液条件的pH为4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、 5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0。在另一个特定实施方案中，洗脱缓冲 液的电导率为至少20mS/cm。在又一个特定实施方案中，洗脱缓冲 液的电导率为至少22mS/cm。在又一个特定实施方案中，洗脱缓冲 液的电导率为至少25mS/cm。在一个优选实施方案中，阳离子交换 树脂为弱阳离子交换树脂。在一个特定实施方案中，弱阳离子交换树 脂为羧甲基(CM)树脂。

V.冷贫血浆的制备

用于制备浓缩IgG组合物的起始物质通常由回收的血浆(即已自 全血活体外分离的血浆)或源血浆(即经由血浆清除术收集的血浆)组 成。纯化工艺典型地以解冻先前冷冻的汇集血浆开始，出于安全和质 量的考虑，所述汇集血浆已加以分析。解冻典型地在不高于6℃、优 选介于-1℃与6℃之间的温度下进行。冷冻血浆在低温下完全解冻之 后，在冷却下(例如≤6℃，优选为2.5±3.5℃)执行离心，以便从液体上 清液中分离固体冷沉淀物。或者，可通过过滤而非离心来执行分离步 骤。接着，在下一步中处理已通过离心从刚刚解冻的血浆除去冷的不 溶性蛋白之后的液体上清液(又称为“冷贫血浆”)。此时，可采取各 种其它步骤以便分离因子VIII抑制剂旁路活性(FEIBA)、因子IX复 合物、因子VII浓缩物或抗凝血酶III复合物。举例来说，在对含有 免疫球蛋白的溶液进一步富集之前，可吸附冷贫血浆中的一种或多种 血液因子。

VI.冷贫血浆的分级分离

为了制备IgG免疫球蛋白组合物，通常对冷贫血浆进行分级分 离，以便将所需免疫球蛋白与存在的其它蛋白质和杂质分离。本领域 中已知多种用于分级分离血浆的方法，包括醇(例如乙醇)分级分离、 聚合物(例如PEG)沉淀、脂肪酸和酯(例如辛酸酯)沉淀、色谱和其类 似方法。这些分级分离方法的实例包括(但不限于)科恩分级分离法(J. Am.Chem.Soc.,1946,68(3):459-475；J.Am.Chem.Soc.72:465-474 (1950))、Oncley分级分离法(J.Am.Chem.Soc.,1949,71(2):541-550)、 Deutsch纯化法(J.Biol.Chem.164:109-118)、Hoppe纯化法(Munch  Med Wochenschr1967(34):1749-1752)、Falksveden纯化法(Swedish专 利第348942号)、Falksveden和Lundblad纯化法(Methods of Plasma  Protein Fractionation1980)、Lebing纯化法(Vox Sang2003 (84):193-201)、Tanaka纯化法(Braz J Med Biol Res2000(33)37-30))、 Teschner纯化法(Vox Sang,2007(92):42-55)、Nitschmann分级分离法 (Helv.Chim.Acta37:866-873)、Kistler/Nitschmann分级分离法(Vox  Sang.7:414-424(1962))、Barundern纯化法(Vox Sang.7:157-74 (1962))、Koblet纯化法(Vox Sang.13:93-102(1967))、美国专利第 5,122,373号或第5,177,194号中所公开的纯化程序、其修改程序以及 本领域中已知的类似或等效纯化程序，所述文献的公开内容以全文引 用的方式并入本文中用于所有目的。

一般而言，本文提供的方法适合上文所述的任何纯化方案。因而， 在一个实施方案中，根据上述任一种纯化方案将冷贫血浆部分或完全 分级分离。在一个特定实施方案中，根据上述教导中所公开的一个或 多个分级分离步骤对冷贫血浆进行分级分离，产生分级分离中间体组 合物。在一个更特定实施方案中，冷贫血浆被分级分离来产生洗脱份 I沉淀物、洗脱份II沉淀物、洗脱份I+II+III沉淀物、洗脱份II+III 沉淀物、洗脱份IV-1、Kistler-Nitschmann沉淀物A、Kistler-Nitschmann 沉淀物B或其被修饰沉淀物。

在一个优选实施方案中，通过一个或多个乙醇沉淀步骤分级分离 冷贫血浆。乙醇沉淀步骤可用于使所需免疫球蛋白从溶液沉淀出来， 同时使至少一种非免疫球蛋白蛋白质滞留于上清液中，或使至少一种 非免疫球蛋白蛋白质从溶液沉淀出来，同时使所要免疫球蛋白滞留于 上清液中。以这种方式分级分离免疫球蛋白的方法在本领域中已众所 周知。示例性乙醇沉淀物包括(但不限于)洗脱份I沉淀物、洗脱份 I+II+III沉淀物、洗脱份II+III沉淀物、洗脱份IV-1、Kistler-Nitschmann 沉淀物A、Kistler-Nitschmann沉淀物B以及其被修饰沉淀物。在一 个特别优选实施方案中，存在于冷贫血浆中的免疫球蛋白通过四步乙 醇法富集，所述四步乙醇法包括洗脱份I+II+III沉淀步骤、A沉淀步 骤、B沉淀步骤及洗脱份II沉淀步骤，如下文所述。

VII.示例性分级分离方案

虽然本领域技术人员将了解到可使用许多不同起始物质(例如不 同血浆洗脱份)执行本文提供的降低酰胺分解活性(例如因子XI和/或 因子XIa含量)和/或抗补体活性(ACA)的方法，但下文提供示例性分 级分离方案。示例性分级分离方案使用四个乙醇沉淀反应来制备洗脱 份II沉淀物，洗脱份II沉淀物可再混悬，并且随后用作本文提供的 方法的起始物质。所得富集的IgG免疫球蛋白组合物可通过下游处 理，使用如下技术进一步富集：阴离子交换色谱、超滤/渗滤、病毒 灭活和/或除去步骤，以及本领域中众所周知的其它富集步骤。

因此，在一个实施方案中，本发明提供一种制造IgG免疫球蛋白 组合物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供冷贫血浆洗脱份；(b) 通过将乙醇与冷贫血浆洗脱份以17%与23%(v/v)之间的最终浓度，在 6.5与7.3之间的pH和-8℃至-2℃之间的温度下混合，以便第一沉淀 反应使免疫球蛋白从冷贫血浆洗脱份中沉淀，从而形成第一沉淀物和 第一上清液；(c)使存在于第一沉淀物中的免疫球蛋白再混悬，从而形 成第一混悬液；(d)通过将乙醇与冷贫血浆洗脱份以17%与23%(v/v) 之间的最终浓度，在6.8与7.6之间的pH和-8℃至-2℃之间的温度下 混合，以便第二沉淀反应使免疫球蛋白从第一混悬液中沉淀，从而形 成第二沉淀物和第二上清液；(e)使存在于第二沉淀物中的免疫球蛋白 再混悬，从而形成第二混悬液；(f)通过将乙醇与冷贫血浆洗脱份以 14%与20%(v/v)之间的最终浓度，在5.0与5.8之间的pH和-8℃至-2℃ 之间的温度下混合，以便第三沉淀反应使免疫球蛋白从第二混悬液中 沉淀，从而形成第三沉淀物和第三上清液；(g)通过将乙醇与冷贫血 浆洗脱份以22%与28%(v/v)之间的最终浓度，在6.7与7.5之间的pH 和-8℃至-2℃之间的温度下混合，以便第四沉淀反应使免疫球蛋白从 第三上清液中沉淀，从而形成第四沉淀物和第四上清液；(h)使第四 沉淀物再混悬，以便形成第三混悬液；(i)使第三混悬液与安置在色谱 柱中的阳离子交换树脂在包括pH不超过6.0并且电导率不超过11 mS/cm的第一溶液条件下接触，以便使IgG免疫球蛋白和以下至少一 者与阳离子交换树脂结合：(i)一部分FXI和/或FXIa，和(ii)第一量的 抗补体活性(ACA)；(j)通过使阳离子交换树脂与包括pH为至少7.5 并且电导率为至少15mS/cm的洗脱缓冲液接触，以便形成包含前导 部分和滞后部分的洗脱液来使IgG免疫球蛋白从阳离子交换树脂洗 脱；以及(k)分别收集洗脱液的前导部分和洗脱液的滞后部分。在一 个特定实施方案中，第一溶液条件的pH为5.2±0.3。在另一个特定实 施方案中，第一溶液条件的pH为5.2±0.2。在另一个特定实施方案中， 第一溶液条件的pH为5.2±0.1。在又一个特定实施方案中，第一溶液 条件的pH为5.2。在其它实施方案中，第一溶液条件的pH为4.8、 4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0。在另 一个特定实施方案中，洗脱缓冲液的电导率为至少20mS/cm。在又 一个特定实施方案中，洗脱缓冲液的电导率为至少22mS/cm。在又 一个特定实施方案中，洗脱缓冲液的电导率为至少25mS/cm。在一 个优选实施方案中，阳离子交换树脂为弱阳离子交换树脂。在一个特 定实施方案中，弱阳离子交换树脂为羧甲基(CM)树脂。

A.上游分级分离方案I

在第一示例性上游纯化方案中，如下文所述对含有IgG免疫球蛋 白的血浆进行醇分级分离(例如乙醇分级分离)。在一个实施方案中， 第一上游分级分离方案包括洗脱份I+II+III沉淀步骤、洗脱份A沉淀 步骤以及先为洗脱份B沉淀步骤、随后为洗脱份II沉淀步骤，从而 最终向本文提供的用于降低酰胺分解活性(例如因子XI/XIa)和/或抗 补体活性(ACA)的阳离子交换色谱方法提供起始物质。

涵盖含有洗脱份I+II+III、洗脱份A、洗脱份B和洗脱份II沉淀 步骤中每一个的沉淀条件(例如乙醇浓度、pH、温度、分离技术)的所 有组合的方法。此外，涵盖包含特定沉淀条件的所有组合的方法以及 用于定义和收集洗脱液的前导部分的所有可能方案，如下文所述。

1.洗脱份I+II+III沉淀

在一个实施方案中，洗脱份I+II+III沉淀是通过在6.5与7.3之间 的pH下以17%与23%(v/v)之间的最终浓度向冷贫血浆中添加乙醇来 形成。接着，在-8℃至-2℃下搅拌的同时孵育混合物。通过离心或过 滤混合物可将所得洗脱份I+II+III沉淀物与洗脱份I+II+III上清液分 离，这通常是在冷却下执行。免疫球蛋白内容物大部分存在于洗脱份 I+II+III沉淀物中，所述沉淀物可再混悬并且可进一步富集。

在一个特定实施方案中，在洗脱份I+II+III沉淀步骤中，乙醇的 最终浓度为20±3%(v/v)。在另一个实施方案中，乙醇的最终浓度为 20±2%(v/v)。在另一个实施方案中，乙醇的最终浓度为20±1%(v/v)。 在又一个实施方案中，乙醇的最终浓度为20%(v/v)。在其它实施方案 中，乙醇的最终浓度为17%、18%、19%、20%、21%、22%或23%(v/v)。

在一个特定实施方案中，洗脱份I+II+III沉淀步骤中的pH为 6.9±0.4。在另一个实施方案中，洗脱份I+II+III沉淀步骤中的pH为 6.9±0.3。在另一个实施方案中，洗脱份I+II+III沉淀步骤中的pH为 6.9±0.2。在另一个实施方案中，洗脱份I+II+III沉淀步骤中的pH为 6.9±0.1。在又一个实施方案中，洗脱份I+II+III沉淀步骤中的pH为 6.9。在其它实施方案中，洗脱份I+II+III沉淀步骤中的pH为6.5、6.6、 6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2或7.3。

在一个特定实施方案中，洗脱份I+II+III沉淀步骤中的温度为 -5±3℃。在另一个实施方案中，洗脱份I+II+III沉淀步骤中的温度为 -5±2℃。在另一个实施方案中，洗脱份I+II+III沉淀步骤中的温度为 -5±1℃。在又一个实施方案中，洗脱份I+II+III沉淀步骤中的温度为 -5℃。在其它实施方案中，洗脱份I+II+III沉淀步骤中的温度为-8℃、 -7℃、-6℃、-5℃、-4℃、-3℃或-2℃。

在一个特定实施方案中，通过添加含有三水合乙酸钠、冰乙酸和 注射用水(pH4.0)的再混悬缓冲液和变性乙醇(式SDA-3A)将冷贫血 浆调节至6.9±0.2的pH和计算为20%(v/v)的醇浓度。缓冲液在充分 混合下添加有所需量的醇。醇在添加至冷贫血浆中的前冷却至-15℃ 或低于-15℃的温度。向血浆中添加缓冲液和醇，同时将混悬液槽冷 却至-5±2℃的温度。完成添加之后，检查溶液的pH并且必要时用pH 4.0缓冲液或碳酸氢钠溶液调节至6.9±0.2。所得洗脱份I+II+III混悬 液接着离心以便使沉淀物与上清液分离。

2.洗脱份A沉淀

为进一步富集IgG含量和纯度，在一个实施方案中，使洗脱份 I+II+III沉淀物再混悬并且执行第二沉淀步骤(洗脱份A沉淀)。通过 在6.8与7.6之间的pH下向洗脱份I+II+III混悬液中添加乙醇至最终 浓度介于17%与23%(v/v)之间来执行洗脱份A沉淀。接着，在-8℃至 -2℃下搅拌的同时孵育混合物。通过离心或过滤混合物可将所得洗脱 份A沉淀物与洗脱份A上清液分离，这通常是在冷却下执行。免疫 球蛋白内容物大部分存在于洗脱份A沉淀物中，所述沉淀物可再混 悬并且可进一步富集。

在一个特定实施方案中，在洗脱份A沉淀步骤中，乙醇的最终 浓度为20±3%(v/v)。在另一个实施方案中，乙醇的最终浓度为 20±2%(v/v)。在另一个实施方案中，乙醇的最终浓度为20±1%(v/v)。 在又一个实施方案中，乙醇的最终浓度为20%(v/v)。在其它实施方案 中，乙醇的最终浓度为17%、18%、19%、20%、21%、22%或23%(v/v)。

在一个特定实施方案中，洗脱份A沉淀步骤中的pH为7.2±0.4。 在另一个实施方案中，洗脱份A沉淀步骤中的pH为7.2±0.3。在另 一个实施方案中，洗脱份A沉淀步骤中的pH为7.2±0.2。在另一个 实施方案中，洗脱份A沉淀步骤中的pH为7.2±0.1。在又一个实施 方案中，洗脱份A沉淀步骤中的pH为7.2。在其它实施方案中，洗 脱份A沉淀步骤中的pH为6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5 或7.6。

在一个特定实施方案中，洗脱份A沉淀步骤中的温度为-5±3℃。 在另一个实施方案中，洗脱份A沉淀步骤中的温度为-5±2℃。在另一 个实施方案中，洗脱份A沉淀步骤中的温度为-5±1℃。在又一个实施 方案中，洗脱份A沉淀步骤中的温度为-5℃。在其它实施方案中，洗 脱份A沉淀步骤中的温度为-8℃、-7℃、-6℃、-5℃、-4℃、-3℃或-2℃。

在一个特定实施方案中，将洗脱份I+II+III沉淀物混悬于含有三 水合乙酸钠、冰乙酸和注射用水(pH4.0)的再混悬冷缓冲液中并且混 合。混悬液用WFI稀释来实现1.0±0.3%(w/v)的计算蛋白质浓度。连 续搅拌直至混悬液均匀。溶液用缓冲液(pH4.0)或用0.25M磷酸二钠 调节至pH为7.2±0.2并且实现20%(v/v)的计算醇浓度。醇在添加至 溶液中的前冷却至-15℃或低于-15℃的温度。在将槽冷却至-5±2℃的 同时添加冷醇。添加完成之后，检验混悬液的pH并且必要时调节至 7.2±0.2。接着，过滤所形成的沉淀物(称为洗脱份A沉淀物)，以便使 沉淀物与上清液分离。

3.洗脱份B沉淀

为进一步富集IgG含量和纯度，在一个实施方案中，使洗脱份A 沉淀物再混悬并且执行第三沉淀步骤(洗脱份B沉淀)。通过在5.0与 5.8之间的pH下向洗脱份A混悬液中添加乙醇直至最终浓度介于 14%与20%(v/v)之间来执行洗脱份B沉淀。接着，在-8℃至-2℃下搅 拌的同时孵育混合物。通过离心或过滤混合物可将所得洗脱份B沉 淀物与洗脱份B上清液分离，这通常是在冷却下执行。免疫球蛋白 内容物大部分存在于洗脱份B上清液中，所述沉淀物可回收并且可 进一步富集。

在一个特定实施方案中，在洗脱份B沉淀步骤中，乙醇的最终 浓度为17±3%(v/v)。在另一个实施方案中，乙醇的最终浓度为 17±2%(v/v)。在另一个实施方案中，乙醇的最终浓度为17±1%(v/v)。 在又一个实施方案中，乙醇的最终浓度为17%(v/v)。在其它实施方案 中，乙醇的最终浓度为14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%(v/v)。

在一个特定实施方案中，洗脱份B沉淀步骤中的pH为5.4±0.4。 在另一个实施方案中，洗脱份B沉淀步骤中的pH为5.4±0.3。在另 一个实施方案中，洗脱份B沉淀步骤中的pH为5.4±0.2。在另一个 实施方案中，洗脱份B沉淀步骤中的pH为5.4±0.1。在又一个实施 方案中，洗脱份B沉淀步骤中的pH为5.4。在其它实施方案中，洗 脱份B沉淀步骤中的pH为5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7 或5.8。

在一个特定实施方案中，洗脱份A沉淀步骤中的温度为-5±3℃。 在另一个实施方案中，洗脱份A沉淀步骤中的温度为-5±2℃。在另一 个实施方案中，洗脱份A沉淀步骤中的温度为-5±1℃。在又一个实施 方案中，洗脱份A沉淀步骤中的温度为-5℃。在其它实施方案中，洗 脱份A沉淀步骤中的温度为-8℃、-7℃、-6℃、-5℃、-4℃、-3℃或-2℃。

在一个特定实施方案中，将洗脱份A沉淀物混悬于冷的注射用 水(WFI)中并搅拌至少一小时。当沉淀物充分混悬时，添加含有乙酸 钠的缓冲液。连续搅拌直至混悬液均匀。用pH4.0缓冲液(109g/L三 水合乙酸钠、240g/L冰乙酸WFI)或0.25M磷酸二钠将pH值调节至 5.4±0.2。混悬液用计算来实现1.2±0.3%(w/v)的蛋白质浓度的冷WFI 稀释。连续搅拌直至混悬液均匀。通过添加预冷却至-15℃或低于-15℃ 的醇来使醇含量达到17%(v/v)的计算浓度。在将槽冷却至-5±2℃的同 时添加冷醇。必要时，用pH4.0缓冲液或0.25M磷酸二钠将pH值 再调节至5.4±0.2。通过使用深度过滤器过滤来分离所形成的沉淀物， 即洗脱份B沉淀物。回收洗脱份B滤液(即上清液)用于进一步富集。

B.上游分级分离方案II

在第二示例性上游纯化方案中，如下文所述对含有IgG免疫球蛋 白的血浆进行醇分级分离(例如乙醇分级分离)。在一个实施方案中， 第一上游分级分离方案包括洗脱份I沉淀步骤和洗脱份II+III沉淀步 骤，随后为洗脱份II沉淀步骤，从而最终向本文提供的用于降低酰 胺分解活性(例如因子XI/XIa)和/或抗补体活性(ACA)的阳离子交换 色谱方法提供起始物质。

涵盖含有下述洗脱份I、洗脱份II+III和洗脱份II沉淀步骤每一 者的沉淀条件(例如乙醇浓度、pH、温度、分离技术)的所有组合的方 法。此外，涵盖含有特定沉淀条件的所有组合的方法以及用于定义及 收集洗脱液的前导部分的所有可能方案，如下文所述。

1.洗脱份I沉淀

在一个实施方案中，洗脱份I沉淀是通过在6.7至7.3的pH下以 6%至10%(v/v)的最终浓度向冷贫血浆中添加乙醇来形成。接着，在 -4℃至2℃下搅拌的同时孵育混合物。通过离心或过滤混合物可将所 得洗脱份I沉淀物与洗脱份I上清液分离，这通常是在冷却下执行。 免疫球蛋白内容物大部分存在于洗脱份I上清液中，所述沉淀物可回 收并可进一步富集。

在一个特定实施方案中，在洗脱份I沉淀步骤中，乙醇的最终浓 度为8±2%(v/v)。在另一个实施方案中，乙醇的最终浓度为8±1%(v/v)。 在又一个实施方案中，乙醇的最终浓度为8%(v/v)。在其它实施方案 中，乙醇的最终浓度为6%、7%、8%、9%或10%(v/v)。

在一个特定实施方案中，洗脱份I沉淀步骤中的pH为7.0±0.4。 在另一个实施方案中，洗脱份I沉淀步骤中的pH为7.0±0.3。在另一 个实施方案中，洗脱份I沉淀步骤中的pH为7.0±0.2。在另一个实施 方案中，洗脱份I沉淀步骤中的pH为7.0±0.1。在又一个实施方案中， 洗脱份I沉淀步骤中的pH为7.0。在其它实施方案中，洗脱份I沉淀 步骤中的pH为6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2或7.3。

在一个特定实施方案中，洗脱份I沉淀步骤中的温度为-1±3℃。 在另一个实施方案中，洗脱份I沉淀步骤中的温度为-1±2℃。在另一 个实施方案中，洗脱份I沉淀步骤中的温度为-1±1℃。在又一个实施 方案中，洗脱份I沉淀步骤中的温度为-1℃。在其它实施方案中，洗 脱份I沉淀步骤中的温度为-4℃、-3℃、-2℃、-1℃、0℃、1℃或2℃。

在一个特定实施方案中，冷贫血浆被调节至7.0±0.1的pH和计 算为8%(v/v)的醇浓度。在充分混合下添加用于调节pH和醇浓度的 溶液。降低沉淀反应的温度并且始终保持在-1±1℃。所得洗脱份I混 悬液接着离心或过滤以使沉淀物与上清液分离。

2.洗脱份II+III沉淀

为进一步富集IgG含量和纯度，在一个实施方案中，使用洗脱份 I上清液作为第二沉淀步骤(洗脱份II+III沉淀)的物质。洗脱份II+III 沉淀是通过在6.7与7.3之间的pH下向洗脱份I上清液中添加乙醇直 至最终浓度为22%至28%(v/v)来执行。接着，在-10℃至-4℃下搅拌的 同时孵育混合物。通过离心或过滤混合物可将所得洗脱份II+III沉淀 物与洗脱份II+III上清液分离，这通常是在冷却下执行。免疫球蛋白 内容物大部分存在于洗脱份II+III沉淀物中，所述沉淀物可再混悬且 可进一步富集。

在一个特定实施方案中，在洗脱份II+III沉淀步骤中，乙醇的最 终浓度为25±3%(v/v)。在另一个实施方案中，乙醇的最终浓度为 25±2%(v/v)。在另一个实施方案中，乙醇的最终浓度为25±1%(v/v)。 在又一个实施方案中，乙醇的最终浓度为25%(v/v)。在其它实施方案 中，乙醇的最终浓度为22%、23%、24%、25%、26%、27%或28%(v/v)。

在一个特定实施方案中，洗脱份II+III沉淀步骤中的pH为 7.0±0.4。在另一个实施方案中，洗脱份II+III沉淀步骤中的pH为 7.0±0.3。在另一个实施方案中，洗脱份II+III沉淀步骤中的pH为 7.0±0.2。在另一个实施方案中，洗脱份II+III沉淀步骤中的pH为 7.0±0.1。在又一个实施方案中，洗脱份II+III沉淀步骤中的pH为7.0。 在其它实施方案中，洗脱份II+III沉淀步骤中的pH为6.6、6.7、6.8、 6.9、7.0、7.1、7.2、7.3或7.4。

在一个特定实施方案中，洗脱份II+III沉淀步骤中的温度为 -7±3℃。在另一个实施方案中，洗脱份II+III沉淀步骤中的温度为 -7±2℃。在另一个实施方案中，洗脱份II+III沉淀步骤中的温度为 -7±1℃。在又一个实施方案中，洗脱份II+III沉淀步骤中的温度为-7℃。 在其它实施方案中，洗脱份II+III沉淀步骤中的温度为-10℃、-9℃、 -8℃、-7℃、-6℃、-5℃或-4℃。

在一个特定实施方案中，洗脱份I上清液被调节至7.0±0.1的pH 和计算为25%(v/v)的醇浓度。在充分混合下添加用于调节pH和醇浓 度的溶液。降低沉淀反应的温度并始终保持在-6±2℃。所得洗脱份 II+III混悬液接着离心或过滤以使沉淀物与上清液分离。

C.洗脱份II沉淀

为进一步富集IgG含量和纯度，在一个实施方案中，执行第四(按 照上游分级分离方案I)或第三(按照上游分级分离方案II)醇沉淀步骤 (洗脱份II沉淀)。洗脱份II沉淀是通过将洗脱份B滤液或洗脱份II+III 沉淀物混悬液的pH调节至介于6.7与7.5之间并添加乙醇直至最终 浓度介于22%与28%(v/v)之间来执行。接着，在-13℃至-2℃下搅拌的 同时孵育混合物。通过离心或过滤混合物可将所得洗脱份II沉淀物 与洗脱份B上清液分离，这通常是在冷却下执行。免疫球蛋白内容 物大部分存在于洗脱份II沉淀物中，所述沉淀物可再混悬且可进一 步富集。

在一个特定实施方案中，在洗脱份II沉淀步骤中，乙醇的最终 浓度为25±3%(v/v)。在另一个实施方案中，乙醇的最终浓度为 25±2%(v/v)。在另一个实施方案中，乙醇的最终浓度为25±1%(v/v)。 在又一个实施方案中，乙醇的最终浓度为25%(v/v)。在其它实施方案 中，乙醇的最终浓度为22%、23%、24%、25%、26%、27%或28%(v/v)。

在一个特定实施方案中，洗脱份II沉淀步骤中的pH为7.1±0.4。 在另一个实施方案中，洗脱份II沉淀步骤中的pH为7.1±0.3。在另 一个实施方案中，洗脱份II沉淀步骤中的pH为7.1±0.2。在另一个 实施方案中，洗脱份II沉淀步骤中的pH为7.1±0.1。在又一个实施 方案中，洗脱份II沉淀步骤中的pH为7.1。在其它实施方案中，洗 脱份II沉淀步骤中的pH为6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4 或7.5。

在一个特定实施方案中，洗脱份II沉淀步骤中的温度为-5±3℃。 在另一个实施方案中，洗脱份II沉淀步骤中的温度为-5±2℃。在另一 个实施方案中，洗脱份II沉淀步骤中的温度为-5±1℃。在又一个实施 方案中，洗脱份II沉淀步骤中的温度为-5℃。在另一个特定实施方案 中，洗脱份II沉淀步骤中的温度为-10±3℃。在另一个实施方案中， 洗脱份II沉淀步骤中的温度为-10±2℃。在另一个实施方案中，洗脱 份II沉淀步骤中的温度为-10±1℃。在又一个实施方案中，洗脱份II 沉淀步骤中的温度为-10℃。在其它实施方案中，洗脱份II沉淀步骤 中的温度为-13℃、-12℃、-11℃、-10℃、-9℃、-8℃、-7℃、-6℃、-5℃、 -4℃、-3℃或-2℃。

在一个特定实施方案中，洗脱份B滤液的pH是使用1.0M碳酸 氢钠溶液调节至7.1±0.2。在混合下添加额外的醇以使计算浓度达到 25%(v/v)。检查pH并且必要时使用1M碳酸氢钠或pH4.0缓冲液再 调节至7.3±0.2。完成醇添加之后，在-5±2℃的温度下搅拌混悬液至少 2小时。完成搅拌之后，必要时将pH再调节至7.3±0.2。将混悬液离 心并且分离沉淀物，即洗脱份II沉淀物。

D.阳离子交换色谱

为进一步富集免疫球蛋白组合物，在一个实施方案中，可将洗脱 份II沉淀物再混悬于水或低离子强度缓冲液中并且进行阳离子交换 色谱。在一个实施方案中，将洗脱份II沉淀物再混悬于pH低于6.0 的水或低离子强度缓冲液中。典型地，再混悬洗脱份II沉淀物的pH 为5.2±0.2并且混悬液的电导率较低，典型地不超过1mS/cm。接着 过滤洗脱份II混悬液以除去非溶解性物质，随后装载于在低于6.0的 pH下平衡的阳离子交换树脂上。将免疫球蛋白装载于阳离子交换树 脂(例如阳离子交换柱)上之后，可用pH低于6.0的洗涤缓冲液洗涤树 脂。为洗脱免疫球蛋白，接着使阳离子交换树脂与电导率为至少15 mS/cm(例如至少150mM NaCl或其等效盐的盐浓度)并且pH大于7.0 的洗脱缓冲液接触。在一个特定实施方案中，对混悬洗脱份II沉淀 物进行溶剂和清洁剂(S/D)处理，随后执行阳离子交换色谱。虽然使 用本文提出的示例性分级分离方案中的再混悬洗脱份II沉淀物作为 本文提供的阳离子交换方法的起始物质，但应了解，含有IgG免疫球 蛋白和酰胺分解活性(例如FXI和/或FXIa)和/或抗补体活性(ACA)的 任何血浆来源免疫球蛋白组合物(即洗脱份)可用于本文提供的方法 中。

已发现，可将高含量的酰胺分解活性(例如FXI和/或FXIa)和/或 抗补体活性(ACA)与IgG一起从阳离子交换树脂共洗脱。不能将大量 这些杂质与所需免疫球蛋白分离导致最终IgG组合物具有高酰胺分 解活性和/或高抗补体活性。鉴于血栓栓塞事件的风险增大归结于医 药免疫球蛋白制剂中的高酰胺分解活性，并且不良反应与抗补体活性 有关，因此在本领域中仍需要除去导致许多IgG产品中存在酰胺分解 活性(例如FXI/FXIa)和/或抗补体活性(ACA)的杂质。有利的是，已发 现当使用pH超过7.0的缓冲液从阳离子交换树脂洗脱免疫球蛋白时， 酰胺分解活性和抗补体活性(ACA)仅于洗脱液的滞后部分中洗脱出。 酰胺分解活性和ACA于洗脱液的滞后部分中洗脱显著地对应于洗脱 液的pH从低于6.0移位到7.0以上。因而，洗脱液的前导部分含有 高浓度的免疫球蛋白和低浓度的酰胺分解活性以及ACA，而洗脱液 的滞后部分具有较低浓度的免疫球蛋白和较高酰胺分解活性以及 ACA。因此，在本文提供的方法的优选实施方案中，分别收集阳离子 交换洗脱液的前导部分和洗脱液的滞后部分。

在某些实施方案中，阳离子交换树脂为弱阳离子交换树脂。示例 性弱阳离子交换树脂包括具有羧酸配位体的树脂，例如羧甲基(CM) 树脂。在一个优选实施方案中，本文提供的方法中使用的阳离子交换 树脂为羧甲基树脂，例如CM琼脂糖。

在一个实施方案中，使洗脱份II沉淀物再混悬于pH介于4.8与 5.6之间的冷水或低离子强度缓冲液中。在一个特定实施方案中，用 于再混悬的水或缓冲液的pH值为5.2±0.3。在另一个特定实施方案中， 用于再混悬的水或缓冲液的pH值为5.2±0.2。在另一个特定实施方案 中，用于再混悬的水或缓冲液的pH值为5.2±0.1。在又一个特定实施 方案中，用于再混悬的水或缓冲液的pH值为5.2。在其它实施方案 中，用于再混悬的水或缓冲液的pH值为4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、 5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0。

在一个实施方案中，阳离子交换树脂被预平衡至介于4.6与5.6 之间的pH。在一个特定实施方案中，树脂被预平衡至介于4.6与5.5 之间的pH。在另一个特定实施方案中，树脂被预平衡至pH5.0±0.4。 在另一个特定实施方案中，树脂被预平衡至pH5.0±0.3。在另一个特 定实施方案中，树脂被预平衡至pH5.0±0.2。在另一个特定实施方案 中，树脂被预平衡至pH5.0±0.1。在另一个特定实施方案中，树脂被 预平衡至pH5.0。在其它实施方案中，树脂被预平衡至pH4.6、4.7、 4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0。

在一个实施方案中，将澄清的洗脱份II混悬液装载于阳离子交 换树脂上之后，用电导率低得足以使免疫球蛋白不能从树脂洗脱并且 pH介于5.1与5.9之间的缓冲液洗涤树脂。在一个特定实施方案中， 洗涤缓冲液的pH为5.5±0.3。在另一个特定实施方案中，洗涤缓冲液 的pH为5.5±0.2。在另一个特定实施方案中，洗涤缓冲液的pH为 5.5±0.1。在另一个特定实施方案中，洗涤缓冲液的pH为5.5。在其 它实施方案中，洗涤缓冲液的pH为5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、 5.6、5.7、5.8、5.9或6.0。

在一个实施方案中，洗脱缓冲液的pH大于7.5。在另一个实施 方案中，洗脱缓冲液的pH介于7.4与8.2之间。在一个特定实施方 案中，洗脱缓冲液的pH为7.8±0.3。在另一个特定实施方案中，洗脱 缓冲液的pH为7.8±0.2。在另一个特定实施方案中，洗脱缓冲液的 pH为7.8±0.1。在另一个特定实施方案中，洗脱缓冲液的pH为7.8。 在其它实施方案中，洗脱缓冲液的pH为7.0、7.1、7.2、7.36、7.4、 7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4或8.5。

在一个特定实施方案中，洗脱缓冲液的电导率为至少10mS/cm。 在一个优选实施方案中，洗脱缓冲液的电导率为至少15mS/cm。在 另一个优选实施方案中，洗脱缓冲液的电导率为至少20mS/cm。在 一个特定实施方案中，洗脱缓冲液的电导率介于10mS/cm与40 mS/cm之间。在另一个实施方案中，洗脱缓冲液的电导率介于15 mS/cm与30mS/cm之间。在另一个实施方案中，洗脱缓冲液的电导 率介于20mS/cm与30mS/cm之间。在另一个实施方案中，洗脱缓 冲液的电导率介于25mS/cm与30mS/cm之间。在其它实施方案中， 洗脱缓冲液的电导率为约5mS/cm或约6mS/cm、7mS/cm、8mS/cm、 9mS/cm、10mS/cm、11mS/cm、12mS/cm、13mS/cm、14mS/cm、 15mS/cm、16mS/cm、17mS/cm、18mS/cm、19mS/cm、20mS/cm、 21mS/cm、22mS/cm、23mS/cm、24mS/cm、25mS/cm、26mS/cm、 27mS/cm、28mS/cm、29mS/cm、30mS/cm、31mS/cm、32mS/cm、 33mS/cm、34mS/cm、35mS/cm、36mS/cm、37mS/cm、38mS/cm、 39mS/cm、40mS/cm或高于40mS/cm。

在一个实施方案中，洗脱液的前导部分(即所收集或汇集的目标 洗脱份)占不超过总洗脱液的80%。在一个特定实施方案中，洗脱液 的前导部分占总洗脱液的70%至80%。在另一个特定实施方案中， 洗脱液的前导部分占总洗脱液的60%至80%。在另一个特定实施方 案中，洗脱液的前导部分占总洗脱液的50%至80%。在另一个特定 实施方案中，洗脱液的前导部分占总洗脱液的70%至75%。在又一 个特定实施方案中，洗脱液的前导部分占总洗脱液的75%至80%。 在其它实施方案中，洗脱液的前导部分占总洗脱液的70%、71%、72%、 73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%或80%。

在另一个实施方案中，洗脱液的前导部分(即所收集或汇集的目 标洗脱份)占不超过总洗脱液的70%。在一个特定实施方案中，洗脱 液的前导部分占总洗脱液的60%至70%。在另一个特定实施方案中， 洗脱液的前导部分占总洗脱液的50%至70%。在另一个特定实施方 案中，洗脱液的前导部分占总洗脱液的60%至65%。在又一个特定 实施方案中，洗脱液的前导部分占总洗脱液的65%至70%。在其它 实施方案中，洗脱液的前导部分占总洗脱液的60%、61%、62%、63%、 64%、65%、66%、67%、68%、69%或70%。

在另一个实施方案中，洗脱液的前导部分(即所收集或汇集的目 标洗脱份)占不超过总洗脱液的60%。在一个特定实施方案中，洗脱 液的前导部分占总洗脱液的50%至60%。在另一个特定实施方案中， 洗脱液的前导部分占总洗脱液的50%至55%。在又一个特定实施方 案中，洗脱液的前导部分占总洗脱液的55%至60%。在其它实施方 案中，洗脱液的前导部分占总洗脱液的50%、51%、52%、53%、54%、 55%、56%、57%、58%、59%或60%。

在另一个实施方案中，洗脱液的前导部分和滞后部分是根据溶液 的pH定义。在一个实施方案中，前导部分为pH不超过7.0的洗脱 液。在另一个实施方案中，前导部分为pH不超过6.5的洗脱液。在 另一个实施方案中，前导部分为pH不超过6.0的洗脱液。在另一个 实施方案中，前导部分为pH不超过5.5的洗脱液。在另一个实施方 案中，前导部分为pH不超过5.0的洗脱液。在其它实施方案中，前 导部分为具有以下pH的洗脱液：不超过7.0、6.9、6.8、6.7、6.6、 6.5、6.4、6.3、6.2、6.1、6.0、5.9、5.8、5.7、5.6、5.5、5.4、5.3、 5.2、5.1、5.0或小于5.0。

在一个实施方案中，洗脱液的前导部分被定义为洗脱液的OD₂₈₀下降低于2.0AU之前从阳离子交换树脂洗脱的洗脱液的洗脱份。在 另一个实施方案中，洗脱液的前导部分被定义为洗脱液的OD₂₈₀下降 低于1.5AU之前从阳离子交换树脂洗脱的洗脱液的洗脱份。在另一 个实施方案中，洗脱液的前导部分被定义为洗脱液的OD₂₈₀下降低于 1.0AU之前从阳离子交换树脂洗脱的洗脱液的洗脱份。在另一个实 施方案中，洗脱液的前导部分被定义为洗脱液的OD₂₈₀下降低于0.5 AU之前从阳离子交换树脂洗脱的洗脱液的洗脱份。在其它实施方案 中，洗脱液的前导部分被定义为洗脱液的OD₂₈₀下降低于2.0AU、1.9 AU、1.8AU、1.7AU、1.6AU、1.5AU、1.4AU、1.3AU、1.2AU、 1.1AU、1.0AU、0.9AU、0.8AU、0.7AU、0.6AU、0.5AU、0.4AU、 0.3AU、0.2AU、0.1AU或小于0.1AU之前从阳离子交换树脂洗脱 的洗脱液的洗脱份。在某些实施方案中，洗脱液的前导部分另外被定 义为洗脱液的OD₂₈₀上升超过阈值(例如0.1AU、0.2AU、0.3AU、 0.4AU、0.5AU、0.6AU、0.7AU、0.8AU、0.9AU、1.0AU、1.1AU、 1.2AU、1.3AU、1.4AU、1.5AU、1.6AU、1.7AU、1.8AU、1.9AU、 2.0AU或大于2.0AU)之后从阳离子交换树脂洗脱的洗脱液部分。

E.超滤/渗滤(UF/DF)

IgG组合物可另外通过超滤/渗滤浓缩。在一个实施方案中，IgG 组合物可通过超滤浓缩至蛋白质浓度介于2%与10%(w/v)之间。在某 些实施方案中，在具有开孔通道筛的暗匣中进行超滤并且超滤膜具有 不超过100kDa或不超过90kDa、80kDa、70kDa、60kDa、50kDa、 40kDa、30kDa或小于30kDa的标称分子量截断(NMWCO)。在一个 优选实施方案中，超滤膜具有不超过50kDa的NMWCO。

如美国专利申请公布第2010/0330071号中所述(所述文献的内容 以全文引用的方式并入本文中用于所有目的)，开孔通道膜可以特别 设计的后洗涤和配制方式在生产工艺快结束时使用，以便使得所得 IgG组合物中的蛋白质浓度(200mg/mL)高达现有技术IVIG(例如 LIQUID)的约2倍而不会影响产率和存放稳定性。 大部分市售超滤膜无法在不损失大量蛋白质的情况下达到200 mg/mL IgG的浓度。这些膜在早期就被阻塞，并且因此难以实现充分 的后洗涤。因此，必须使用开孔通道膜组态。即便使用开孔通道膜， 还是须使用经特别设计的后洗涤程序来获得所需浓度而无显著蛋白 质损失(小于2%损失)。更惊人的是，200mg/mL的较高蛋白质浓度 对低pH值存放步骤的病毒灭活能力无影响。

超滤步骤完成之后，即可经由对于适于静脉内或肌肉内施用的溶 液进行的渗滤来将浓缩物进一步浓缩。在某些实施方案中，渗滤溶液 可包含稳定剂和/或缓冲剂。在一个优选实施方案中，稳定剂和缓冲 剂为适当浓度(例如0.20M至0.30M，或0.22M至0.28M，或0.24M 至0.26mM，或2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或 3.0的浓度)的甘氨酸。在一个优选实施方案中，渗滤缓冲液含有0.25 M甘氨酸。

典型地，最小交换体积为最初浓缩物体积的至少约3倍或为最初 浓缩物体积的至少4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或超过9倍。 IgG溶液可浓缩至以下的最终蛋白质浓度：介于3%与25%(w/v)之间， 或介于3%与7%之间，或介于6%与18%(w/v)之间，或介于7%与 16%(w/v)之间，或介于8%与14%(w/v)之间，或介于9%与12%之间， 或至最终浓度为5%或6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、 14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、 25%或高于25%。在一个实施方案中，在不向浓缩溶液中添加后洗涤 洗脱份的情况下实现至少23%的最终蛋白质浓度。在另一个实施方案 中，在不向浓缩溶液中添加后洗涤洗脱份的情况下实现至少24%的最 终蛋白质浓度。在又一个实施方案中，在不向浓缩溶液中添加后洗涤 洗脱份的情况下实现至少25%的最终蛋白质浓度。典型地，在浓缩工 艺结束时，溶液的pH为约4.6至5.1。

在一个示例性实施方案中，IgG组合物的pH值是使用1M盐酸 调节至5.2±0.2，并且通过超滤(100kDa或小于100kDa的标称分子 量截断阈值)浓缩至5±1g%蛋白质。接着，使浓缩物相对于渗滤溶液 (0.02M NaCl，0.05%(w/v)PEG)渗滤。渗滤液冷却至5±2℃。使用2.0 M Tris将溶液的Tris缓冲液浓度调节至0.025M，并且将pH再调节 至7.8±0.2。

F.阴离子交换色谱

在一个实施方案中，接着将蛋白质装载于平衡的ANX 4快速流动柱上以除去血浆来源污染物。装载完成之后， 用平衡缓冲液(25mM Tris，20mM NaCl，pH7.8±0.2)洗涤管柱。将 装载步骤和洗涤步骤中的管柱下降液(IgG溶液)合并。

G.病毒灭活和/或除去

在某些实施方案中，本文提供的用于制备富集免疫球蛋白组合物 的方法将进一步包括至少一个、优选至少两个、最佳至少三个病毒灭 活或除去步骤。可供本文提供的方法使用的病毒灭活或除去步骤的非 限制性实例包括溶剂清洁剂处理(Horowitz等,Blood Coagul  Fibrinolysis1994(5增刊3):S21-S28和Kreil等,Transfusion2003 (43):1023-1028，两文献均以全文引用的方式明确并入本文中用于所 有目的)、纳米过滤(Hamamoto等,Vox Sang1989(56)230-236和Yuasa 等,J Gen Virol.1991(72(pt8)):2021-2024，两个文献均以全文引用的 方式明确并入本文中用于所有目的)以及高温低pH值孵育(Kempf等, Transfusion1991(31)423-427和Louie等,Biologicals1994(22):13-19)。

可针对在制造过程中产生的任何中间免疫球蛋白洗脱份执行病 毒灭活或除去步骤。举例来说，在一个实施方案中，可针对洗脱份 I+II+III混悬液、洗脱份A混悬液、洗脱份B滤液、洗脱份II混悬液、 阳离子交换洗脱液、阴离子交换洗脱液以及其类似物执行病毒灭活或 除去步骤。

在一个实施方案中，针对洗脱份II混悬液执行病毒灭活或除去 步骤。在一个优选实施方案中，对洗脱份II混悬液进行溶剂以及清 洁剂(S/D)处理。

1.溶剂清洁剂(S/D)处理

为了将可能存在于血浆来源产品中的各种病毒污染物灭活，可对 一种或多种免疫球蛋白制造中间体进行溶剂清洁剂(S/D)处理。在一 个优选实施方案中，将洗脱份II沉淀物再混悬并且进行S/D处理。 用于清洁剂处理血浆来源洗脱份的方法在本领域中已众所周知(关于 综述，参见Pelletier JP等,Best Pract Res Clin Haematol. 2006;19(1):205-42)。一般而言，任何标准S/D处理可配合本文提供的 方法使用。举例来说，下文提供用于S/D处理的示例性方案。

简单来说，分别以约1.0%、0.3%和0.3%的最终浓度向澄清的 PptG滤液中添加曲通(Triton)X-100、吐温-20和三(正丁基)磷酸酯 (TNBP)。接着在约18℃与约25℃之间的温度下搅拌混合物至少约1 小时。

在一个实施方案中，通过喷雾而非通过流畅添加来添加S/D试剂 (例如曲通X-100、吐温-20和TNBP)。在其它实施方案中，清洁剂试 剂可以固体形式添加至免疫球蛋白中间体溶液中，加以混合以确保 S/D组分快速分布。在某些实施方案中，添加固体试剂优选为将固体 泼洒在滤液的非定域表面区域上，以使得不会(如在流畅添加中)发生 局部过度浓缩。在另一个实施方案中，通过将含有免疫球蛋白的溶液 抽入已存在呈浓缩形式或稀释形式的SD试剂的槽中来实现工艺改 进。

2.纳米过滤

为了进一步降低本文提供的免疫球蛋白组合物的病毒负荷，可使 用适当纳米过滤装置对免疫球蛋白中间体洗脱份进行纳米过滤。在某 些实施方案中，纳米过滤装置具有介于15nm与200nm之间或约15 nm与200nm之间的平均孔径。适于这个用途的纳米过滤器的实例包 括(但不限于)DVD、DV50、DV20(Pall)、Viresolve NFP、Viresolve  NFR(Millipore)、Planova15N、20N、35N以及75N(Planova)。在一个 特定实施方案中，纳米过滤器可具有介于15nm与72nm之间或约 15nm与72nm之间的平均孔径，或介于19nm与35nm之间或约19 nm与35nm之间的平均孔径，或15nm、19nm、35nm或72nm或 约15nm、19nm、35nm或72nm的平均孔径。在一个优选实施方案 中，纳米过滤器具有35nm或约35nm之平均孔径，如Asahi  PLANOVA35N过滤器或其等效物。

任选地，可执行超滤/渗滤以进一步浓缩纳米滤液。在一个实施 方案中，开孔通道膜是在制造过程快结束时以特别设计的后洗涤和配 制方式使用，从而产生高浓度的免疫球蛋白组合物。

纳米过滤之后，可通过超滤进一步浓缩滤液和/或通过渗滤调节 缓冲液组成。在一个实施方案中，可通过超滤将纳米滤液浓缩至0.5% 与10%(w/v)之间或约0.5%与10%(w/v)之间的蛋白质浓度。在某些实 施方案中，在具有开孔通道筛的暗匣中进行超滤并且超滤膜具有小于 或小于约150kDa、或小于或小于约140kDa、130kDa、120kDa、100 kDa、90kDa、80kDa、70kDa、60kDa、50kDa、40kDa、30kDa 或30kDa以下的标称分子量截断(NMWCO)。在一个实施方案中，超 滤膜具有不超过50kDa的NMWCO。

3.在低pH下孵育

在某些实施方案中，可处理含有免疫球蛋白的溶液以降低或灭活 组合物的病毒负荷。在一个实施方案中，这是通过如下操作实现：将 组合物的pH调节至低pH，例如小于或小于约6.0，并且孵育至少约 一周，随后释放组合物。在一个优选实施方案中，孵育之前，将本体 溶液的pH调节至小于或小于约5.5。在一个更佳实施方案中，孵育 之前，将溶液的pH降低至小于或小于约5.0。在某些实施方案中， 在孵育之前，将溶液的pH降低至小于或小于约6.0，或小于或小于 约5.9、5.8、5.7、5.6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5.0、4.9、4.8、4.7、 4.6、4.5、4.4、4.3、4.2、4.1、4.0或4.0以下。

在某些实施方案中，接着将溶液孵育至少1周，或至少2周、3 周、4周或4周以上，或至少1个月、2个月、3个月或3个月以上。 在优选实施方案中，组合物在超过20℃、或超过25℃、或超过30℃ 的温度下孵育。在特定实施方案中，组合物在20℃或21℃、22℃、 23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、 34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃或40℃以上的温度下孵 育。

4.冻干和热处理

在其它实施方案中，本发明提供根据本领域中已知的方法冻干的 冻干型免疫球蛋白组合物。可通过热处理冻干组合物来进一步降低这 些冻干组合物的病毒活性，这些冻干组合物先前已经受其它病毒灭活 或除去步骤，如S/D处理或纳米过滤。用于灭活血液因子中的病毒负 荷的热处理法在本领域中已众所周知(参见例如Piszkiewicz等, Thromb Res.1987年7月15日;47(2):235-41；Piszkiewicz等,Curr Stud  Hematol Blood Transfus.1989;(56):44-54；Epstein和Fricke,Arch Pathol  Lab Med.1990年3月;114(3):335-40)。

H.配制

渗滤步骤一旦完成，即用渗滤缓冲液将溶液的蛋白质浓度调节至 以下最终浓度：介于约3%与约20%(w/v)之间，或介于3%与7%之间， 或介于约6%与约18%(w/v)之间，或介于约7%与约16%(w/v)之间， 或介于约8%与约14%(w/v)之间，或介于约9%与约12%之间，或至 最终浓度为约5%或6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、 14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、 25%或高于25%。在一个优选实施方案中，溶液的最终蛋白质浓度介 于约9%与约11%之间，更佳为约10%。

所配制的本体溶液通过绝对孔径不超过约0.22微米(例如约0.2 微米)的膜滤器过滤来进一步灭菌。接着，将溶液无菌分配至最终容 器中以便适当密封，取样测试。

在一个实施方案中，用渗滤缓冲液将IgG组合物进一步调节至浓 度为约10.2±0.2%(w/v)。必要时，将pH调节至约4.4至约4.9。最后， 将溶液无菌过滤并且在30℃或约30℃下孵育三周。

在一个示例性实施方案中，所得IgG溶液用NaCl(最大0.15M)、 甘氨酸(最大0.3M)、葡萄糖(最大0.11M)和人白蛋白(最大3mg/mL) 稳定。使用1M盐酸将pH调节至7.0±0.2。通过超滤将溶液浓缩至所 要浓度，并且使用1M盐酸或1M氢氧化钠将pH再调节至7.15±0.1。 使用0.2微米孔径的过滤器或等效物无菌过滤本体溶液。

无菌IgG溶液可被无菌分配至容器中，塞紧以便冻干，冷冻，冻 干，在无菌条件下密封并封盖。

VIII.实施例

实施例1至7尤其证明以下优点：(1)从阳离子交换树脂(例如CM- 琼脂糖)洗脱免疫球蛋白的步骤产生蛋白质的双峰式分布，其中酰胺 分解活性(PL-1)的洗脱迟于IgG，从而可以IgG产率损失最小的方式 除去酰胺分解活性；(2)从阳离子交换树脂(例如CM-琼脂糖)洗脱酰胺 分解活性(PL-1)与以下相关并可能归结于以下：在根据本文提供的方 法洗脱期间，CM柱中的pH移位；(3)阳离子交换树脂(例如CM-琼 脂糖)上装载的蛋白质的量在至少每毫升树脂60mg至120mg蛋白质 的范围内不影响酰胺分解活性(PL-1)的除去；(4)监测柱出口处的pH 并当上升明显时停止洗脱，从而可部分除去酰胺分解活性(PL-1)活 性，原因可能为柱顶端的pH平衡已被打乱；(5)通过收集小于3个 CV的初始洗脱池可以最小的IgG产率损失(≤10%)显著降低酰胺分解 活性，因此，监测CM-琼脂糖洗脱步骤的体积为将根据本文提供的方 法制备的免疫球蛋白组合物的酰胺分解活性显著降低的简单方法；以 及(6)通过收集CM-琼脂糖洗脱步骤的“第一峰”可使组合物具有较 低IgG聚集物浓度、较低PKA活性、较低PL-1活性、较高IgG单体 浓度以及较理想的IgG亚类分布。

此外，实施例8和实施例9至少证明：(1)导致FXIa和TGA提 高的蛋白质可通过CM色谱分离洗脱液的最后25%部分来分离；(2) 上述优点可在大规模制造过程中重现；以及(3)大规模制造过程中产 生的阳离子交换(即CM-琼脂糖)洗脱液可通过监测OD来汇集，例如 洗脱液可收集于第一池中直至洗脱液的OD下降低于2.0，从而将实 现导致FXIa和TGA值提高的非所需蛋白质的大量分离。

实施例1

这个实施例描述TGA、FXIa值提高和NAPTT值减小的非所需 蛋白质在根据修改的Kistler-Nitschmann醇分级分离法所制备的洗脱 份II免疫球蛋白组合物中的分布。这些杂质可在阳离子交换色谱步 骤(例如CM琼脂糖快速流色谱)洗脱期间分离。

这实施例证明在阳离子交换色谱的洗脱期间酰胺分解性含量(例 如FXI和/或FXIa)显著降低。所述方法使最终免疫球蛋白产物含有显 著减少的TGA和FXIa活性。这种降低是通过CM洗脱步骤的特定 分级分离来实现，CM洗脱步骤可将酰胺分解活性(存在于洗脱液的滞 后部分中)与主要IgG洗脱份(见于洗脱液的前导部分中)有效分离。这 个实施例显示，通过将阳离子交换洗脱液分成前导部分和滞后部分， 可将不需要的痕量蛋白质与大部分IgG内容物分离。此外，这个实施 例证明，所述方法对于大规模制造而言有效并且经济可行。

简单来说，如下制备洗脱份II沉淀物。对汇集的人血浆进行冷 沉淀之后，通过以20%醇在pH6.9下沉淀来形成洗脱份I+II+III沉淀 物。使沉淀物I+II+III再混悬之后，添加醇直至最终浓度为20%，pH 为7.2，形成沉淀物A。通过离心执行沉淀物A的分离。洗脱份I+III(又 称为混悬液B沉淀物)是通过以17%醇使混悬沉淀物A沉淀来形成。 通过过滤或离心回收沉淀物。接着处理混悬液B滤液而形成洗脱份 II，洗脱份II含有部分纯化的丙种球蛋白(例如IgG)血浆蛋白质洗脱 份。

澄清洗脱份II的混悬液接着用溶剂清洁剂(SD)混合物处理，并且 装载于CM琼脂糖ff柱上。洗去残余SD试剂之后，将与树脂结合的 IgG洗脱份洗脱。随后，将免疫球蛋白溶液超滤/渗滤并且接着装载于 阴离子交换剂上以除去痕量杂质。在另一个浓缩步骤之后，进行最后 配制，随后冻干。

接着将洗脱份II沉淀物溶于4℃和pH5.2±0.2的冷水中。通过 CWSS过滤澄清之后，调节溶液以便SD处理。将蛋白质浓度调节至 2%，并且在SD孵育期间的温度保持在20℃至25℃范围内。接着将 蛋白质溶液装载于平衡CM-琼脂糖快速流动柱(平衡缓冲液：0.025M 乙酸钠，pH5.0±0.2)上。装载之后，管柱用30个柱体积的乙酸盐缓 冲液(0.01M乙酸钠，pH5.5±0.2)洗涤以洗去SD试剂，随后用洗脱缓 冲液(0.25M NaCl，0.2M甘氨酸，0.1%PEG3350，25mM Tris，pH 8.00)洗脱所吸附的蛋白质。在OD400mAU时，开始收集洗脱液的 第一部分(E1)并且在恰好2.7个柱体积之后停止(图1)。收集洗脱峰 的第二洗脱份(E2)，直至OD再下降至400mAU。接着单独处理所洗 脱的洗脱份以供工艺的剩余部分用。

接着将E1和E2组合物的pH调节至5.2，并且相对于渗滤缓冲 液(0.02M NaCl，0.05%PEG3350)超滤/渗滤以浓缩至5%蛋白质 (w/v)。向组合物中添加0.025M Tris并将pH调节至7.7。接着将IgG 洗脱份装载于由缓冲液(0.025M Tris，0.02M NaCl，pH7.7)平衡的 ANX-琼脂糖快速流动柱上。收集所得ANX流出液，并且补充8.5g/L  NaCl、16.5g/L甘氨酸、21.7g/L葡萄糖酸酐以及1g/l白蛋白(20%)。 接着，调节pH并且通过超滤将E1和E2组合物浓缩至10%(w/v)蛋 白质。浓缩之后，向浓缩溶液中再次补充NaCl和甘氨酸(而非白蛋白) 并且必要时在无菌过滤之前将pH调节至7.1。

显示色谱步骤的吸光度(mAU)、电导率以及pH的色谱图提供于 图1中。正如所见，用上述洗脱缓冲液进行单步洗脱可产生双峰洗脱。 显然，在添加洗脱缓冲液之后，洗脱液的pH随着第一峰脱离管柱而 显著下降，并且接着随着第二峰的洗脱而急剧上升。正如所述，通过 收集2.7个柱体积的第一洗脱份E1(图1所示的垂直线左侧)和第二洗 脱份(图1所示的垂直线右侧)来分离洗脱峰。

如下文所述，分别处理所洗脱的洗脱份(E1和E2)，以产生最终 免疫球蛋白制剂。为此，将洗脱份E1和E2的pH调节至5.2并且使 样品相对于渗滤缓冲液(0.02M NaCl，0.05%PEG3350)渗滤，以便使 组合物浓缩至5%的最终蛋白质浓度。渗滤之后，向各蛋白质溶液中 添加0.025M Tris并且将pH调节至7.7。接着将IgG洗脱份装载于平 衡ANX-琼脂糖快速流动柱(平衡缓冲液0.025M Tris，0.02M NaCl， pH7.7)上并收集流下的洗脱份。接着向ANX流出液中补充8.5g/L  NaCl、16.5g/L甘氨酸、21.7g/L葡萄糖酸酐以及1g/L白蛋白(20%)。 接着将溶液pH调节至7.00并且通过超滤将免疫球蛋白样品浓缩至 10%蛋白质。浓缩之后，再次添加NaCl、甘氨酸以及葡萄糖酸酐， 并且必要时在无菌过滤之前将pH调节至7.1。

为表征色谱步骤，测定质量平衡，其结果显示于表1中。在洗脱 峰的第二部分中发现约10%的总蛋白质。这是收集2.7个柱体积之洗 脱液之后停止汇集组合物时发生的产率损失。

表1：CM色谱富集步骤的质量平衡。

接着对利用两个CM洗脱的洗脱份制备的最终容器进行分子大 小分布、抗补体活性、酰胺分解活性(使用PL-1与TGA作为底物)、 FXIa活性以及NAPTT活性方面的分析。结果显示于表2和表3中。 来源于所洗脱的IgG洗脱份的第一部分和第二部分的最终容器的生 物化学特征揭示：第一洗脱部分基本上不含FXIa并导致TGA提高和 NAPTT值缩小的其它不需要蛋白质。相比之下，第二部分中的FXIa 和酰胺分解活性富集，其中聚集物和寡二聚体含量也较高。有趣的是， 洗脱液的第一部分中的ACA值极低，而洗脱液的第二部分显示高得 多的值。

表2：比较两个最终容器E1和E2的分子大小分布。

表3：比较两个最终容器E1和E2的生物化学特征。

总之，从CM琼脂糖ff柱分离洗脱液可产生两个洗脱份，并且 能够制造大致上不含FXIa的IgG组合物。

实施例2

为了减少存在于制造规模的免疫球蛋白制剂中的酰胺分解活性 的量，研究用于洗脱和分级分离阳离子交换色谱的条件。这些研究的 详情提供于下文中。

进行一系列的实验来寻找在根据本文所述的Gammagard SID生 产方法的下游处理期间降低/除去酰胺分解活性的适当方法。简单来 说，将科恩洗脱份糊剂溶于4℃和pH5.2±0.2的冷水中。通过CWSS 过滤澄清之后，将样品无菌过滤并且在4℃下存放或用水稀释至2% 的蛋白质浓度以便即时处理。接着，使溶液达到20-25℃并且用溶剂/ 清洁剂混合物(1%曲通X-100，0.3%吐温80；0.3%TNBP)孵育1小时， 随后将蛋白质溶液装载于平衡CM琼脂糖快速流动柱(平衡缓冲液： 25mM乙酸钠，pH5.0±0.2)上。装载之后，用乙酸盐缓冲液(0.01M 乙酸钠，pH5.5±0.2)洗涤管柱并且用洗脱缓冲液(0.25M NaCl，0.2M 甘氨酸，0.1%PEG3350，25mM Tris，pH7.8)洗脱所吸附的IgG。在 CM琼脂糖ff操作期间，监测以下参数以分级分离CM洗脱液(限定 点)：OD280；pH；以及洗脱体积(以柱体积CV计)。接着用渗滤缓 冲液(0.02M NaCl，0.05%PEG3350)超滤/渗滤洗脱液，或立即用于 分析。执行这个浓缩步骤以便在同样对应于10%最终容器组合物的蛋 白质值下测量酰胺分解活性。

洗脱期间，洗脱液快速达到CM洗脱缓冲液的电导率值。然而， 如图2所示，在柱出口处所测量的洗脱液的pH从5.5(如在洗涤缓冲 液中)下降至50以下(43-4.8)并且最开始的4个CV的pH保持不变， 尽管洗脱缓冲液具有7.8的pH。在洗脱液收集结束时观察到pH增至 约7.8。监测柱出口处的OD280显示，这个pH移位对应于第二峰的 释放，其中检测(如经由PL-1分析所测量)到大部分酰胺分解活性。

实施例3

为进一步研究实施例1和实施例2中所观测到的双峰CM-琼脂糖 洗脱现象和pH移位，在另一个CM-琼脂糖快速流色谱实验期间收集 单独的洗脱份。简单来说，如上所述执行CM-琼脂糖快速流色谱，其 中收集洗脱份并单独分析，随后汇集洗脱份A-N并且通过超滤浓缩。 用于色谱步骤的起始物质为科恩洗脱份II糊剂(P25001ivLE；吸附FIX 和AT-III)。将CM-琼脂糖柱用pH为5.2的缓冲液平衡，并且在pH5.7 下执行洗涤。色谱步骤的流速维持在0.64cm/min。

pH值移位之后，在洗脱份中发现酰胺分解活性(PL-1)的量增加。 即使在浓缩池中，也观测到酰胺分解活性降低。超滤/渗滤之后可检 测到PL1活性的情况是因为CM洗脱液的稀释或因为其在浓缩期间 产生。

如表4中所示，以低于5.5的pH洗脱的洗脱份(洗脱份A-N)含 有浓度比以较高pH洗脱的洗脱份(洗脱份O和P)低得多的酰胺分解 活性。对酰胺分解活性的定量显示，洗脱份O和P中洗脱的活性大 于所合并的全部洗脱份A-N。pH移位之后，在洗脱份中发现酰胺分 解活性(PL-1)的量增加。即使在浓缩池中，也观测到酰胺分解活性降 低。超滤/渗滤之后可检测到PL1活性的情况是因为CM洗脱液的稀 释或因为其在浓缩期间产生。

表4：分析CM-琼脂糖ff洗脱的洗脱份

实施例4

为进一步确定酰胺分解活性从CM-琼脂糖ff树脂洗脱的边界， 如上所述进行另一个实验，但CM-洗脱液收集于根据pH边界定义的 洗脱份中。明确来说，如在柱出口处所监测，收集CM-洗脱液直至预 定pH(4.3、4.8、6.0、7.5)。在这个实验中，用于色谱步骤的起始物 质为如在实施例3中的科恩洗脱份II糊剂(P25001ivLE；吸附FIX和 AT-III)。CM-琼脂糖柱在pH4.8下平衡并且在pH5.3下洗涤。将洗 脱液的洗脱份超滤/渗滤并且在分析之前用Tris调节pH。在这个实验 中，在洗脱步骤开始时，洗脱液的pH下降至4.1。对所收集的洗脱 液洗脱份的分析显示于表5中。

表5：分析CM-琼脂糖ff洗脱的洗脱份

实施例5

接下来确定每单位CM-琼脂糖树脂的蛋白质的量的降低是否会 进一步增强图2中所示的峰分离。为了对此进行测试，在蛋白质负荷 递减下(范围为每毫升树脂118mg蛋白质降至57mg蛋白质)执行一 系列CM-琼脂糖ff色谱操作。如同实施例2，用于实验的起始物质为 科恩洗脱份II糊剂途径II；P24701IV；其包括通过吸附从冷贫血浆 除去FIX、FVII和ATIII(表6)。树脂在pH5.2下平衡并且洗涤步骤 在pH5.7下执行。如同实施例2，汇集CM-琼脂糖洗脱液，分成第一 部分(第一峰)和第二部分(第二峰)。图2提供示例性色谱图，其中当 洗脱液的UV吸光度在两个峰之间的约OD₂₈₀=1.6±0.2处达最低点时， 第一池结束而第二池开始。

表6：分析起始物质(科恩洗脱份II糊剂途径II；P24701IV)。

如表7中所示，降低树脂的蛋白质负荷显示对峰分离无影响，但 对回收率有影响。根据上述实施例所提出的结果，各色谱操作轮次的 第一洗脱液池中存在极低含量的酰胺分解活性。

表7：分析以可变蛋白质负荷所执行的CM-琼脂糖色谱纯化

实施例6

为进一步验证上述实验结果，以可变流速和洗脱汇集方案执行 CM-琼脂糖色谱纯化。简单来说，如本文中所述，将含有高水平的酰 胺分解活性(100nmol/mL.min，6%蛋白质)的科恩洗脱份II糊剂处理 成洗脱份后进行ANX色谱。对于所有CM-琼脂糖操作，当UV开始 上升时收集洗脱液并且在3个CV之后或4个CV之后停止。

如下执行三次CM琼脂糖色谱纯化。如本文中所述将所收集的洗 脱液洗脱份浓缩并且接着进一步浓缩，从而避免PL-1值低于PL-1分 析的检测极限。

第一次操作：冲洗CM-琼脂糖树脂并且在1cm/min流速下平衡。 蛋白质装载、洗涤和洗脱步骤的流速保持恒定在0.64cm/min。主池 中收集3个柱体积(3CV)的洗脱液。

第二次操作：冲洗CM-琼脂糖树脂并且在1.2cm/min流速下平 衡。蛋白质装载步骤的流速为0.64cm/min。洗涤步骤的流速对于最 开始的1.2个柱体积(CV)而言为0.64cm/min，并且对于接下来的28.8 个CV而言为1.8cm/min。洗脱步骤以0.64cm/min执行。主池中收 集3个柱体积(3CV)的洗脱液。

第三次操作：冲洗CM-琼脂糖树脂并且在1.2cm/min流速下平 衡。蛋白质装载步骤的流速为0.64cm/min。洗涤步骤的流速对于最 开始1.2个柱体积(CV)而言为0.64cm/min，并且对于接下来的28.8 个CV而言为1.8cm/min。洗脱步骤以0.64cm/min执行。主池中收 集4个柱体积的洗脱液。

将各CM-琼脂糖色谱操作的主池浓缩，并且分析酰胺分解活性 (PL-1)、总蛋白质浓度以及HPLC特征。如表8中所示，洗涤步骤的 流速增大导致主池中的酰胺分解活性的量降低(比较第1次操作与第 2次操作)。收集4个CV(而非3个CV)得到标称总蛋白质产量(2.55g/L 血浆相对于2.5g/L血浆；比较第3次操作与第2次操作)，然而，其 是最终组合物中存在的酰胺分解活性的总量的两倍(384.7PL-1 nmol/min·g蛋白质相比于188.5PL-1nmol/min·g蛋白质)。汇集4个 CV也使最终免疫球蛋白组合物的聚集物含量增加(0.52%相比于 0.12%；比较第3次操作与第2次操作)。显然，第2次操作制备的组 合物的最终酰胺分解含量和聚集物含量与上文所示一致(参见表2、表 4和表5)。

表8：分析以可变洗涤流速和洗脱液收集体积所执行的CM-琼脂 糖色谱纯化

实施例7

为证明上文提供的结果可按比例扩大至工业制造规模，如以上实 验中处理360g科恩洗脱份II起始物质。第一池中收集2.9个CV的 CM-琼脂糖并且第二池中收集剩余洗脱液。接着，将所得洗脱液池处 理成如本文中所述的适于施用给个体的最终容器组合物。这个进一步 处理包括ANX色谱、超滤/渗滤以及最终配制物冻干。接着分析各最 终制剂的生物化学特性并且结果呈现于表9中。

表9：比较两个最终容器E1(第一洗脱部分；2.9个CV)和E2(第 二洗脱部分；>2.9个CV)的生物化学特性。

如表9中所示，来源于CM-琼脂糖的第一洗脱部分的最终组合物 所含酰胺分解活性为来源于CM-琼脂糖的第二洗脱部分的50分之一 (402nmol PL-1/min.g蛋白质相比于18,446.6nmol PL-1/min.g蛋白 质)。与来源于CM-琼脂糖的第二洗脱部分的最终组合物相比，来源 于CM-琼脂糖的第一洗脱部分的最终组合物也含有较少白蛋白(1.2% 相对于2.3%)、α/β球蛋白(未检测到，相对于0.2%)、PKA活性(<0.6 IE/mL相对于41.2IE/mL)和IgG3(4.6%相对于10.8%)。此外，与来 源于CM-琼脂糖的第二洗脱部分的最终组合物相比，来源于CM-琼 脂糖的第一洗脱部分的组合物含有高得多的IgG单体含量(94.81%相 对于87.86%)。

实施例8

为进一步验证上文提供的结果，根据本文提供的方法制备洗脱份 II糊剂(RI10XD142；离心的沉淀物A)的一部分。接着将糊剂再混悬 并且如本文中所述装载于CM-琼脂糖阳离子交换柱上，并且如上文所 述洗脱。洗脱液(总体积：4743mL)分成含有75%总洗脱液的第一洗 脱份(3530mL)并含有25%总洗脱液的第二洗脱份(1213mL)。接着将 CM-琼脂糖洗脱液的第一洗脱份与第二洗脱份处理成如本文中所述 的最终容器，并且分析FXIa、TGA、NAPTT和酰胺分解(PL-1)活性、 IgG聚集物以及ACA含量。结果提供于表10中。根据上文提供的结 果，CM-琼脂糖洗脱液分离成第一池和第二池引起最终免疫球蛋白制 剂中的FXIa和TGA活性降低。

表10：CM-琼脂糖洗脱的第一洗脱份和第二洗脱份的生物化学特 性

测试 单位 CM洗脱液的第一部分 CM洗脱液的第二部分 TGA 正常血浆% 96.87 256.41 特异性F-XIa mU/mL <0.04 2.14 NAPTT mg <5 <5 酰胺分解活性(PL-1) nmol/mL min <10 <10 PKA IE/mL <4 5.9 MSD 聚集物% 0.20 2.82 ACA % 16.6 58.7

实施例9

为进一步评估本文提供的方法按规模扩大的可行性，监测大规模 制造过程的CM-琼脂糖洗脱液的蛋白质含量、pH和FXIa活性。简 单来说，如本文所述处理约19,000L冷贫血浆，形成约220kg的洗 脱份II糊剂，其含有约70kg蛋白质。将洗脱份II糊剂再混悬并装载 于制造规模的CM-琼脂糖柱上，洗涤并且洗脱，如上文所述。收集洗 脱液样品并且在洗脱每一个CV(约350L)之后分析。如表11中所示， 在洗脱液pH移位之后，在CM-琼脂糖洗脱结束时，仅发现FXIa值 升高。监测洗脱液在OD₂₈₀下的蛋白质浓度，并且收集第一洗脱部分 并汇集直至OD₂₈₀下降低于2.0。接着收集第二洗脱部分并且分别汇 集直至OD₂₈₀下降低于0.2。接着对第一洗脱液池和第二洗脱液池进 行分析和比较，如表12中所示。显然，在CM洗脱液的第一部分中 发现IgG产率为98%，而在CM洗脱液的第二部分中发现IgG产率 为2%。因此，通过在洗脱液的OD₂₈₀下降低于2.0之后终止收集CM- 琼脂糖洗脱池，可从制剂中除去大量TGA和FXIa活性，同时使IgG 产率损失最小化。

表11：每一个柱体积洗脱之后所采集的CM-琼脂糖洗脱液样品 的生物化学特性

表12：第一CM-琼脂糖洗脱池和第二CM-琼脂糖洗脱池的生物 化学特性

实施例10

为进一步评估所公开的降低免疫球蛋白组合物的酰胺分解性含 量的方法，使用洗脱份II沉淀物作为起始物质来进行第二次大规模 实验。简单来说，如实施例1中所述制备洗脱份II沉淀物，但通过 过滤而非离心来分离沉淀物A。

如实施例1中所述，对洗脱份II沉淀物进行CM-阳离子色谱。 如同实施例1，将CM洗脱液收集于两个池中，即含有大部分IgG内 容物的前导部分(E1)和含有大部分酰胺分解活性的滞后部分(E2)。在 OD400mAU处开始收集洗脱液的第一部分(E1)，并且在恰好2.7个 柱体积之后停止。收集洗脱峰的第二洗脱份(E2)，直至OD再下降至 400mAU。接着单独处理所洗脱的洗脱份以供工艺的剩余部分用。纯 化工艺的质量平衡显示于表13中。

表13：第二次大规模纯化洗脱份II沉淀物的质量平衡

如同实施例1，在洗脱峰的第二部分中发现约10%的总蛋白质。 这是在2.7个柱体积之后停止洗脱所证实的产率损失。

使用底物SN13a并且使用TGA、FXIa和NAPTT分析，对由两 个CM洗脱洗脱份(E1和E2)制备的最终容器分析分子大小分布、抗 补体活性、酰胺分解活性。结果显示于表14和表15中。

表14：比较两个最终容器的分子大小分布

表15：比较两个最终容器的其它特性

来源于所洗脱的IgG洗脱份的第一部分和第二部分的最终容器 的生物化学特性揭示，第一洗脱部分基本上不含FXIa和导致TGA升 高与NAPTT值缩小的其它不需要蛋白质。相比之下，第二部分中的 FXIa和酰胺分解活性富集，其中即使通过过滤分离混悬液A，聚集 物和寡聚物/二聚体含量也较高。有趣的是，洗脱液的第一部分中的 ACA值甚至更低，而洗脱液的第二部分中的ACA值较高。

在这个实验中，在上游处理中使用过滤分离混悬液A的情况下， 第二洗脱部分中的残余FXIa少得多，并且这个洗脱部分的最终容器 的TGA值处于正常范围内。

结合实施例1来看，将来自CM琼脂糖ff柱的洗脱液分离成两 个洗脱份(E1和E2)容许制造大致上不含FXIa的IgG组合物。对于洗 脱份A的分离方案(即离心和过滤)而言确是如此，但通过过滤分离沉 淀物A时，FXIa显著更低。

实施例11

这个实施例证明本发明方法适合在用于制造皮下施用的免疫球 蛋白组合物的大规模制造过程中通过阳离子交换色谱分离促凝血活 性。用于这个实验的起始物质为由在欧洲收集的汇集人来源血浆形成 的洗脱份II沉淀物，其经冷沉淀并且经由吸附用于回收抗凝血酶III (ATIII)。

简单来说，冷沉淀和吸附ATIII之后，冷醇分级分离以纤维蛋白 原和残余凝血因子(例如因子XIII)的分离开始，这种分离是通过使洗 脱份I沉淀物在8%醇和pH7.0下沉淀来达成。上清液中的醇浓度调 节至25%，以便使洗脱份II+III沉淀并且使白蛋白分离。使沉淀物 II+III再混悬之后，添加醇直至12%、pH为约5.2，形成沉淀物III。 分离沉淀物III之后，添加0.04g DEAE葡聚糖凝胶/g蛋白质，溶液 经由Cuno90深度过滤器过滤，并且含有纯化的丙种球蛋白洗脱份的 科恩洗脱份II是通过25%醇在中性pH下沉淀。

将洗脱份II沉淀物溶于4℃和pH5.2±0.2的冷水中。通过CWSS 过滤澄清之后，调节溶液至2%的蛋白质浓度以便SD处理。SD孵育 期间的温度保持在20℃至25℃范围内。将蛋白质溶液装载于平衡CM- 琼脂糖快速流动柱(平衡缓冲液：0.025M乙酸钠，pH5.0±0.2)上。装 载之后，管柱用30个柱体积的乙酸盐缓冲液(0.01M乙酸钠，pH 5.5±0.2)洗涤以洗去SD试剂，随后用洗脱缓冲液(0.25M NaCl，0.2M 甘氨酸，0.1%PEG3350，25mM Tris，pH8.00)洗脱所吸附的蛋白质。 在OD400mAU下开始收集洗脱液的第一部分(E1)并且在恰好2.7个 柱体积之后停止。收集洗脱峰的第二洗脱份(E2)，直至OD再下降至 400mAU。根据以下步骤将所洗脱的洗脱份单独处理成最终本体。

将洗脱液洗脱份的pH调节至5.2且接着将浓度调节至5%，相对 于渗滤缓冲液(0.02M NaCl，0.05%PEG3350)渗滤，并且随后浓缩至 10%蛋白质。向溶液中添加0.055g甘氨酸/g蛋白质并将pH调节至 7.0，随后进行无菌过滤。

阳离子交换洗涤和洗脱步骤的色谱图显示于图3中。图线1显示 UV吸光度，图线2显示电导率，并且图线3显示柱出口处的pH。 280nm下的光学密度指示，在蛋白质从CM琼脂糖ff柱洗脱期间， 两个洗脱份出现部分分离。洗脱期间，柱出口处的pH在UV吸光度 刚开始再上升之后开始上升。此时，将洗脱液的两个洗脱份分离(F4 和F5，本文中称为E1和E2)。下游纯化操作的质量平衡显示于表16 中。

表16：从洗脱份II沉淀物大规模纯化IgG的质量平衡

在洗脱峰的第二部分(E2)中发现约15%的总蛋白质。这是由于2.7 个柱体积之后停止收集E1而造成的产率损失。使用底物SN13a且使 用TGA、FXIa和NAPTT分析，对由两个CM洗脱洗脱份(E1和E2) 制备的最终容器分析分子大小分布、抗补体活性、酰胺分解活性。结 果显示于表17和表18中。

表17：比较两个最终容器的分子大小分布

表18：比较两个最终容器的其它特性

CM-洗脱液(E1)的第一部分使得最终本体的聚集物、二聚体和片 段含量较低，FXIa含量低、TGA结果接近于正常血浆、PKA和酰胺 分解活性如使用SN-13所测低于检测限值，并且NAPTT未缩小。第 二部分中的FXIa、PKKA和FXIa样活性富集，其中IgG聚合物、片 段和寡聚物/二聚体含量也较高。有趣的是，洗脱液(E1)的前导部分中 的ACA值低于洗脱液(E2)的滞后部分中的ACA值。

实施例12

为进一步评估所公开的降低免疫球蛋白组合物的酰胺分解性含 量的方法，使用洗脱份II沉淀物作为起始物质来进行另一个大规模 实验。简单来说，如实施例11中所述制备洗脱份II沉淀物，但用于 这个实验的起始物质为由在欧洲收集的汇集人来源血浆形成的洗脱 份II沉淀物，其经冷沉淀并且经由吸附用于回收FEIBA和抗凝血酶 III(ATIII)。如实施例11中所述，另外执行CM-琼脂糖阳离子交换色 谱和下游处理。

阳离子交换洗涤和洗脱步骤的色谱图显示于图4中。图线1显示 UV吸光度，图线2显示电导率，并且图线3显示柱出口处的pH。 280nm下的光学密度指示，在蛋白质从CM琼脂糖ff柱洗脱期间， 两个洗脱份出现部分分离。洗脱期间，柱出口处的pH在UV吸光度 刚开始再上升之后开始上升。此时，将洗脱液的两个洗脱份分离(F4 和F5，本文中称为E1和E2)。下游纯化操作的质量平衡显示于表19 中。

表19：从洗脱份II沉淀物大规模纯化IgG的质量平衡

如同实施例11，在洗脱峰的第二部分中发现约15%的总蛋白质。 这是由于2.7个柱体积之后停止收集E1造成的产率损失。使用底物 SN13a且使用TGA、FXIa和NAPTT分析，对由两个CM洗脱洗脱 份(E1和E2)制备的最终容器分析分子大小分布、抗补体活性、酰胺 分解活性。结果显示于

表20和表21中。

表20：比较两个最终容器的分子大小分布

表21：比较两个最终容器的其它特性

来源于所洗脱的IgG洗脱份的第一部分和第二部分的稳定化主 体的生物化学特征揭示，第一洗脱部分基本上不含FXIa和导致TGA 升高与NAPTT值缩小的其它不需要蛋白质，而第二部分中的PKKA、 FXIa和FXIa样活性富集，其中IgG片段、聚合物和寡聚物/二聚体 含量也较高。洗脱液的第一部分和第二部分的本体的ACA值差异不 显著。结果总体上证实了实施例11的研究结果。

实施例13

为进一步评估所公开的降低免疫球蛋白组合物的酰胺分解性含 量的方法，使用洗脱份II沉淀物作为起始物质来进行另一个大规模 实验。简单来说，如实施例11中所述制备洗脱份II沉淀物，但用于 这个实验的起始物质为由在美国收集的汇集人来源血浆形成的洗脱 份II沉淀物，其经冷沉淀并且经由吸附用于回收FEIBA和抗凝血酶 III(ATIII)。如实施例11中所述，另外执行CM-琼脂糖阳离子交换色 谱和下游处理。

阳离子交换洗涤和洗脱步骤的色谱图显示于图5中。图线1显示 UV吸光度，图线2显示电导率，并且图线3显示柱出口处的pH。 280nm下的光学密度指示，在蛋白质从CM琼脂糖ff柱洗脱期间， 两个洗脱份出现部分分离。洗脱期间，柱出口处的pH在UV吸光度 刚开始再上升之后开始上升。此时，将洗脱液的两个洗脱份分离(F4 和F5，本文中称为E1和E2)。下游纯化操作的质量平衡显示于表22 中。

表22：从洗脱份II沉淀物大规模纯化IgG的质量平衡

如同实施例11，在洗脱峰的第二部分中发现约15%的总蛋白质。 这是由于2.7个柱体积之后停止收集E1而造成的产率损失。使用底 物SN13a，并使用TGA、FXIa和NAPTT分析，对由两个CM洗脱 洗脱份(E1和E2)制备的最终容器再次分析分子大小分布、抗补体活 性、PKKA、FXIa样活性。结果显示于表23和表24中。

表23：比较两个最终容器的分子大小分布

表24：比较两个最终容器的其它特性

最终本体的生物化学特性证实了实施例11和实施例12的结果。 第一洗脱部分(E1)基本上不含FXIa和导致TGA升高与NAPTT值缩 小的其它不需要蛋白质，而第二部分(E2)中的FXIa和酰胺分解活性 富集，其中即使通过过滤分离混悬液A，片段、聚合物和寡聚物/二 聚体含量也较高。有趣的是，洗脱液的第一部分的稳定化本体中的 ACA值再次低于洗脱液的第二部分的本体中的ACA值。

综合而言，上述实施例得到的结果证明，将来自CM琼脂糖ff 柱的洗脱液分离成两个洗脱份容许制造大致上不含促凝血活性的免 疫球蛋白组合物。对于不同血浆来源(EU及US)和上游处理方案而言 确实如此。

针对实施例11至实施例13所述的免疫球蛋白制剂测定的产品损 失高于实施例1至实施例10中所示的损失。在实施例11至实施例 13中，2.7个柱体积之后分离洗脱峰将导致总蛋白质损失约15%。由 于实施例11至实施例15中洗脱液的pH移位更迟，因此更迟的洗脱 分割将提高总产率而不会显著影响促凝血活性的分离。

上文所示的数据证明，分离阳离子交换色谱洗脱液为制造促凝血 活性大致上降低的免疫球蛋白组合物的稳健方法。

应了解，本文所述的实施例和实施方案仅具说明性目的，并且本 领域技术人员可根据其提出不同修改或变更，并且所述修改或变更包 括在本申请的精神和范围内以及所附权利要求书的范畴内。本文中引 述的所有出版物、专利和专利申请都以全文引用的方式并入本文中用 于所有目的。