用于对N-连接糖肽进行高通量识别和定量的生物信息学平台

摘要

本发明涉及通过使用高分辨率质谱仪获得的质谱来对糖肽进行识别和定量的更加有效且精确的方法，与一般肽相比，所述糖肽具有相对低的丰度。因此，通过从各种样品中筛选作为疾病标记物(生物标记物)的糖肽，可将本发明的方法有效地用于对生物治疗药物进行识别和对癌症或疾病进行诊断的技术。

说明书

技术领域

本发明涉及基于质谱法对N-连接糖肽进行识别和定量的新型生物信 息学平台。

背景技术

人血是多种蛋白的混合物，其中至少50％是糖蛋白。然而，由于糖 蛋白样品的高度复杂性和多样性，以及糖肽具有比起非糖肽而言相对更 低的质谱强度，通常不能对样品中的所有糖肽进行表征。从引入高分辨 率质谱仪起，聚糖和糖蛋白的分析发展迅速。然而，对糖蛋白进行识别 和定量所必需的生物信息学技术还未跟上时代。已知许多治疗性蛋白以 多种形式和非常复杂的方式糖基化。主要有两种用于对此类糖蛋白的糖 基化进行识别和定量的技术手段。一种手段是通过使用由酶或化合物诱 发的化学裂解来对聚糖进行识别和定量，另一手段是对糖肽进行识别和 定量。然而，用于对所释放的聚糖进行分析的方法具有无法得知糖基化 位点特异性信息的问题。如果能够对糖肽自身进行识别和定量，不但可 识别肿瘤和检查肿瘤发展，而且除糖蛋白自身外，还可获得关于糖基化 位点、N-连接糖链的大小和侧链增长数量的大量信息。

通常，糖蛋白的糖基化分析方法包括在蛋白水平上对糖蛋白进行浓 缩的步骤。但是在本发明中，使用标准糖蛋白样品进行并完成本发明。 尤其是，通过用胰蛋白酶水解所述标准糖蛋白样品而获得肽和糖肽。随 后，用高分辨率质谱仪对这些肽进行分析。将串联质谱(MS/MS)和质 谱(MS)的结果与糖肽数据库进行比较，从而对糖肽进行识别和定量。

近年来使用MS/MS或MS对糖肽进行筛选的软件可例举出： Peptoonist(David Goldberg等，Automated N-Glycopeptide Identification  Using a Combination of Single-and Tandem-MS，Journal of proteome  research，2007，6，3995-4005)；SimGlycan (http://glycotools.qa-bio.com/SimGlycan)；GlycoMiner(Oliver Ozohanics 等，GlycoMiner：a new software tool to elucidate glycopeptide composition， Rapid Communications in Mass Spectrometry，2008，22，3245-3254)； GlycoSpectrumScan(Nandan Deshpande等，GlycoSpectrumScan：Fishing  Glycopeptides from MS Spectra of Protease Digests of Human Colostrum  slgA，Journal of proteome research，2010，9，1063-1075)；GlycoPep Grader (Carrie L.Woodin等，GlycoPep Grader：A Web-Based Utility for Assigning  the Composition of N-Linked Glycopeptides，Analytical Chemistry，2012) 等。

由于上述软件程序被设计为通过仅使用串联质谱来识别糖肽，因此， 对于糖肽性质的准确分析值得怀疑，且定量分析结果的不一致也是另一 问题。不支持各种高分辨率质谱仪成为了上述程序的问题。

为克服上述问题，本发明人研究并完成了使用质谱来对糖肽进行更 加有效的识别和定量的新方法，与一般肽相比，所述糖肽具有相对低的 丰度。首先，对以高浓度存在于人血清中的281种糖蛋白的糖肽(Terry  Farrah等，A High-Confidence Human Plasma Proteome Reference Set with  Estimated Concentrations in PeptideAtlas，Molecular Cell Proteomics，2011) 进行储存，并对此类糖肽的理论同位素分布进行建模。将获得的结果录 入数据库。在本发明中，还通过使用MS/MS和MS获得糖肽的同位素分 布，将该同位素分布与糖肽数据库进行比较，从而精确地识别糖肽，并 通过计算离子色谱图中的面积来对该糖肽进行定量。

发明内容

技术问题

本发明的目的是提供使用质谱结果对糖肽进行更加有效且精确的识 别和定量的生物信息学平台，与一般肽相比，所述糖肽具有相对低的丰 度。

技术方案

为实现上述目的，本发明提供了用于对来自糖蛋白的N-连接糖肽进 行识别和定量的新型生物信息学平台，该生物信息学平台包括如下步骤：

通过使用高分辨率质谱仪，对用蛋白酶将糖蛋白水解而制备的多肽 进行分析来获得质谱(步骤1)；

将在步骤1中获得的质谱转换为MS1(质谱1)和串联谱(MS/MS) (步骤2)；

计算各串联谱的M得分，所述串联谱选自于由显示出如下氧鎓离子 峰分子量的转换串联谱所组成的组：129.06、138.06、145.05、147.07、 163.06、168.07、186.08、204.08、274.09、292.10、350.15、366.14、454.16、 528.19和657.24(步骤3)；

使用在步骤3中获得的M得分选择糖肽谱(步骤4)；

获得在步骤4中选择的糖肽谱的MS1中的同位素分布，将该同位素 分布与数据库进行比较，从而计算S得分，并通过使用所计算的S得分 识别糖肽候选物(步骤5)；

通过使用串联谱中的E得分、Y得分和Y′得分，对来自步骤5中识 别的糖肽候选物的确切糖肽进行评价(步骤6)；

用在步骤6中评价的糖肽进行定量分析(步骤7)；以及

通过用在步骤6中定量的糖肽进行相关性分析，对同族N-连接糖肽 进行另外的识别和定量(步骤8)。

有益效果

如上文所述，本发明提供了用于对各种样品中的具有特定糖链的糖 肽进行定量的更加有效且精确的方法，并由此通过对来自各种样品的疾 病标记物进行筛选，可将该方法有效地用于对癌症或疾病进行预测和诊 断的技术。对于希望用高分辨率质谱仪对糖蛋白生物相似性治疗药物的 糖肽和糖结构进行分析的人来说，该方法也是有用的。

附图说明

图1是示出用于对来自样品的N-连接糖肽进行识别和定量的新型生 物信息学平台的流程图。

图2a是示出糖肽和一般肽的M得分分布的图(根据生物信息学平 台的步骤2，所述生物信息学平台用于对以标准糖蛋白进行的本发明实施 例的N-连接糖肽进行识别和定量)。

图2b是示出糖肽和一般肽的灵敏度与特异性之间的相关性的图(根 据生物信息学平台的步骤2，所述生物信息学平台用于对以标准糖蛋白进 行的本发明实施例的N-连接糖肽进行识别和定量)。

图3是示出S得分优化的灵敏度与特异性之间的相关性的图，所述 S得分通过用于对以标准糖蛋白进行的本发明实施例的N-连接糖肽进行 识别和定量的生物信息学平台的步骤5中与数据库进行比较而获得。

图4a是示出在用标准糖蛋白进行的本发明实施例中识别的N-连接 糖肽中，NLTK_5200的代表性HCD谱的图。

图4b是示出在用标准糖蛋白进行的本发明实施例中识别的N-连接 糖肽中，NLTK_5200的代表性CID谱的图。

图5a是示出在用标准糖蛋白进行的本发明实施例中识别的N-连接 糖肽中，SRNLTK_5200的代表性HCD谱的图。

图5b是示出在用标准糖蛋白进行的本发明实施例中识别的N-连接 糖肽中，SRNLTK_5200的代表性ETD谱的图。

图6a是示出在生物信息学平台的步骤7中定量的糖肽相对量的饼 图，所述生物信息学平台用于对以标准糖蛋白进行的实施例1的N-连接 糖肽进行识别和定量。

图6b是示出在生物信息学平台的步骤7中定量的糖肽相对量的饼 图，所述生物信息学平台用于对以标准糖蛋白进行的实施例2的N-连接 糖肽进行识别和定量。

图7a是示出通过生物信息学平台的步骤8中的糖肽相关性分析而获 得的相关性图，所述生物信息学平台用于对以标准糖蛋白进行的实施例1 的N-连接糖肽进行识别和定量。糖肽的相对量以节点中的红色色度示出， 轮廓颜色基于图谱计数(spectrum count)。如表1所示，当串联质谱计数 的数值为0时，所述颜色显示出绿色；当串联质谱计数的数值为1时， 所述颜色显示出灰色。同样地，当该数值为2以上时，所述颜色显示出 黑色。

图7b是示出通过生物信息学平台的步骤8中的糖肽相关性分析而获 得的相关性图，所述生物信息学平台用于对以标准糖蛋白进行的实施例2 的N-连接糖肽进行识别和定量。糖肽的相对量以节点中的红色色度示出， 轮廓颜色基于图谱计数。如表2所示，当串联质谱计数的数值为0时， 所述颜色显示出绿色；当串联质谱计数的数值为1时，所述颜色显示出 灰色。同样地，当该数值为2以上时，所述颜色显示出黑色。

图8为示出相对于确定在实施例1的混合样品中的RNase B(核糖 核酸酶B)的浓度，对糖肽进行定量的图。

图9为示出相对于实施例2示出的加入至血浆中的AGP(α1-酸性糖 蛋白)的浓度，对糖肽进行定量的图。

具体实施方式

为了更加详细地描述本发明，对本说明书中所使用的术语进行如下 定义：

“蛋白酶”是指对含葡萄糖的糖蛋白的氨基酸键进行切割以生成肽 混合物的酶。

“串联质谱法”是用于对来自总质谱(MS)的所选离子(高丰度离 子或感兴趣的离子)的质谱进行分析(MS/MS)的方法。

“同位素”是指具有相同的原子序数但原子量不同的化学元素。

“同位素分组”是指对从实验获得的峰列表识别出的同位素进行分 组。

“N-糖肽同位素建模”是指由数据库建立的糖肽的理论同位素分布。

“S得分(相似度得分)”是指表示由实验获得的同位素峰分布与由 数据库理论推测的同位素峰分布之间的相似度的数值。

“δ”是指表示理论质量与经实验证实的实际质量之差的绝对值。

以下将对本发明进行详细描述。

本发明提供了用于对来自糖蛋白的N-连接糖肽进行识别和定量的新 型生物信息学平台，所述生物信息学平台包括如下步骤：

通过使用高分辨率质谱仪，对用蛋白酶将糖蛋白水解而制备的多肽 进行分析来获得质谱(步骤1)；

将在步骤1中获得的质谱转换为MS1(质谱1)和串联谱(MS/MS) (步骤2)；

计算各串联谱的M得分，所述串联谱选自于由显示出如下氧鎓离子 峰分子量的转换串联谱所组成的组：129.06、138.06、145.05、147.07、 163.06、168.07、186.08、204.08、274.09、292.10、350.15、366.14、454.16、 528.19和657.24(步骤3)；

使用在步骤3中获得的M得分选择糖肽谱(步骤4)；

获得在步骤4中选择的糖肽谱的MS1中的同位素分布，将该同位素 分布与数据库进行比较，从而计算S得分，并通过使用所计算的S得分 识别糖肽候选物(步骤5)；

通过使用串联谱中的E得分、Y得分和Y′得分，对来自步骤5中识 别的糖肽候选物的确切糖肽进行评价(步骤6)；

用在步骤6中评价的糖肽进行定量分析(步骤7)；以及

通过用在步骤6中定量的糖肽进行相关性分析，对同族N-糖肽进行 另外的识别和定量(步骤8)。

本发明还提供了通过同位素分布的比较，用来对糖肽进行更加精确 且有效的识别和定量的生物信息学平台。尤其是，本发明提供了在使用 M得分获得糖肽谱并使用Y得分、E得分或Y′得分再次对糖肽进行确认 和评价后，通过使用同位素分布来精确识别糖肽的方法。

以下将图1用作参考，逐步地对本发明的实施例进行更加详细的描 述。

在本发明的优选实施方式中，通过包括如下步骤的方法对糖肽进行 识别和定量，但并不总限于此：

1)通过用高分辨率质谱仪Orbitrap，对用胰蛋白酶将糖蛋白水解而 制备的多肽进行分析，获得所述多肽的质谱；

2)通过使用RawExtractor v1.9，将在步骤1中获得的质谱仪RAW 文件转换为ms1(TXT)文件格式，并进一步通过使用MM File Convertion  Tools v3.9将该ms1文件格式转换为ms2(MGF)文件格式；

3)由在步骤2中转换的ms2(MGF)文件的各HCD(高能碰撞解 离)谱计算M得分；

4)选择在步骤3中获得的M得分为至少1.5的糖肽谱；

5)获得在步骤4中选择的糖肽谱的MS1中的同位素分布，将该同 位素分布与数据库进行比较，从而对S得分为至少98.0的糖肽候选物进 行识别；

6)通过使用在步骤5中识别的糖肽候选物的HCD谱中的Y′得分和 CID(碰撞诱导解离)谱中的Y得分，对糖肽进行精确评价；

7)对在步骤6中识别的糖肽进行定量分析；以及

8)通过用在步骤6中识别的糖肽进行相关性分析，对同族N-糖肽 进行另外的识别和定量。

在本发明的另一优选实施方式中，优选通过包括如下步骤的方法对 糖肽进行识别和定量，但并不总限于此：

1)通过用高分辨率质谱仪Orbitrap，对用胰蛋白酶将糖蛋白水解而 制备的多肽进行分析，获得所述多肽的质谱；

2)通过使用RawExtractor v1.9，将在步骤1中获得的质谱仪RAW 文件转换为ms1(TXT)文件格式，并进一步通过使用MM File Convertion  Tools v3.9将该ms1文件格式转换为ms2(MGF)文件格式；

3)由在步骤2中转换的ms2(MGF)文件的各HCD(高能碰撞解 离)谱计算M得分；

4)选择在步骤3中获得的M得分为至少1.5的糖肽谱；

5)获得在步骤4中选择的糖肽谱的MS1中的同位素分布，将该同 位素分布与数据库进行比较，从而对S得分为至少98.0的糖肽候选物进 行识别；

6)通过使用在步骤5中识别的糖肽候选物的HCD谱中的Y′得分和 ETD(电子转移解离)谱中的E得分，对糖肽进行精确评价；

7)对在步骤6中识别的糖肽进行定量分析；以及

8)通过用在步骤6中识别的糖肽进行相关性分析，对同族N-糖肽 进行另外的识别和定量。

在本发明的另一优选实施方式中，优选通过包括如下步骤的方法对 糖肽进行识别和定量，但并不总限于此：

1)通过用高分辨率质谱仪Orbitrap，对用胰蛋白酶将糖蛋白水解而 制备的多肽进行分析，获得所述多肽的质谱；

2)通过使用RawExtractor v1.9，将在步骤1中获得的质谱仪RAW 文件转换为ms1(TXT)文件格式，并进一步通过使用MM File Convertion  Tools v3.9将ms1文件格式转换为ms2(MGF)文件格式；

3)由在步骤2中转换的ms2(MGF)文件中的各HCD(高能碰撞 解离)谱计算M得分；

4)选择在步骤3中获得的M得分为至少1.5的糖肽谱；

5)获得在步骤4中选择的糖肽谱的MS1中的同位素分布，将该同 位素分布与数据库进行比较，从而对S得分为至少98.0的糖肽候选物进 行识别；

6)通过使用在步骤5中识别的糖肽候选物的HCD串联谱中的Y′得 分，对糖肽进行精确评价；

7)对在步骤6中识别的糖肽进行定量分析；以及

8)通过用在步骤6中识别的糖肽进行相关性分析，对同族N-糖肽 进行另外的识别和定量。

在本发明的另一优选实施方式中，优选通过包括如下步骤的方法对 糖肽进行识别和定量，但并不总限于此：

1)通过用高分辨率质谱仪LTQ-FT，对用胰蛋白酶将糖蛋白水解而 制备的多肽进行分析，获得所述多肽的质谱；

2)通过使用RawExtractor v1.9，将在步骤1中获得的质谱仪RAW 文件转换为ms1(TXT)文件格式，并进一步通过使用MM File Convertion  Tools v3.9将ms1文件格式转换为ms2(MGF)文件格式；

3)由在步骤2中转换的ms2(MGF)文件中的各CID谱计算M得 分；

4)选择在步骤3中获得的M得分为至少0.5的糖肽谱；

5)获得在步骤4中选择的糖肽谱的MS1中的同位素分布，将该同 位素分布与数据库进行比较，从而对S得分为至少98.0的糖肽候选物进 行识别；

6)通过使用在步骤5中识别的糖肽候选物的CID串联谱中的Y得 分，对糖肽进行精确评价；

7)对在步骤6中识别的糖肽进行定量分析；以及

8)通过用在步骤6中识别的糖肽进行相关性分析，对同族N-糖肽 进行另外的识别和定量。

在本发明的另一优选实施方式中，优选通过包括如下步骤的方法对 糖肽进行识别和定量，但并不总限于此：

1)通过用高分辨率质谱仪Triple-Tof，对用胰蛋白酶将糖蛋白水解 而制备的多肽进行分析，获得所述多肽的质谱；

2)通过使用AB Science MS Data Convert v1.3和ProteoWizard v2.1 (http://proteowizard.sourceforge.net/)，将在步骤1中获得的质谱仪WIFF 文件转换为ms1(TXT)和ms2(MGF)文件格式；

3)由在步骤2中转换的ms2(MGF)文件中的各CID谱计算M得 分；

4)选择在步骤3中获得的M得分为至少1.5的糖肽谱；

5)获得在步骤4中选择的糖肽谱的MS1中的同位素分布，将该同 位素分布与数据库进行比较，从而对S得分为至少98.0的糖肽候选物进 行识别；

6)通过使用在步骤5中识别的糖肽候选物的CID串联谱中的Y得 分，对糖肽进行精确评价；

7)对在步骤6中识别的糖肽进行定量分析；以及

8)通过用在步骤6中识别的糖肽进行相关性分析，对同族N-糖肽 进行另外的识别和定量。

在本发明中，使用了高分辨率质谱仪，从而对更复杂且具有广泛多 样性的糖肽进行定性和定量分析，所述糖肽以低于一般肽的浓度存在。 为更快且更精确地对由质谱获得的结果进行分析，将M得分、S得分、 E得分、Y得分和y得分用于对糖肽进行识别和定量。

在上述方法中，在对一般肽谱和糖肽谱进行的分析中，使用如步骤3 中所示的M得分更加有效。可通过如下的数学式1计算所述M得分：

数学式1

(N：可观测到的氧鎓离子的数量；

n：观测到的氧鎓离子的数量；

I_i：重复分析(repeatitive analysis)中第i个峰的强度；以及

C：常数值)。

图2a示出糖蛋白标准样品(RNase B)的HCD谱的M得分分布图。 在这一分布图中，通过人工评价，将一般肽以蓝色示出，将糖肽以绿色 示出。通过ROC曲线(接受者操作特征曲线)示出一般肽与糖肽之间的 灵敏度和特异性的相关性，所述相关性为图2b中的AUC(曲线下面积)， 该AUC的值是0.98。

在上述方法中，如步骤5中所示，在糖肽的识别中使用S得分是有 利的，所述糖肽识别的特征在于，将从数据库获得的理论同位素分布与 通过实验获得的同位素分布进行比较，并进行筛选。所述S得分可通过 如下的数学式2计算：

数学式2

(X1：理论同位素峰中的第n个峰的质量；

Y1：通过实验获得的同位素峰中的第n个峰的质量；

X2：理论同位素峰中的第n个峰的相对强度；

Y2：通过实验获得的同位素峰中的第n个峰的相对强度；

C1：常数值；以及

C2：常数值)。

在上述方法的步骤4中，优选通过使用糖肽的理论同位素分布建立 糖蛋白的数据库，但并不总限于此。

在上述方法的步骤5中，优选通过使用欧几里得距离对同位素质量 分布的相似度进行测量，优选通过使用Pearson相关性分析对强度分布的 相似度进行测量，从而产生S得分，但并不总限于此。

在上述方法的步骤6中，Y得分是对串联谱(CID和HCD)中的理 论糖肽片段进行确认和评价的方法。本文中，可通过如下的数学式3计 算所述Y得分：

数学式3

(N：可观测到的糖肽片段的数量；

n：观测到的糖肽片段的数量；以及

I_i：重复分析中的第i个强度)。

在上述方法的步骤6中，串联谱是HCD谱，优选通过如下的数学式 4计算Y′得分，但并不总限于此。

数学式4

Y′得分＝Y得分+y得分

在本发明中，基于肽的b离子和y离子的理论分布，计算y得分。Y′ 得分是Y得分和y得分之和。

在上述方法的步骤6中，串联谱是ETD谱，优选通过如下得数学式 5计算E得分，但并不总限于此。

数学式5

(N：可观测到的糖肽片段的数量(c离子、z离子)；

n：观测到的糖肽片段的数量；以及

I_i：重复分析中的第i个强度)。

基于在上述方法的步骤6中使用串联谱(MS/MS)精确识别的糖肽， 另外对同族N-糖肽进行预测。优选不用串联谱(MS/MS)、而是在MS1 中使用S得分和MS精确度对糖肽进行识别和定量，但并不总限于此。

在本发明中，本发明人在表1中示出了使用通过高分辨率质谱仪 Orbitrap获得的HCD谱和CID谱，对糖蛋白标准样品(RNase B)的糖 肽进行识别和定量的结果。

表1

在步骤7中，通过使用标准糖蛋白(RNase B)对精确识别的糖肽进 行定量分析。通过计算各糖肽的离子色谱图中的面积进行所述定量分析。 用于计算面积的各数据点是3个最强同位素峰的和。在数据点的数值为 至少7的情况下，采用高斯分布并计算分布的面积，以定量值示出。在 图6a中以维恩图示出糖蛋白标准样品(RNase B)的定量分布。如图6a 中所示，NLTK_5200(5Hex2HexNac)为40％，NLTK_6200(6Hex 2HexNac)为26％，NLTK_8200(8Hex2HexNac)为16％，NLTK_7200 (7Hex2HexNac)为11％，NLTK_9200(9Hex2HexNac)为7％。上述 定量分布与参考文献(Kathryn R.Rebecchi.等，Label-Free Quantitation： A New Glycoproteomics Approach，J.Am.Soc.Mass.Spectrom，2009，20， 1048-1059)中的一致。通过用已识别的糖肽进行相关性分析、而不使用 MS/MS，对糖肽进行另外的识别和定量。表1中MS2谱(图谱计数)为 0是对糖肽进行另外的识别和定量的实例。在实施例2中，使用通过由高 分辨率质谱仪Orbitrap获得的HCD谱和ETD谱对糖蛋白标准样品 (RNase B)的糖肽进行识别和定量，结果在表2中示出。如图6b中所 示，确认了与上述相似的定量分布：NLTK_5200(5Hex2HexNac)为44％， NLTK_6200(6Hex2HexNac)为22％，NLTK_8200(8Hex2HexNac)为 17％，NLTK_7200(7Hex2HexNac)为9％，NLTK_9200(9Hex2HexNac) 为8％，在表2中示出。

表2

总之，本发明的方法有助于对来自糖蛋白标准样品的糖肽进行精确 识别和定量。如图7a和图7b中所示，实施例1和实施例2中用糖肽进 行的定性分析和定量分析的结果以相关性图表示。通过对这些图进行比 较，可容易地对结果进行比较。这一方法可被应用于对糖蛋白进行分析 的多种不同尝试中，尤其是被预期在生物相似性药物领域中非常有用。

在本发明中，用质谱仪Orbitrap对糖蛋白标准样品进行分析，但并 不总限于此。

在本发明中，用在人血清中发现的281种糖蛋白建立数据库，但并 不总限于此。

在本发明中，仅考虑了350种糖的糖基化，但并不总限于此。

在上述方法中，在步骤8中的识别和定量后，还增加了对糖肽之间 的相关性进行分析和对各比较样品之间的相似度进行标示(mapping)的 步骤，但并不总限于此。

在上述方法中，用于水解的酶选自于由胰蛋白酶、Arg-C、Asp-N、 Glu-C、Lys-C和胰凝乳蛋白酶所组成的组，但并不总限于此。

在上述方法中，本文中所使用的质谱仪选自于由LTQ-FT、Orbitrap、 Triple-Tof、Q-Tof和QExactive所组成的组，但并不总限于此。

在上述方法中，通过使用高分辨率质谱仪进行识别和定量，所述高 分辨率质谱仪具有至少10,000的质量分辨率和高达50ppm的质量精确 度，但并不总限于此。

在上述方法中，通过使用MS1谱中的S得分对用于定量的糖肽进行 选择，但并不总限于此。

在上述方法中，由MS1谱选择的用于定量的糖肽的强度以理论上预 期的3个最强峰的强度之和示出，但并不总限于此。

本文中的糖蛋白优选提取自血清、血浆、血液、尿液、脑脊液、羊 水、滑液或洗出液(lavage fluid)，但并不总限于此。

实施例

在如下的实施例、实验例和制造例中示例性地示出了本发明实际的 和当前优选的实施方式。

然而，本领域技术人员将理解的是，基于本文公开内容可在本发明 的精神和范围内进行修改和变化。

实施例1：样品制备和糖肽的定性/定量分析

糖蛋白标准样品RNase B(核糖核酸酶B)和AGP(α1-酸性糖蛋白) 购自Sigma-Aldrich。如表3中所示对所述两种样品进行混合。

表3

样品编号 1 2 3 4 5 6 7 RNase B 0.0375μg 0.075μg 0.15μg 0.5μg 1.0μg 2.0μg 5.0μg AGP 0.15μg 0.15μg 0.15μg 0.15μg 0.15μg 0.15μg 0.15μg

将各样品用胰蛋白酶在37℃下水解过夜。

使通过上述样品制备方法制备的多肽经过高分辨率质谱仪Orbitrap (Thermo Finnigan)，随后至LC/ESI-MS/MS。为检验各样品的可再现性， 所述分析重复三次。通过使用免费软件程序RawExtractor v1.9(The  Scripps Research Institute，La Jolla，CA)和MM File Convertion Tools v3.9 (http://www.massmatrix.net/mm-cgi/downloads.py)，将质谱仪RAW文件 转换为ms1(TXT)文件和ms2(MGF)文件。基于各质谱结果，通过 使用本发明用于对N-连接糖肽进行识别和定量的新型生物信息学平台， 对RNase B的糖肽进行识别和定量。

实施例2：样品制备和糖肽的定性/定量分析

糖蛋白标准样品AGP(α1-酸性糖蛋白)购自Sigma-Aldrich。从血 浆中去除6种高浓度的蛋白。如表4中所示，通过将AGP加入血浆来制 备样品混合物。

表4

样品编号 1 2 3 4 5 AGP 0.1μg 0.25μg 0.5μg 1.0μg 2.0μg 去除(蛋白)后的血浆 1.0μg 1.0μg 1.0μg 1.0μg 1.0μg

使通过上述样品制备方法制备的多肽经过高分辨率质谱仪Orbitrap (Thermo Finnigan)，随后至LC/ESI-MS/MS。为检验各样品的可再现性， 所述分析重复三次。通过使用免费软件程序RawExtractor v1.9(The  Scripps Research Institute，La Jolla，CA)和MM File Convertion Tools v3.9 (http://www.massmatrix.net/mm-cgi/downloads.py)，将质谱仪RAW文件 转换为ms1(TXT)文件和ms2(MGF)文件。基于各质谱结果，通过 使用本发明用于对N-连接糖肽进行识别和定量的新型生物信息学平台， 对AGP的糖肽进行识别和定量。

工业应用

如上文所述，可将本发明有效地用于开发和检验用于癌症诊断的新 的生物标志物，还可有效地用于生物相似性药物技术，以有助于对作为 糖蛋白生物治疗药物的糖肽和葡萄糖结构进行分析。