一种用于构建骨移植物的组织工程支架材料及其制备方法

摘要

本发明公开了一种用于构建骨移植物的组织工程支架材料及其制备方法和用途。所述支架材料含有：一脱钙骨；和一生物可降解聚电解质；所述生物可降解聚电解质自组装于脱钙骨之上。所述支架材料可用于构建组织工程骨移植物。

说明书

技术领域

本发明涉及一种组织工程支架材料领域，尤其涉及一种用于构建骨移植物 的组织工程支架材料及其制备方法。

背景技术

由于创伤导致的骨组织缺损是一种临床常见的骨科疾病。组织工程技术的 飞跃式发展为骨修复带来了一种理想的方法。支架材料作为骨组织再生的框架, 其特性直接影响种子细胞的生物学特性,影响细胞的生存、迁移、增殖和代谢 功能,因此它是骨组织工程中的关键要素之一。

在组织工程支架上接种骨细胞或诱导干细胞再回植修复骨有大量的研究。 脱钙骨是经脱钙降抗原处理的骨移植材料，它具有骨传导性和骨诱导性，它把 同种异体骨和异种骨移植推到了一个新的历史阶段。但是脱钙骨的细胞粘附性 较差及细胞增殖较慢的缺点使得其在骨组织工程中的应用受限。

因此本领域急需提供一种更佳的人工骨重建方法以满足骨修复的临床应 用。

发明内容

本发明旨在提供一种用于构建骨移植物的组织工程支架材料。

本发明的另一个目的是提供上述支架材料的制备方法。

本发明的再一个目的是提供一种骨移植物。

在本发明的第一方面，提供了一种用于构建骨移植物的组织工程支架材料， 所述支架材料含有：

一脱钙骨；和

一生物可降解聚电解质；

所述生物可降解聚电解质自组装于脱钙骨之上。

在另一优选例中，所述生物可降解聚电解质采用层层自组装技术涂覆于脱钙 骨表面；所述生物可降解聚电解质选自具有优良生物相容性的天然或合成高分子 材料，包括胶原(collagen)、明胶(gelatin)、海藻酸钠、壳聚糖(chitosan) 和聚氨基酸；更佳地，所述生物可降解聚电解质带相反电荷并交替层层自组 装于脱钙骨上。

在另一优选例中，所述支架材料通过以下步骤制备得到：

（i）使脱钙骨表面带上电荷；和

（ii）使生物可降解聚电解质自组装于脱钙骨上，得到如上所述的本发 明提供的支架材料。

在本发明的第二方面，提供了一种用于构建骨移植物的组织工程支架材料 的制备方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

（i）使脱钙骨表面带上电荷；和

（ii）使生物可降解聚电解质自组装于脱钙骨上，得到如上所述的本发 明提供的用于构建骨移植物的组织工程支架材料。

在另一优选例中，所述方法包括步骤:

（1）将脱钙骨浸泡于聚乙烯亚胺水溶液中，使脱钙骨表面带有正电荷；

（2）将表面带有正电荷的脱钙骨浸泡于pH4.5-6.5的含有带有负电荷 的生物可降解聚电解质溶液中，得到自组装有一层生物可降解聚电解质的脱 钙骨；

（3）将自组装有生物可降解聚电解质的脱钙骨浸泡于pH4.5-6.5的带 有正电荷的生物可降解聚电解质溶液中，得到自组装有两层生物可降解聚电 解质的脱钙骨；和

（4）重复（2）至（3）的步骤1－20次，得到如上所述的本发明提供的 用于构建骨移植物的组织工程支架材料。

更佳地，步骤（2）所述带有负电荷的生物可降解聚电解质溶液浓度为 0.5-2.0mg/ml；步骤（3）所述含有带有正电荷的生物可降解聚电解质溶液浓 度为0.5-2.0mg/ml；

步骤（2）和步骤（3）中所述的浸泡时间为10-30分钟。

更佳地，在步骤（1）、（2）、和（3）中都包括用pH4.5-6.5的缓冲 洗液冲洗未吸附的聚电解质的步骤，并在完成该步骤后进行下一步骤。

在本发明的第三方面，提供了一种如上所述的本发明提供的用于构建骨移 植物的组织工程支架材料的用途，用于制备骨移植物。

在本发明的第四方面，提供了一种骨移植物，所述骨移植物包括：

如上所述的本发明提供的用于构建骨移植物的组织工程支架材料；和接种 于该支架材料上的脂肪干细胞。

据此，本发明提供了一种更佳的人工骨重建方法以满足骨修复的临床应 用。

附图说明

图1显示了两种脱钙骨的外貌；其中图1A显示了普通脱钙骨，图1B显 示了本发明提供的自组装脱钙骨。

图2显示了狗脂肪干细胞分离后的培养状况；其中图2A显示了狗脂肪干 细胞原代培养3天的情况，图2B显示了狗脂肪干细胞第一代培养5天的情况。

图3显示了脂肪干细胞成骨定性染色情况；其中图3A显示了成骨诱导10 天ALP染色情况，图3B显示了成骨诱导14天茜素红染色情况。

图4显示了扫描电镜下成骨诱导后脂肪干细胞在脱钙骨上生长黏附情况； 其中图4A显示了成骨诱导后脂肪干细胞在本发明提供的自组装脱钙骨上粘附 情况,图4B显示了成骨诱导后脂肪干细胞在普通脱钙骨上粘附情况。

图5显示了共聚焦显微镜下成骨诱导后脂肪干细胞在脱钙骨上分布情况； 其中图5A显示了成骨诱导后脂肪干细胞在本发明提供的自组装脱钙骨上分布 情况，图5B显示了成骨诱导后脂肪干细胞在普通脱钙骨上粘附情况。

图6显示了实施例5的手术回植过程；其中图6A是暴露双侧颅骨,图6B 是拟回植脱钙骨(左侧（图6B1）为本发明提供的自组装脱钙骨，右侧（图6B2） 为普通脱钙骨），图6C是双侧各形成2.5×2全层颅骨缺损，图6D是一侧 缺损区为实验组，植入dASCs/自组装脱钙骨，另一侧为对照组植入dASCs/普 通脱钙骨。

图7显示了实施例5的空白对照组情况；其中A是术后即时的情况，B是 术后3月的情况，C是术后6月的情况。

图8显示了实验组和材料对照组CT检测；其中A是术后3月CT断层扫描， 左侧（图8A1）是dASCs/自组装脱钙骨复合物植入侧，右侧（图8A2）是dASCs/ 普通脱钙骨植入侧；B是术后6月CT断层扫描，左侧（图8B1）是dASCs/自组 装脱钙骨复合物植入侧，右侧（图8B2）dASCs/普通脱钙骨植入侧。

图9显示了实验组和材料对照组CT检测结果，其中A是dASCs/自组装脱 钙骨复合物植入侧术后3月三维CT，B是dASCs/普通脱钙骨植入侧术后3月三 维CT，C是dASCs/自组装脱钙骨复合物植入侧术后6月三维CT。D是dASCs/ 普通脱钙骨植入侧术后6月三维CT。

图10显示了术后3月修复大体标本；其中A是在体标本（图10A1是实验 侧，图10A2是对照侧），B是离体标本（图10B1是实验侧，图10B2是对照侧）。

图11显示了术后3月图10显示的实验侧组织学观察结果；其中A是实验 侧标本中部HE(100倍)，B是实验侧标本中部Azan(100倍)，C是实验侧标本 边缘HE(40倍)，D是实验侧标本边缘Azan(40倍)。

图12显示了术后3月图10显示的实验侧组织学观察结果；其中A是实验 侧标本中部硬组织切片(100倍)，B是实验侧标本中部四环素标记(100倍)，C 是实验侧标本边缘硬组织切片(40倍)，D是实验侧标本中部四环素标记(40倍)。

图13显示了术后3月图10显示的对照侧组织学观察结果；其中A是对照 侧标本中部HE(100倍)，B是对照侧标本中部Azan(100倍)，C是对照侧标本 边缘HE(40倍)，D是对照侧标本边缘Azan(40倍)。

图14显示了术后3月，图10显示的对照侧组织学观察结果；其中A是对 照侧标本中部硬组织切片(100倍)，B是对照侧标本中部四环素标记(100倍)， C是对照侧标本边缘硬组织切片(40倍)，D是对照侧标本中部四环素标记(40 倍)。

图15显示了术后6月大体标本情况；其中A是在体标本（图15A1是实验 侧，图15A2是对照侧），B是离体标本（图15B1是实验侧，图15B2是对照侧）。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，发现通过表面层层自组装聚氨基酸等聚电 解质可形成获得优异细胞粘附性能，并能促进细胞增殖的新型脱钙骨支架。在 此基础上，完成了本发明。

定义

如本文所用，单数形式“一”、“一个”、“一种”、“该”和“所述” 等均包括相关的复数名词，除非在上下文中以别的方式另外强调提出。

如本文所用，“脱钙骨”或“脱钙骨基质（decalcified bone matrix， DBM)”是同一概念，都是指由同种异体骨或异种骨经脱钙处理，能降低免疫原 性的骨移植材料。

如本文所用，“室温”是指20-30℃，优选22-28℃，更优选25±2℃。

如本文所用，“生物可降解聚电解质自组装于脱钙骨之上”是指在脱钙骨 表面构建用于骨修复的组织工程支架材料。

制备方法

本发明提供一种用于构建骨移植物的组织工程支架材料的制备方法，所 述方法是将脱钙骨进行预处理，使脱钙骨表面带上电荷后，使生物可降解聚 电解质自组装于脱钙骨上，得到一种用于构建骨移植物的组织工程支架材料。

具体地，所述的制备方法包括步骤:

第一步，将脱钙骨浸泡于聚乙烯亚胺水溶液中，使脱钙骨表面带有正电 荷；

第二步，将表面带有正电荷的脱钙骨浸泡于pH4.5-6.5的带有负电荷的 生物可降解聚电解质溶液中，得到自组装有一层生物可降解聚电解质的脱钙 骨；

第三步，将自组装有生物可降解聚电解质的脱钙骨浸泡于pH4.5-6.5的 带有正电荷的生物可降解聚电解质溶液中，得到自组装有两层生物可降解聚 电解质的脱钙骨；

第四步，重复第二至第三步1－20次，得到一种用于构建骨移植物的组织 工程支架材料。

上述第一步中所述聚乙烯亚胺水溶液的浓度为0.5至2.0mg/ml，优选 0.8-1.5mg/ml，更佳地，浓度是1mg/ml，浸泡时间2-5小时，优选3-4小时。

在本发明的一个优选例中，上述第一步是将脱钙骨室温浸泡于0.5至2.0 mg/ml的聚乙烯亚胺水溶液中反应2-5小时，取出脱钙骨后再浸泡于pH3.5-4.5 的盐酸溶液中3-7分钟，取出用去离子水冲洗后再进行第二步。

上述第二步中所述带有负电荷的生物可降解聚电解质优选聚氨基酸、海藻 酸盐；更优选聚L-谷氨酸。

上述第三步中所述带有正电荷的生物可降解聚电解质选自胶原、明胶、壳聚 糖；优选壳聚糖。

上述第二和第三步中涉及的含有生物可降解聚电解质的溶液首先需确保 能够获得均一的溶液，即生物可降解聚电解质完全溶解，其次所获得的均一 溶液的pH值与希望获得的电性的电荷的量有关，可根据具体情况使用本领域 熟知的方式调节，pH优选5.0-6.0，更优选5.5。

上述第二和第三步中涉及的含有生物可降解聚电解质溶液浓度以自组装 在脱钙骨上的生物可降解聚电解质是均一溶液为准，一般浓度低的，第四步 中的重复次数多，浓度高的，第四步中的重复次数少。例如当浓度为1mg/ml 时，步骤（4）中可重复10±1次。一般选择0.5至2.0mg/ml，优选0.8-1.5mg/ml， 更佳地，浓度是1mg/ml。

上述第二和第三步中涉及的浸泡，其时间以使自组装在脱钙骨上的生物 可降解聚电解质是均一溶液为准，与溶液浓度等相关，例如在浓度为1mg/ml 时，浸泡时间为20分钟。

上述步骤第二和第三步中由于都涉及将电荷负载在脱钙骨上，因此需要 用缓冲洗液冲洗未吸附牢固的带有电荷的物质，为了冲洗干净，可重复冲洗 数次。在一优选实施例中，所述缓冲洗液的pH值与相应步骤中使用的含有带 电荷的生物可降解聚电解质溶液的pH值相同。所述缓冲洗液所带有的离子越 少越好，在一优选实施例中，是pH约5.5的水溶液。

在本发明的一个实施例中，所述用于构建骨移植物的组织工程支架材料的 制备方法包括以下步骤：

a）脱钙骨的表面阳离子化

脱钙骨的表面阳离子化是将脱钙骨室温浸泡于一定浓度的聚乙烯亚胺水 溶液中反应数小时，取出脱钙骨，用去离子水冲洗干净，再浸泡于一定pH溶 液中，取出，用去离子水冲洗干净；

b）脱钙骨的层层自组装

将聚L-谷氨酸（PGA）与壳聚糖(CS)分别在去离子水中配制成一定浓度的 溶液，溶解过程中，PGA需在稀NaOH溶液中溶解，CS需在一定浓度的乙酸溶 液中，然后调节pH。经表面阳离子化的脱钙骨浸入到带有负电荷的PGA溶液 中，浸泡一段时间，取出，用缓冲洗液将未吸附牢固的PGA冲洗干净，然后 浸入到带有正电荷的CS溶液中，浸泡一段时间，取出用缓冲洗液冲洗干净， 继续浸泡到PGA溶液中。如此反复浸泡，冲洗若干次，便可在脱钙骨表面组 装得(CS/PGA)n多层自组装聚电解质膜。

支架材料

本发明通过上述的制备方法得到一种用于构建骨移植物的组织工程支架材 料，所述支架材料含有：一脱钙骨；和一生物可降解聚电解质；所述生物可降解 聚电解质自组装于脱钙骨之上；所述生物可降解聚电解质包括可降解性合成高 分子材料和天然可降解材料，电荷相反的聚电解质交替自组装于脱钙骨上。

本发明提供的支架材料中涉及的生物可降解聚电解质是具有优良生物相容性 的天然或合成高分子材料，如胶原(collagen)、明胶(gelatin)、海藻酸钠、 壳聚糖(chitosan)和聚氨基酸等聚电解质。

骨移植物

通过本发明提供的支架材料，经本领域常规的构建组织工程移植物的方法 可以得到骨移植物。

本发明提供的骨移植物含有一本发明提供的支架材料和一种子细胞，且以 移植物的总体积计，种子细胞的含量为1×10⁵个细胞/ml-5×10⁸个细胞/ml。

所述骨移植物可以通过将种子细胞接种于本发明提供的支架材料上；所 述种子细胞可选自脂肪干细胞。

本发明提供的组织工程化骨移植物中，还可添加或复合其他各种细胞因 子、生长因子、各种转基因成分。

本发明提供的骨移植物体外培养一段时间后用于完成骨修复。

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所 揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何 可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特 征仅为均等或相似特征的一般性例子。

本发明的主要优点在于：

1、首次对脱钙骨表面进行自组装处理。

2、通过表面层层自组装聚氨酸等聚电解质可获得具有优异细胞粘附性能， 并能促进细胞增殖的新型脱钙骨支架。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所 有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。

本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是 指在100毫升的溶液中溶质的重量。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟 悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于 本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1

自组装改性脱钙骨的制备

（1）脱钙骨表面阳离子化：将脱钙骨室温浸泡于1mg/ml的聚乙烯亚胺水 溶液中反应3～4小时，取出脱钙骨，用去离子水冲洗干净，再浸泡于pH=4.0 的盐酸溶液中5min，取出，用去离子水冲洗干净。

（2）脱钙骨层层自组装：将聚L-谷氨酸（PGA）与壳聚糖(CS)在去离子水 中配制成1mg/ml的溶液，溶解过程中，PGA需在稀NaOH溶液中（约0.01M） 溶解，CS需在1%的乙酸溶液中，然后调节pH=5.5。经表面阳离子化的脱钙骨 浸入到带有负电荷的PGA溶液中，浸泡20min，取出，用缓冲洗液（pH=5.5的 水溶液）将未吸附牢固的PGA冲洗干净，然后浸入到带有正电荷的CS溶液中， 浸泡20min，取出用缓冲洗液冲洗干净，继续浸泡到PGA溶液中。如此反复浸 泡，冲洗若干次，便可在脱钙骨表面组装得(CS/PGA)多层自组装聚电解质膜。

实施例2

狗脂肪干细胞（dASCs)分离与培养

（1）取1岁大的杂交犬，雌雄不限。按10mg/kg肌注氯胺酮诱导后，肌 注速眠新0.1ml/kg全麻，常规消毒铺巾。切取腹股沟皮下脂肪组织约2-3g， 将脂肪组织在无菌条件下装入灭菌的装有PBS离心管中，原代培养在4h内进 行。缝合手术切口，局部涂抹金霉素药膏抗感染。待动物苏醒后送入饲养笼中。 将脂肪组织带回实验室处理。

（2）用链霉素溶液及PBS反复冲洗脂肪组织。将脂肪组织置于直径为10cm 的培养皿中，充分剪碎。将剪碎后的脂肪组织置于50ml的离心管中，加入0.075% Ⅰ型胶原酶溶液40ml，在37℃恒温摇床消化30min后，1500rmp离心10min， 除去上清液并获得高密度的细胞沉淀物，加入DMEM+10%FBS培养液使细胞重悬， 按10⁶细胞密度接种培养皿内，加入7ml培养液。

（3）将接种好细胞的培养皿置于37℃，5%CO₂，100%饱和湿度的条件下， 培养48-72小时候首次换液。倒置显微镜下观察有大量细胞贴壁和漂浮的血细 胞，用PBS反复冲洗去除漂浮的细胞，加入DMEM+10%FBS培养液。隔天换液， 细胞融合至80%传代。传代前用少量PBS洗涤一次，加入0.25%胰蛋白酶和 0.02%EDTA2ml，见大部分细胞胞质回缩、形态变圆，加入2ml含血清的DMEM 培养液中止消化，将液体移入离心管，1500rmp离心5min，去除上清液，将离 心管轻轻敲打，均匀分三份加入培养皿，加入DMEM培养液。3-4天后细胞可达 到近融合状态，便可再次传代。取第二代dASCs备用。倒置纤维镜下观察细胞 形态，拍照。

实施例3

脂肪干细胞向成骨细胞诱导分化

（1）配制成骨细胞诱导培养液：DMEM+10%FBS；β-磷酸甘油钠10nM/L； 抗坏血酸50μM/L；L-谷氨酰胺300mg/L；1,25(OH)2VD₃10nM/L。

（2）将第二代dASCs以5×10⁴/ml接种于60mm培养皿中，37℃、5%CO₂、 100%饱和湿度的条件下培养24小时，待细胞完全贴壁。

（3）吸净细胞培养液并用PBS洗涤一次，加入5ml成骨诱导液，放入37 ℃、5%CO₂、100%饱和湿度培养箱中培养14天，隔天换液；倒置荧光显微镜观 察细胞形态，拍照。

诱导分化细胞的鉴定:

ALP染色

依照Sigma Diagnostic Kit85对成骨诱导后的hASCs进行ALP染色，具 体步骤如下：

(1)用50ml的离心管取48ml蒸馏水，调整水温至18-26°C。

(2)配制重氮盐溶液：将Fast Violet B胶囊中的粉末倒入上步48ml蒸馏 水中，充分溶解混匀。

(3)向上步所得的溶液中加入2ml Naphthol AS-MX Phosphate Alkaline Solution，混匀。

(4)将配制好的固定液调整到室温。带染色的细胞用固定液固定30s，去离 子水洗45s。保持培养皿湿润。

(5)6孔板每孔加入第三步配制的染液1ml，18-26°C避光反应30min，弃 去染液。

(6)30min后，去离子水洗2min，保持六孔板各孔湿润，显微镜下观察染 色结果。

茜素红染色

(1)以Tris-HCl缓冲液溶解茜素红粉剂配制成1%的染色液，调整pH值为 4.2

(2)以冰冷的70%乙醇溶液固定细胞1小时

(3)倾去固定液,ddH₂O清洗两遍，室温水平振荡状态下（60rpm）以茜素 红染液染色20分钟

倾去染液，ddH₂O清洗两遍，倒置显微镜下观察、拍照，矿化结节着深红 色

实施例4

诱导细胞在脱钙骨上接种及标记

(1)无菌条件下，诱导培养14天细胞用少量PBS清洗一次，加入0.25%胰 蛋白酶和0.02%EDTA2ml，见大部分细胞胞质回缩、形态变圆，加入2ml含血 清的DMEM培养液终止消化，收集细胞悬液。将液体移入离心管，1500rmp离心 5min,去除上清液，重悬细胞，用移液管均匀滴加在脱钙骨上，37℃、5%CO2、 100%饱和湿度培养箱中放置4小时，加入DMEM完全培养液6ml，放入培养箱过 夜。隔天换液，共培养7天，备用。

（2）CM-Dio试剂1：200用无血清DMEM溶液稀释，混合均匀，在脱钙骨 上培养的诱导分化细胞第5天换液时，加入含有CM-Dio的DMEM在培养箱中放 置1天。一天后用PBS轻轻清洗脱钙骨，换含血清的DMEM培养液，继续放入 培养箱中。培养第7天倒置荧光显微镜观察细胞形态，拍照。

实施例5

颅骨缺损修复及修复效果评估

(1)颅骨缺损模型的建立及手术移植

实验组（n=5只）：颅骨缺损区植入ASCs/自组装脱钙骨（decalcification bone matrix，DBM）；材料对照组：颅骨缺损区植入dASCs/普通DBM，采用实 验组自身对照（n=5只）；空白对照组（n=5只）：双侧颅骨区造成缺损后旷 置。

狗麻醉前禁食12小时，禁水4小时。氯胺酮10mg/kg肌注，进行诱导麻 醉，速眠新0.1ml/kg肌注麻醉，整个过程中动物保持俯卧位。动物麻醉平稳 后，常规消毒铺巾，头部正中矢状切口，暴露双侧颅骨区，使用颅骨转，双侧 各形成2.5×2cm²全层颅骨缺损,同时去除缺损区骨膜，彻底止血。一侧缺损区 为实验组，植入dASCs/自组装DBM。另一侧为对照组植入dASCs/普通DBM。

(2)术后新生骨的评价。结果见图7。结果表明，术后CT检查显示对照组 双侧颅骨缺损均未见修复。

①三维CT检查：术后3，6月颅骨三维CT检查。结果见图8。图8A的结 果表明，已出现局部低密度区，表明材料开始出现降解。图8B的结果表明， 无高密度区，表明材料已降解。

图9B的结果表明，已出现局部低密度区，表明材料开始出现降解。

图9C的结果表明，组织工程骨逐渐形成，修复颅骨缺损。图9D的结果表 明，无高密度区，表明材料已降解。

②大体观察：术后3，6月取材时，暴露双侧颅骨区观察愈合情况,结果见 图10和15。图10的结果表明，暴露手术区域，双侧缺损区均有组织存在，实 验侧组织质地较硬，对照侧质地软

图15的结果表明，双侧缺损区均有组织存在，实验侧为骨组织修复，组 织质地较硬，对照侧缺损区由肌肉组织填充，质地软。

③组织学观察：术后3，6月取材，实验侧和对照侧标本中部和边缘分别 取材，石蜡包埋，组织学切片，进行HE和Azan三色染色。

④硬组织切片和四环素标记新生骨：术后3，6月取材，实验侧和对照侧 标本中部和边缘分别取材，取材前二周静脉滴注四环素10mg/kg。

(3)HE染色观察各组颅骨缺损修复情况：

术后3,6月处死。取下实验部位，经固定后，常规石蜡包埋，4um切片。 切片用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗：二甲苯（Ⅰ）5min→二甲苯（Ⅱ）5min →100%乙醇2min→95%乙醇1min→80%乙醇1min→75%乙醇1min→蒸馏水洗 2min。苏木红染色5min，自来水洗。盐酸乙醇分化30s（提插数下）。自来水 浸泡15min或温水（约50℃）5min。置伊红液2min。然后进行常规脱水，透 明，封片：95%乙醇（Ⅰ）1min→95%乙醇（Ⅱ）1min→100%乙醇（Ⅰ）1min→ 100%乙醇（Ⅱ）1min→二甲苯石碳酸（3:1）1min→二甲苯（Ⅰ）1min→二甲 苯（Ⅱ）1min→中性树脂封固。拍照。

（4）Azan染色法观察各组颅骨修复情况：

术后3,6月处死。取下实验部位，经固定后，常规石蜡包埋，4um切片。 入偶氮卡红液4-8小时，37℃染色；切片冷却后入蒸馏水漂洗；于1%苯胺的 95%酒精液分色至淡红色；0.5%磷乌酸水溶液媒染3-5分钟；入苯胺蓝-橘黄G 染液0.5-1小时；滤纸沾干后在95%酒精分色1/2-1分钟梯度酒精脱水；二甲 苯透明；中性树胶封片。拍照。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术 内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任 何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相 同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。