一种气相色谱-质谱检测土壤溶液中酰基高丝氨酸内酯的方法

摘要

本发明公开了一种气相色谱-质谱检测土壤溶液中酰基高丝氨酸内酯的方法，属于分析化学技术领域。本发明的步骤为：一、将HSLs标准品用乙酸乙酯配制成标准储备液；二、取土壤分别以土水比1:2、1:5、1:10的比例加入离心管中震荡，取上清液，向上清液中加入混标样品涡旋混匀；三、将乙酸乙酯加入制得的溶液中，萃取、离心，吸取乙酸乙酯相于含有无水Na

说明书

技术领域

本发明涉及土壤溶液中化合物的气质联用分析技术领域，更具体地说，涉及一种气相色 谱-质谱检测土壤溶液中酰基高丝氨酸内酯的方法。

背景技术

群体感应(Quorum sensing，QS)是指微生物自发产生、释放一些特定的信号分子，并 能感知其浓度变化，从而调节微生物的群体行为。随着微生物学的深入发展，QS现象渐渐被 大家所熟知。许多微生物的生理特性和活动都与群体感应息息相关。由于小分子在细菌胞间 传递信息，在某种意义上使得细菌间能相互交流。革兰氏阴性细菌的群体感应一般都是由 LuxI/R型信息系统调控，并以酰基高丝氨酸内酯(acyl-homoserine lactones，HSLs)作为信 号分子。HSLs是一类特殊的小分子水溶性化合物，能够很容易通过细胞膜。研究表明，许多 革兰氏阴性菌都靠分泌HSLs进行交流和协调群体行为，如生物体发光、蛋白酶活性、抗生 素的产生等等。

目前，对HSLs信号分子检测方法主要有酶联免疫、生物传感器、薄层层析和色谱方法。 色谱方法包括气相色谱-质谱(gas chromatography-mass，GC-MS)、超级液相色谱(UPLC)、 傅立叶变换离子回旋共振质谱(FT-ICR-MS)等。其中，生物传感器和薄层层析是分析HSLs化 合物最常用的方法。生物传感器检测精度能够达到飞摩尔级，但是每种HSLs都需要特定的 菌株和质粒，并且完成测定需要一天的时间。薄层层析的精度不高，只能用来测定较高浓度 的HSLs。酶联免疫法简单、方便、快捷，但不能确定HSLs结构。超级液相色谱可以同时定 量分析含羟基、羰基的多种HSLs，傅立叶变换离子回旋共振质谱是一种新兴的鉴定HSLs结 构的方法，精度高。但由于这两种方法使用仪器比较昂贵，还无法普及到普通的实验室。 GC-MS方法能够同时定性、定量地检测HSLs。但目前常规使用的GC-MS检测HSLs的方法 还不够优化，且主要是针对纯溶液体系，对于复杂介质(比如土壤、沉积物)中的HSLs测 定还不能提供准确的检测方法。

发明内容

1.发明要解决的技术问题

本发明提供了一种气相色谱-质谱检测土壤溶液中酰基高丝氨酸内酯的方法，克服了现有 HSLs信号分子检测技术所存在的检测精度低、检测成本高、耗时以及不能很好地应用于复杂 介质(比如土壤)中的HSLs测定等问题。

2.技术方案

为达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

本发明的一种气相色谱-质谱检测土壤溶液中酰基高丝氨酸内酯的方法，其步骤为：

步骤一、将HSLs标准品用乙酸乙酯溶解并配制成1000mgL^-1的标准储备液，于-20℃ 下保存备用，所述的HSLs标准品为C₄-HSL、C₆-HSL、C₇-HSL、C₈-HSL、C₁₀-HSL、C₁₂-HSL 和C₁₄-HSL；

步骤二、取土壤分别以土水比1:2、1:5、1:10的比例加入离心管中，震荡制备土壤溶液， 离心分离，取上清液，向上清液中加入混标样品涡旋混匀，所述的混标样品为由步骤一制得 的C₄-HSL、C₆-HSL、C₇-HSL、C₈-HSL、C₁₀-HSL、C₁₂-HSL和C₁₄-HSL标准储备液稀释混合 配制而成；

步骤三、将乙酸乙酯加入步骤二制得的含HSLs的溶液体系中，漩涡萃取、离心分离， 取乙酸乙酯相于含有无水Na₂SO₄的离心管中，漩涡混匀、离心分离，吸取有机相于进样瓶中；

步骤四、对步骤三得到的有机相中所含HSLs进行GC-MS检测，优化的色谱条件包括： 进样口温度290℃，初始色谱柱温度设为100℃，以35℃min-¹升至150℃，紧接着以25℃ min^-1升至280℃，保持6分钟，后运行温度为290℃，保持2分钟。

更进一步地，步骤四进行GC-MS检测时，采用分流进样模式，分流比为5:1。

更进一步地，步骤二所述的震荡制备土壤溶液，震荡速率为160rpm，震荡时间为8h， 然后以4000rpm的速率离心5min，取上清液。

更进一步地，步骤三加入1mL乙酸乙酯于含有0.5mL溶液体系的离心管中，漩涡萃取2 min，以12000rpm的速率离心2min，取乙酸乙酯相于含有无水Na₂SO₄的离心管中后，漩涡 混匀2min，以12000rpm的速率离心2min。

更进一步地，步骤四进行色谱分析时，所用的色谱柱为Agilent HP-5MS石英毛细管柱， 载气为高纯氦气。

更进一步地，步骤四所述的色谱条件还包括：流速1mL min-¹；进样量1_μL，分析时间 为：15min；传输线温度为280℃。

更进一步地，步骤四进行GC-MS检测的质谱条件为：电子能量70eV，离子源温度230℃， 四级杆温度150℃，选择m/z143离子作为标记碎片进行选择离子检测。

3.有益效果

采用本发明提供的技术方案，与已有的公知技术相比，具有如下显著效果：

(1)本发明的一种气相色谱-质谱检测土壤溶液中酰基高丝氨酸内酯的方法，建立了利 用GC-MS测定土壤溶液中HSLs的分析方法，在制备检测样品过程中进行了多级离心、萃取 操作，且对离心震荡速率、时间等进行了优化调控，为后续GC-MS测定奠定了很好的基础；

(2)本发明的一种气相色谱-质谱检测土壤溶液中酰基高丝氨酸内酯的方法，利用GC-MS 测定技术，该技术柱效高，易维护，发展迅速且较为成熟，且本发明在采用GC-MS对HSLs 进行定性定量分析时，对色谱和质谱条件进行了优化，操作简便，快速准确，检测精度、灵 敏度高，适用于土壤溶液中多种HSLs信号分子化合物的同时定性与定量分析；

(3)本发明的一种气相色谱-质谱检测土壤溶液中酰基高丝氨酸内酯的方法，通过加标 回收率实验可得乙酸乙酯对土壤溶液中C₆-HSL、C₇-HSL、C₈-HSL、C₁₀-HSL、C₁₂-HSL、C₁₄-HSL 的萃取具有较高的回收率，为进一步深入研究HSLs信号分子在土壤中的环境行为奠定了基 础。

附图说明

图1为本发明中7种酰基高丝氨酸内酯(HSLs)标准品的GC-MS色谱图；

图2～图8为本发明中7种酰基高丝氨酸内酯(HSLs)标准品的GC-MS质谱图。

具体实施方式

为进一步了解本发明的内容，结合附图和实施例对本发明作详细描述。

仪器与试剂：本发明的一种气相色谱-质谱检测土壤溶液中酰基高丝氨酸内酯的方法，采 用GC-MS(美国Agilent7890A/5975C，7693自动进样器)检测器，乙酸乙酯(色谱纯)购 于J.T.Baker公司(美国)，实验用水为去离子水，HSLs标准品(C₄-HSL，C₆-HSL，C₇-HSL， C₈-HSL，C₁₀-HSL，C₁₂-HSL，C₁₄-HSL)购于美国Sigma公司，纯度≥97％。乙酸乙酯(色谱 纯)购于J.T.Baker公司(美国)。将7种HSLs标准品分别用乙酸乙酯溶解并配制成1000mg L^-1的标准储备液，于–20℃下保存备用。采用带自动进样器的GC-MS(美国Agilent 7890A/5975C)对HSLs进行定性定量分析，本发明使用的GC-MS检测仪价格相对较低，可以 在普通的实验室推广使用，使得本发明的检测成本降低。

实施例1

本实施例着重于分析对标准溶液中酰基高丝氨酸内酯(HSLs)GC-MS测定方法的优化。

步骤一：分别取10μL上述7种HSLs标准储备液于2mL进样瓶，加入990μL乙酸乙 酯进行稀释至10mg L^-1，然后于新进样瓶中分别将其逐级稀释至10μg L^-1、20μg L^-1、50μg L^-1、100μg L^-1、200μg L^-1、300μg L^-1、400μg L^-1、500μg L^-1、600μg L^-1、800μg L^-1、1000 μg L^-1、2000μg L^-1，使用GC-MS检测。

步骤二：设定质谱仪参数，质谱条件为：电子能量70eV、离子源温度230℃、四级杆 温度150℃下，采用全扫描模式。

步骤三：设定色谱条件参数：进样口温度290℃，分流进样，分流比为5:1，初始色谱 柱温度设为100℃，以35℃min^-1升至150℃，紧接着以25℃min^-1升至280℃，保持6 分钟，后运行温度为290℃，保持2分钟。

在优化各种条件以后，7种HSLs在12min内完全分离(参见图1)，出峰顺序和保留时 间参见表1。最优条件下，5次连续测定同一标准品，保留时间的标准偏差小于0.2％。

步骤四：选择m/z143离子作为标记碎片进行离子检测，对7种HSLs的色谱峰进行质谱 鉴定。

从图2～图8可以看到，每种化合物的质谱图均呈现各自的分子离子峰[M]⁺，即C₄-HSL (m/z171)，C₆-HSL(m/z199)，C₇-HSL(m/z213)，C₈-HSL(m/z227)，C₁₀-HSL(m/z255)， C₁₂-HSL(m/z283)，C₁₄-HSL(m/z311)。从这7种HSLs的离子碎片中发现，m/z143处丰度值 较高，7种HSLs分子均含有丰富的m/z143碎片离子，选择m/z143离子作为标记碎片进行 离子检测，提高了检测精度，获得了更好的检测效果。

从表1还可以看出，7种HSLs的检出限在1.5～2.5μg L^-1之间，而且，标准工作曲线在 2000μg L^-1以内都有很好的线性关系，其决定系数R²均大于0.997。可见本实施例的方法准 确度、检测精度、灵敏度高。此外，本实施例大部分检测操作通过优化控制GC-MS检测仪 完成，操作简便、快速准确。

表1 7种酰基高丝氨酸内酯(HSLs)标准溶液的线性关系和检出限

实施例2

本实施例着重于分析7种酰基高丝氨酸内酯(HSLs)在土壤溶液中的检出限。

步骤一：在50mL离心管中分别加入10g海南砖红壤或南京黄棕壤，然后以土水比1:2 的比例加入20mL水，以160rpm震荡8h制备土壤溶液，接着以4000rpm的速率离心5min， 分别取上清液0.5mL于2mL离心管中。

步骤二：向步骤一吸取的上清液中，分别加入不同浓度梯度的混标样品(由C₄-HSL、 C₆-HSL、C₇-HSL、C₈-HSL、C₁₀-HSL、C₁₂-HSL和C₁₄-HSL标准储备液稀释混合配制而成)， 涡旋混匀10秒。

步骤三：取1mL乙酸乙酯，加入上述离心管中，漩涡萃取2min，12000rpm的速率离 心2min后，分别吸取上层乙酸乙酯相于新离心管(离心管中事先加入1g无水Na₂SO₄)中， 漩涡振荡2min，12000rpm的速率离心2min后，吸取上层有机相0.5mL于进样瓶中。

步骤四：按照实施例1所述步骤二至四进行GC-MS测定。

7种HSLs在土壤溶液中的检出限及其标准工作曲线见表2。可以看到，7种HSLs的检 出限在3.0～5.0μg L^-1之间，而且，标准工作曲线在2000μg L^-1以内都有很好的线性关系， 其决定系数R²均大于0.997。5次连续测定同一样品，保留时间的标准偏差小于0.2％。可见 本实施例的方法可以用于土壤溶液样品中HSLs的分析测定，而且准确度、检测精度、灵敏 度高。

结合表1和表2，可得7种HSLs标准工作曲线都一致，表明本实施例的方法稳定性和重 复性好。

表2 7种酰基高丝氨酸内酯(HSLs)在土壤溶液中的检出限

实施例3

本实施例着重于分析水溶液中酰基高丝氨酸内酯(HSLs)的提取回收率。

步骤一：取0.5mL去离子水于2mL离心管中，分别加入10μL25mg L^-1或10μL100mg L^-1的混标样品(由C₄-HSL、C₆-HSL、C₇-HSL、C₈-HSL、C₁₀-HSL、C₁₂-HSL和C₁₄-HSL标 准储备液稀释混合配制而成)，涡旋混匀10秒，使得溶液中HSLs的浓度为0.5mg L^-1或2mg L^-1。

步骤二：取1mL乙酸乙酯，加入上述离心管中，漩涡萃取2min，12000rpm的速率离 心2min后，分别吸取上层乙酸乙酯相于新离心管(离心管中事先加入1g无水Na₂SO₄)中， 漩涡振荡2min，12000rpm的速率离心2min后，吸取上层有机相0.5mL于进样瓶中。

步骤三：按照实施例1所述步骤二至四进行GC-MS测定。

本实施例在制备检测样品过程中进行多级离心、萃取操作，且对离心震荡速率、时间等 进行了优化调控，使得后续的GC-MS测定能够有更高的准确度和检测精度。

水中HSLs的回收率检测结果参见表3，在去离子水加标回收率实验中，7种HSLs的回 收率的标准偏差在0～8.11％之间，表明本实施例的方法精密度很高。除了C₄-HSL以外，其 他6种HSLs的回收率均较高：当加标浓度为0.5mg L^-1时，回收率在76％～85％之间；加标 浓度为2mg L^-1时，回收率在74％～97％之间。

表3 水中酰基高丝氨酸内酯(HSLs)的加标回收率

实施例4

本实施例着重于分析土壤溶液中酰基高丝氨酸内酯(HSLs)的提取回收率。

步骤一：取海南砖红壤、南京黄棕壤分别以土水比1:2、1:5、1:10的比例加入到50mL 离心管，以160rpm震荡8h制备土壤溶液，接着以4000rpm的速率离心5min，分别取上清 液0.5mL于2mL离心管。

步骤二：向离心管中分别加入10μL25mg L^-1或10μL100mg L^-1的混标样品(由C₄-HSL、 C₆-HSL、C₇-HSL、C₈-HSL、C₁₀-HSL、C₁₂-HSL和C₁₄-HSL标准储备液稀释混合配置而成)， 涡旋混匀10秒，使得离心管溶液中HSLs的浓度为0.5mg L^-1或2mg L^-1。

步骤三：加入1mL乙酸乙酯，漩涡萃取2min，12000rpm的速率离心2min，吸取上层 乙酸乙酯相于含有1g无水Na₂SO₄的新离心管，漩涡混匀2min，12000rpm的速率离心2min， 吸取上层有机相0.5mL于进样瓶中。

步骤四：按照实施例1所述步骤二至四进行GC-MS测定。

表4为本实施例不同土水比土壤溶液中HSLs的加标回收率，与水溶液中HSLs的回收率 实验结果类似，从表4可得：除了C₄-HSL以外，其他6种HSLs在2种土壤的3个土水比溶 液中的回收率均较高，不同土水比的土壤溶液中其余6种HSLs的加标回收率总体都在71％～ 104％之间。而且，两种土壤的3种土水比溶液中同一种HSLs的回收率都没有显著差异，表 明土壤溶液中的有机、无机化合物对本实施例的测定方法没有影响，说明本实施例的检测方 法可以有效用于不同土壤溶液中HSLs的定量检测与比较。

表4 不同土水比土壤溶液中酰基高丝氨酸内酯(HSLs)的加标回收率

实施例5

本实施例着重于对土壤溶液中酰基高丝氨酸内酯(HSLs)的测定。

步骤一：在50mL离心管中加入10g海南砖红壤，然后以土水比1:2的比例加入20mL 水，以160rpm震荡8h制备土壤溶液，接着以4000rpm离心5min，分别取上清液0.5mL 于2mL离心管。

步骤二：加入1mL的乙酸乙酯，漩涡萃取2min，12000rpm的速率离心2min，吸取上 层乙酸乙酯相于含有1g无水Na₂SO₄的新离心管，漩涡混匀2min，12000rpm的速率离心2 min，吸取上层有机相0.5mL于进样瓶中。

步骤三：按照实施例1所述步骤二至四进行GC-MS测定。

对南京黄棕壤重复上述测定，砖红壤和黄棕壤溶液中HSLs浓度见表5，可以看到，两种 土壤溶液中各种HSLs的浓度均比较接近，其中，砖红壤溶液中7种HSLs的浓度在3.80～8.69 μg L^-1之间，黄棕壤溶液中7种HSLs的浓度在4.19～9.78μg L^-1之间。这些结果表明，本实施 例的检测方法可以有效用于复杂环境介质——土壤溶液中HSLs的定量检测与比较。

表5 砖红壤和黄棕壤溶液中酰基高丝氨酸内酯(HSLs)的浓度

实施例1～5所述的一种气相色谱-质谱检测土壤溶液中酰基高丝氨酸内酯的方法，在制备 检测样品过程中进行了多级离心、萃取操作，对离心震荡速率、时间等进行了优化调控，为 后续GC-MS测定奠定了很好的基础，且在采用GC-MS对HSLs进行定性定量分析时，对色 谱和质谱条件进行了优化，操作简便，快速准确，检测精度、灵敏度高，适用于土壤溶液中 多种HSLs信号分子化合物的同时定性与定量分析，通过加标回收率实验可得乙酸乙酯对土 壤溶液中C₆-HSL、C₇-HSL、C₈-HSL、C₁₀-HSL、C₁₂-HSL、C₁₄-HSL的萃取具有较高的回收 率，为进一步深入研究HSLs信号分子在土壤中的环境行为奠定了基础。