一种基于荧光相关谱的供体受体距离分布测量方法

摘要

本发明公开了一种基于荧光相关谱的供体受体距离分布测量方法，通过激光共聚焦显微镜平台的荧光相关谱模块在不同激光功率下对供体和受体荧光标记的活细胞进行选择性供体激发，相关卡对供体通道和受体通道的光子数涨落信号采集形成自相关曲线，通过对受体自相关曲线的三线态分析可以计算能量转移速率和转移效率，利用最大熵算法还可从受体三线态自相关曲线中反演其三线态分布进而计算供受体距离分布，荧光相关谱分析本身就是稀溶液浓度测量的优秀技术，因此对光谱重叠项积分项作供体受体浓度比例修正后，本发明可以应用于供体受体非配对的荧光共振能量转移效率以及距离分布的测量，该方法测量方便，测量精度高。

说明书

技术领域

本发明涉及荧光共振能量转移距离分布的测量方法，具体是指一种基于荧 光相关谱的供体受体距离分布测量方法。

背景技术

荧光共振能量转移是一种受激发的供体荧光分子通过偶极子-偶极子长程库 伦相互作用将激发态能量转移给邻近基态受体分子的光物理过程。荧光共振能量 转移的发生需要供体分子和受体分子之间的距离在1-10nm之间。这个空间尺度 正好是活体细胞中各类分子相互作用的线度，因此荧光共振能量转移技术特别 适用于细胞内分子互作用以及分子构象变化的研究。

荧光共振能量转移发生时，供体荧光会下降而受体荧光会上升。利用这一点 荧光共振能量转移的测量一般分为稳态荧光测量法和荧光寿命测量法两种。稳态 荧光测量法包括光谱拟合法和受体漂白法。在供体通道分别测量的对供受体同时 存在的样品和供体单独存在的样品分别测量其荧光强度F_DA和F_D，就可以确定荧 光共振能量转移效率E＝1-F_DA/F_D，或利用供体标准归一化光谱SP_D和受体 标准归一化光谱SP_A可以从供体受体标准归一化光谱 SP_DA(λ)＝(1-E)*SP_D(λ)+E*Φ_A*b*SP_A(λ)/Φ_D中拟合得出转移效率,其 中Φ_D和Φ_A分别为供体和受体的荧光量子产率；b为比例系数在荧光寿命测量法中，转移效率可用受体存在时τ_DA或不存在时τ_D的供体荧光寿 命来表示：E＝1-τ_DA/τ_D。

测量荧光共振能量转移效率的目的在于准确计算供受体距离r。这首先要介 绍能量转移临界距离R₀的概念，距离被定义为当荧光共振能量转 移效率为50％时的供受体距离。当荧光共振能量转移效率E能够从实验中准确测 量，距离R₀可由供体和受体的光谱重叠来计算，那么根据福斯特公式就 可以计算供受体距离

但是，无论是光谱测量法还是受体漂白法都只能测量单一的能量转移效率 和配对供体-受体的固定距离。荧光寿命法采用多指数衰减模型可以实现配对供 体-受体不固定距离分布的测量。但在供受体浓度比例非1:1的情况下，受体通道 的荧光信号包括来自荧光共振能量转移的贡献和受体分子浓度的影响，由于光 谱法或荧光寿命法都无法对测量体系的供体受体浓度进行测量，所以无法准确 计算受体浓度在受体荧光信号通道中的影响。虽然有些修正方案在试图解决供受 体非配对的荧光共振能量转移测量问题，但大都是基于经验或拟合参数进行修 正，得不到好的技术效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于荧光相关谱的供体受体距离分布测量方法， 该方法测量方便，测量精度高。

本发明通过以下的技术方案来实现：一种基于荧光相关谱的供体受体距离 分布测量方法，该方法包括如下步骤：

(1)在单个细胞中分别表达供体荧光蛋白和受体荧光蛋白以及在单个细胞中 共同表达供体荧光蛋白和受体荧光蛋白，供体荧光蛋白下述简称为供体，受体 荧光蛋白下述简称为受体；

(2)利用激光共聚焦扫描显微镜系统的荧光相关谱模块对所述单个细胞进行 荧光相关谱测量，获得单独供体的自相关曲线G^Dd(τ)、单独受体的自相关曲线 G^Aa(τ)、供体受体同时存在的供体自相关曲线G^Db(τ)以及供体受体同时存在的受 体自相关曲线G^Ab(τ)；

(3)利用自相关函数对步骤(2)中获得单独供体的自相关曲线G^Dd(τ)进行拟合， 计算供体在不同供体波长激光功率下平衡时三线态平均比例和三线态弛豫时 间并分别对此供体波长激光功率的对数作图，同样地对单独受体的自相关 曲线G^Aa进行拟合，获得受体在不同受体波长激光功率下平衡时三线态平均 比例和三线态弛豫时间并分别对此受体波长激光功率的对数作图；

(4)针对步骤(3)中单独供体在不同激光功率下平衡时三线态平均比例和 三线态弛豫时间两条曲线数据，进行联合的列文伯格-马夸尔特非线性最小二 乘法拟合，拟合时参考已知的供体荧光寿命可确定供体荧光衰减速率

求得供体的系间窜越供体的三线态衰减速率常数以及供体的激发截 面

(5)重复第(4)步骤，由已知的受体荧光寿命确定由步骤(3)获得的单独 受体的两条曲线数据受体平衡时三线态平均比重和受体三线态弛豫时间对 同样的两条公式进行联合拟合，求得受体的系间窜越受体的三线态衰减速 率常数

(6)重复第(3)、(4)步骤，利用步骤(2)方案三获得的供体受体同时存在的受体 自相关曲线G^Ab数据，获得受体在不同供体激光功率下的平衡时三线态平均 比例和三线态弛豫时间考虑了荧光共振能量转移速率速率常数k_FRET之 后，对步骤(4)中出现的两条公式中针对受体的k_exc参数进行修正；

(7)利用修正之后的公式求取荧光共振能量转移速率常数k_ET和能量转移效率 E；

(8)任意选取上述步骤(2)不同激光功率的某一激光功率下的受体自相关曲线， 用最大熵算法反演获得受体的三线态权值分布函数

(9)利用步骤(4)、步骤(5)中获得的供体和受体各自的系间窜越、三线态衰减速 率常数以及激发截面在确定供体激发的激光功率下模拟计算不同能量转移 速率常数k_ET所对应的受体三线态的弛豫特征时间值并用数值作图法表现能 量转移速率常数k_ET对受体三线态的弛豫特征时间值的函数关系及其反函数的 导函数关系

(10)由步骤(7)获得的能量转移速率常数k_ET对受体三线态的弛豫特征时间值 的函数关系以及导函数关系通过概率分布函数的自由变量之间的 转换，将步骤(8)获得的三线态权值分布函数变换到能量转移速率分布 函数最后变换到供受体距离分布f_r(r)，此时得到的是供体受体浓度 在1:1情况下的距离分布情况。

本发明中的单个细胞是指单个活体离体细胞。

本发明中，所述步骤(2)中对所述单个细胞进行荧光相关谱测量具体采用如 下测量方法：测量时需要进行如下三组测量方案同时进行：方案一、在单独表达 供体的单个细胞采用供体激发波长在不同功率下的激光激发供体，在供体通道 进行荧光光子数计数而获得单独供体的自相关曲线G^Dd(τ)；方案二、在单独表达 受体的单个细胞采用跟激发供体同样系列的激光功率激发受体，在受体通道进 行荧光光子数计数而获得单独受体的自相关曲线G^Aa(τ)；方案三、在共同表达供 体和受体的单个细胞采用跟同样系列的激光功率激发供体，在供体通道获得供 体受体同时存在的供体自相关曲线G^Db(τ)以及在受体通道获得供体受体同时存 在的受体自相关曲线G^Ab(τ)，这里τ是指相关时间，上标的大写字母D表示供体 通道的供体荧光信号，上标的大写字母A表示受体通道的受体荧光信号，上标 的小写字母d表示供体单独存在的样品，上标的小写字母a表示受体单独存在 的样品，上标的小写字母b表示供体和受体同时存在的样品。

本发明中，所述步骤(4)中采用如下两个公式进行联合的列文伯格-马夸尔特 非线性最小二乘法拟合：

${\bar{T}}_{\mathrm{eq}}=\frac{k_{\mathrm{ISC}}{k}_{\mathrm{exc}}}{k_{\mathrm{exc}}(k_{\mathrm{ISC}}+k_{\mathrm{tri}})+k_{\mathrm{tri}}{k}_{\mathrm{rad}}}$

${\tau }_{\mathrm{tri}}={(k_{\mathrm{tri}}+\frac{k_{\mathrm{exc}}{k}_{\mathrm{ISC}}}{k_{\mathrm{exc}}+k_{\mathrm{rad}}})}^{-1}.$

本发明中，所述步骤(6)中，对步骤(4)中出现的两条公式中针对受体的k_exc参数做如下修正：

$k_{\mathrm{exc}}^{A,\mathrm{tot}}\equiv k_{\mathrm{exc}}^A+k_{\mathrm{FRET}}{S}_1^D$

$S_1^D=\frac{k_{\mathrm{exc}}^D{k}_T^D}{k_{\mathrm{exc}}^D(k_{\mathrm{ISC}}^D+k_T^D)+k_{\mathrm{dec}}^{D,\mathrm{tot}}{k}_T^D}$

式中上标D表示供体、A表示受体，表示供体的第一激发态分布随。

本发明中，所述步骤(10)中，能量转移速率分布函数的计算公式如 下：

$f_{k_{\mathrm{ET}}}\left(k_{\mathrm{ET}}\right)=f_{{\tau }_{\mathrm{tri}}}\left({\tau }_{\mathrm{tri}}\right)\left|\frac{{\mathrm{d\tau }}_{\mathrm{tri}}}{{\mathrm{dk}}_{\mathrm{ET}}}\right|;$

由能量转移速率分布函数变换到供受体距离分布f_r(r)如下：

能量转移速率常数k_ET到供体受体距离之间有确定函数关系，由福斯特公式 给出：

$k_{\mathrm{ET}}\left(r\right)=\frac{Q_D{\kappa }^2}{{\tau }_D{r}^6}\frac{9000\ln 10}{128{\pi }^2{N}_A{n}^4}\underset{0}{\overset{\infty }{\int }}{F}_D\left(\lambda \right){ϵ}_A\left(\lambda \right){\lambda }^4\mathrm{d\lambda }$

其中，Q_D为没有受体存在时的供体量子产率；κ²为空间取向因子；n是 溶液的折射率；N_A为阿伏加德罗常数；r为供体受体间距离；τ_D为没有受体存 在时的供体荧光寿命；

光谱重叠积分项定义为：

$J_{\mathrm{overlap}}={\int }_0^{\infty }{F}_D\left(\lambda \right){ϵ}_A\left(\lambda \right){\lambda }^4\mathrm{d\lambda }=\frac{{\int }_0^{\infty }{f}_D\left(\lambda \right){ϵ}_A\left(\lambda \right){\lambda }^4\mathrm{d\lambda }}{{\int }_0^{\infty }{f}_D\left(\lambda \right)\mathrm{d\lambda }}$

其中，f_D(λ)为供体光谱；F_D(λ)为供体光谱各点对整条供体光谱积分的 修正；ε_A(λ)为受体的消光系数，

由光谱重叠积分项可定义能量转移福斯特临界距离R₀，R₀的六次方计算公 式如下：

$R_0^6=\frac{9000\ln 10Q_D{\kappa }^2}{128{\pi }^5{N}_A{n}^4}{J}_{\mathrm{overlap}}$

能量转移速率常数k_ET对供体受体间距离r的函数关系表示为：

$k_{\mathrm{ET}}\left(r\right)=\frac{1}{{\tau }_D}{\left(\frac{R_0}{r}\right)}^6$

最后求取供受体距离分布f_r(r)，f_r(r)的计算公式如下：

$f_r\left(r\right)=f_{k_{\mathrm{ET}}}\left(k_{\mathrm{ET}}\right)\left|\frac{{\mathrm{dk}}_{\mathrm{ET}}}{\mathrm{dr}}\right|;$

此时得到的是供体受体浓度在1:1情况下的距离分布情况。

本发明还可以做如下改进：该方法还包括如下步骤：

(11)从供体和受体同时存在的供体自相关曲线G^Db(τ)和供体和受体同时存在 的受体自相关曲线G^Ab(τ)的扩散部分分别求出探测体积内的发光供体分子数N^D和受体分子数N^A，并利用步骤(7)计算获得的能量转移效率E以及激光共聚焦扫 描显微镜系统的探测体积V_eff，计算供体分子浓度：

$C^D=\frac{N^D}{V_{\mathrm{eff}}}·\frac{1}{1-E}$

和计算受体分子浓度：

$C^A=\frac{N^A}{V_{\mathrm{eff}}}$

然后计算浓度比例系数因子：

$R_{\mathrm{DA}}=\frac{C^D}{C^A}=(\frac{N^D}{V_{\mathrm{eff}}}·\frac{1}{1-E})/\left(\frac{N^A}{V_{\mathrm{eff}}}\right)=\frac{N^D}{N^A(1-E)}$，代入光谱重叠积分项来计算修正后的能量转移福斯特临界距离R′₀，光谱重叠 积分项的表达式如下：

$J_{\mathrm{overlap}}^{\prime }={\int }_0^{\infty }{F}_D^{\prime }\left(\lambda \right){ϵ}_A\left(\lambda \right){\lambda }^4\mathrm{d\lambda }=\frac{{\int }_0^{\infty }{f}_D\left(\lambda \right){ϵ}_A\left(\lambda \right){\lambda }^4\mathrm{d\lambda }}{R_{\mathrm{DA}}{\int }_0^{\infty }{f}_D\left(\lambda \right)\mathrm{d\lambda }}$

其中，F′_D(λ)为供体光谱各点对整条供体光谱积分C_D/C_A的修正，获得修正 后的能量转移福斯特临界距离R′₀，然后采用与上述步骤(10)、步骤(11)相同的步 骤来计算供体受体浓度非1:1情况下的距离分布f′_r(r)，f′_r(r)的计算公式与步骤 (11)中f_r(r)的计算公式相同，在此情况下计算得到的是供体受体浓度非1:1的 距离分布。

本发明为了克服现有供受体距离分布测量技术的不足，本发明将利用三线 态荧光相关谱对荧光共振能量转移效率的准确测量以及三线态弛豫时间分布的 最大熵反演来计算供受体距离分布。荧光相关普技术本身在微量浓度测量具有优 势，该方案同时能够准确测量系统中的供体受体浓度，因而可以应用在供受体 浓度比例非1:1的情况。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)测量准确，并且可以实现单分子测量，完美解决供体和受体浓度比非 1:1的问题。

(2)克服了荧光寿命法在高能量转移效率＞75％时，由于供体发射荧光光子 数下降导致测量失败。

(3)荧光相关谱本身就是极稀浓度的荧光探测技术，因此在能量转移效率较 低时，只要受体分子量子产率足够高，该测量方法依然有效。

附图说明

图1是本发明溶液中不同激光功率下荧光分子的荧光自相关曲线；

图2是本发明受体三线态相对比重和三线态特征时间对供体激光功 率对数的函数作图；

图3是本发明三线态权值分布的最大熵反演结果；横坐标表示受体三线态 特征时间纵坐标表示归一化的三线态的权值分布

图4a是本发明小图为转移速率常数k_ET在不同供体激发功率下对三线态特 征时间τ_tri的函数关系；

图4b是本发明小图为转移速率常数k_ET在不同的供体-受体对距离R₀下对供受体距离r的函数关系；

图5是本发明概率分布在不同自由变量之间的转换；

图6a是本发明模拟功率为0.2231(-1.5对数值)mW的激光激发供体时，三 线态特征时间变换到能量转移速率常数的函数关系；

图6c是本发明模拟功率为0.2231(-1.5对数值)mW的激光激发供体时，三 线态特征时间变换到能量转移速率常数函数关系的反函数导数函数关系；

图6b是本发明模拟距离R₀＝60埃时，能量转移速率常数变换到供受 体距离的函数关系；

图6d是本发明模拟距离R₀＝60埃时，能量转移速率常数变换到供受 体距离函数关系的反函数导数函数关系；

图7是本发明能量转移速率常数分布结果

图8是本发明供受体距离分布结果f_r(r)。

具体实施方式

本发明基于荧光相关谱的供体受体距离分布测量方法，利用最大熵算法对 受体荧光自相关谱的三线态分布进行反演计算，在利用三线态荧光相关谱分析 中得出的三线态弛豫时间对于能量转移速率常数k_ET的函数关系，将三线态 分布换算成为转移速率常数的分布然后由能量转移速率公式 及距离R₀将转移速率常数的分布再次换算成为供受体距离分布f_r(r)。

根据三线态荧光相关谱分析，溶液中荧光分子的自相关曲线的三线态相对 比重以及三线态特征时间τ_tri是激发激光功率的函数。如图1所示，随着激光 功率的增加，自相关曲线的三线态相对比重明显增加。分子扩散速度也在加快， 这是由于激光梯度场效应的结果。

供体分子的激发态衰减率不仅来自荧光辐射的贡献，还有来自荧光 共振能量转移k_ET的贡献

$k_{\mathrm{dec}}^D\equiv k_{\mathrm{rad}}^D+k_{\mathrm{ET}}(S_0^A\left(r\right)+{T_1}^A\left(r\right))\approx k_{\mathrm{rad}}^D+k_{\mathrm{ET}}$

受体的激发速率有来自光源直接激发δ_excI_exc(r)和来自荧光共振能量转移的 激发

$k_{\mathrm{exc}}^A\left(r\right)\equiv {\delta }_{\mathrm{exc}}^A{I}_{\mathrm{exc}}\left(r\right)+k_{\mathrm{ET}}{S}_1^D\left(r\right)$

$S_1^D\left(r\right)=\frac{k_{\mathrm{exc}}^D\left(r\right)k_{\mathrm{tri}}^D}{k_{\mathrm{exc}}^D\left(r\right)(k_{\mathrm{ISC}}^D+k_{\mathrm{tri}}^D)+k_{\mathrm{dec}}^D{k}_{\mathrm{tri}}^D}$

在选择性供体激发的情况下δ_excI_exc(r)＝0。

热平衡时，受体三线态比例和三线态弛豫时间可从下面的自相关公 式拟合得到。

$\left(\begin{array}{c}G\left(\tau \right)=\frac{1}{N(1-{\bar{T}}_{\mathrm{eq}})}[R\left(\frac{1}{1+\tau /{\tau }_{D1}}\right){\left(\frac{1}{1+\tau /k^2{\tau }_{D1}}\right)}^{1/2}+\\ (1-R)\left(\frac{1}{1+\tau /{\tau }_{D2}}\right){\left(\frac{1}{1+\tau /k^2{\tau }_{D2}}\right)}^{1/2}]\left({\bar{T}}_{\mathrm{eq}}\exp \right[-\frac{\tau }{{\tau }_{\mathrm{tri}}}]+1-{\bar{T}}_{\mathrm{eq}})+\mathrm{DC}\end{array}\right)$

受体的三线态分布和三线态弛豫时间为：

${T_{\mathrm{eq}}}^A\left(r\right)=\frac{{k_{\mathrm{exc}}}^A\left(r\right){k_{\mathrm{ISC}}}^A}{{k_{\mathrm{exc}}}^A\left(r\right)({k_{\mathrm{ISC}}}^A+{k_{\mathrm{tri}}}^A)+{k_{\mathrm{rad}}}^A{k_{\mathrm{tri}}}^A}$

${{\tau }_{\mathrm{tri}}}^A\left(r\right)={({k_{\mathrm{tri}}}^A+\frac{{k_{\mathrm{exc}}}^A\left(r\right){k_{\mathrm{ISC}}}^A}{{k_{\mathrm{exc}}}^A\left(r\right)+{k_{\mathrm{rad}}}^A})}^{-1}$

令其在整个激发体积内求积分即可得到平均值和τ_tri^A。

在不同激发功率下对供体、受体分别进行荧光相关谱测量和曲线联合的 Levenberg-Marquardt非线性最小二乘法拟合得到供体和受体各自的系间窜越k_ISC、 三线态衰减速率常数k_tri以及激发界面σ_exc等参数，并参考有荧光寿命法测量供 体荧光寿命τ_flt^D＝1/k_rad^D和受体荧光寿命τ_flt^A＝1/k_rad^A，可得到荧光共振能量 转移速率常数k_Tran。这时可利用下式来计算能量转移效率：

$E=\frac{k_{\mathrm{ET}}}{k_{\mathrm{rad}}^D+k_{\mathrm{ET}}}$

以荧光共振能量转移ECFP-Venus供体-受体对为例演示具体的能量转移速 率常数的计算步骤。

供体ECFP的荧光参数是：最佳激发波长458nm；荧光衰减速率常数 $k_{\mathrm{rad}}^D=1/{\tau }_{\mathrm{flt}}^D=256{\mathrm{\mu s}}^{-1};$量子产率Φ_D＝0.4。

供体Venus的荧光参数是：最佳激发波长514nm；荧光衰减速率常数 量子产率Φ_D＝0.57；最大吸收波长消光系数

先择458nm波长光源，设置激光功率对数值为(-2,-15,-1,-0.5,0,0.5,1,1.5,2) mW的梯度选择性激发供体ECFP，并在供体通道和受体通道分别作荧光自相关 谱测量。

用自相关函数对受体各激光功率下的荧光自相曲线拟合求得各激光功率下 受体三线态相对比重和三线态特征时间τ_tri^A。如图2所示，横坐标是激光功 率对数值，左边纵坐标是受体三线态相对比重右边纵坐标是受体三线态 特征时间τ_tri^A。图中圆圈数据表示受体三线态相对比重对激光功率对数值的函数 关系；三角数据表示受体三线态特征时间对激光功率对数值的函数关系。

采用联合的Levenberg-Marquardt非线性最小二乘拟合法对图2中两条数据 曲线进行参数拟合求得受体拟合参数(图2中实线表示拟合曲线)：受体系间窜越 受体三线态衰减速率常数供体激发界面 以及荧光共振能量转移速率常数k_ET＝126.8μs^-1。

计算荧光共振能量转移效率

综合考虑扩散运动和三线态闪烁过程的总自相关函数可分慢速部分的扩散 自相关函数G_motion(τ)和快速部分三线态动态项函数G_triplet(τ)的乘积。

$G_{\mathrm{triplet}}\left(\tau \right)=\frac{{\bar{T}}_{\mathrm{eq}}}{(1-{\bar{T}}_{\mathrm{eq}})}\exp [-\frac{\tau }{{\tau }_{\mathrm{tri}}}]+1$

荧光分子的三线态特征时间不是唯一的，异质三线态弛豫时间分子的离散 型自相关函数为：

$\left(\begin{array}{c}G\left(\tau \right)=G_{\mathrm{motion}}\left(\tau \right){\Sigma }_j{d}_j{G}_{\mathrm{triplet}}\left(\tau \right)\\ =G_{\mathrm{motion}}\left(\tau \right)\left({\Sigma }_j\frac{d_j{\bar{T}}_{\mathrm{eq},j}}{1-{\bar{T}}_{\mathrm{eq},j}}\exp \right[-\frac{\tau }{{\tau }_{\mathrm{tri},j}}]+{\Sigma }_j{d}_j)\end{array}\right)$

其中d_j为荧光分子各三线态的相对分布权重。

考虑三线态的连续分布并引进连续分布的权值函数离散型自相关 函数可以写成积分型自相关函数：

$\left(\begin{array}{c}G\left(\tau \right)=G_{\mathrm{motion}}\left(\tau \right)(\int \frac{{f_{\tau }}_{\mathrm{tri}}\left({\tau }_{\mathrm{tri}}\right)T_{\mathrm{eq}}\left({\tau }_{\mathrm{tri}}\right)}{1-{\bar{T}}_{\mathrm{eq}}\left({\tau }_{\mathrm{tri}}\right)}\exp [-\frac{\tau }{{\tau }_{\mathrm{tri}}}]{\mathrm{d\tau }}_{\mathrm{tri}}+{\int f}_{{\tau }_{\mathrm{tri}}}\left({\tau }_{\mathrm{tri}}\right){\mathrm{d\tau }}_{\mathrm{tri}})\\ =G_{\mathrm{motion}}\left(\tau \right)(\int \beta \left({\tau }_{\mathrm{tri}}\right)\exp [-\frac{\tau }{{\tau }_{\mathrm{tri}}}]{\mathrm{d\tau }}_{\mathrm{tri}}+1)\end{array}\right)$

上式使用了如下定义：

$\beta \left({\tau }_{\mathrm{tri}}\right)=\frac{{f_{\tau }}_{\mathrm{tri}}\left({\tau }_{\mathrm{tri}}\right){\bar{T}}_{\mathrm{eq}}\left({\tau }_{\mathrm{tri}}\right)}{1-{\bar{T}}_{\mathrm{eq}}\left({\tau }_{\mathrm{tri}}\right)}$

$\int {f_{\tau }}_{\mathrm{tri}}\left({\tau }_{\mathrm{tri}}\right)d{\tau }_{\mathrm{tri}}=1$

这里$\int {f_{\tau }}_{\mathrm{tri}}\left({\tau }_{\mathrm{tri}}\right)d{\tau }_{\mathrm{tri}}=1$为权值函数归一化条件。

三线态自相关函数实际上是一个第一类fredholm积分方程：

$G_{\mathrm{triplet}}\left(\tau \right)=\int \beta \left({\tau }_{\mathrm{tri}}\right)\exp [-\frac{\tau }{{\tau }_{\mathrm{tri}}}]{\mathrm{d\tau }}_{\mathrm{tri}}+1$

对上式可以利用Skilling发展的最大熵算法来反演计算分布函数β(τ_tri)。

和τ_tri存在一一对应关系：

${\bar{T}}_{\mathrm{eq}}\left({\tau }_{\mathrm{tri}}\right)=-k_{\mathrm{tri}}{\tau }_{\mathrm{tri}}+1$

三线态跃迁速率常数k_tri可以从联合的Levenberg-Marquardt非线性最小二乘 法拟合得到，至此可由β(τ_tri)分布计算权值分布函数

$\beta \left({\tau }_{\mathrm{tri}}\right)={f_{\tau }}_{\mathrm{tri}}\left({\tau }_{\mathrm{tri}}\right)(\frac{1}{k_{\mathrm{tri}}{\tau }_{\mathrm{tri}}}-1)$

实施例一

改变供体-受体对ECFP-Venus之间的距离以构建3个独立的荧光共振能量 转移体系，10％，35％，75％。各个体系的三线态权值分布表现为一个窄峰分布， 如图3的曲线所示。利用最大熵算法反演计算得到各自体系的三线态权值分布， 如图3的带点实线所示。最大熵反演结果表明，在单一距离荧光共振能量转移体 系中计算结果与实际分布符合得很好。

实施例二

将3个不同距离供体-受体对置于同一个体系中，利用同样的最大熵反演也 可以得到理想的结果，如图3中的实线表示3种供体-受体距离按等比例混合体 系的反演结果。

在计算转移速率常数k_ET时，隐含着三线态弛豫时间τ_tri^A到转移速率常数 k_ET之间一一对应的函数关系。尽管该函数不能显示表达，但可以作图方式来表 现该函数关系，如图4a、图4b所示。

转移速率常数k_ET到供受体距离r之间的函数由能量转移速率常数 公式给出：

$k_{\mathrm{ET}}\left(r\right)=\frac{Q_D{\kappa }^2}{{\tau }_D{r}^6}\frac{9000\ln 10}{128{\pi }^2{N}_A{n}^4}\underset{0}{\overset{\infty }{\int }}{F}_D\left(\lambda \right){ϵ}_A\left(\lambda \right){\lambda }^4\mathrm{d\lambda }$

其中积分项为光谱重叠项：

$J_{\mathrm{overlap}}={\int }_0^{\infty }{F}_D\left(\lambda \right){ϵ}_A\left(\lambda \right){\lambda }^4\mathrm{d\lambda }=\frac{{\int }_0^{\infty }{f}_D\left(\lambda \right){ϵ}_A\left(\lambda \right){\lambda }^4\mathrm{d\lambda }}{{\int }_0^{\infty }{f}_D\left(\lambda \right)\mathrm{d\lambda }}$

距离R₀的定义如下：

$R_0^6=\frac{9000\ln 10Q_D{\kappa }^2}{128{\pi }^5{N}_A{n}^4}{\int }_0^{\infty }{F}_D\left(\lambda \right){ϵ}_A\left(\lambda \right){\lambda }^4\mathrm{d\lambda }$

能量转移速率公式就可以简化为：

$k_{\mathrm{ET}}\left(r\right)=\frac{1}{{\tau }_D}{\left(\frac{R_0}{{\tau }_D}\right)}^6$

在统计概率中，如图5所示，同一概率事件在不同的自由变量中的分布满 足下方程关系：

P(x＜X≤x+dx)＝P(y＜Y≤y+dy)

f_X(x)dx＝f_Y(y)dy

$f_Y\left(y\right)\mathrm{dy}=f_X\left(x\right)\left|\frac{\mathrm{dx}}{\mathrm{dy}}\right|$

可将最大熵反演的结果变换到转移速率常数分布然后再变 换到供受体距离分布f_r(r)。

激光功率为0.2231(-1.5对数值)mW时，能量转移速率常数k_ET对于三线态 弛豫时间τ_tri^A的函数关系如图6a所示，该函数的导函数可用数值算法求得，如 图6c所示。

有了函数关系和导函数，就可利用概率分布在不同自由变量间的转换关系 将受体三线态权值分布变换为荧光共振能量转移速率常数的分布 如图7所示。供体-受体对ECFP-Venus的距离R₀可由其光谱重 叠积分计算获得，R₀＝60.65埃。在此距离R₀下，可确定供受体距离r 对于能量转移速率常数k_ET的函数关系，如图6b所示，进而计算其导函数如图 6d所示。最后可将荧光共振能量转移速率常数的分布变换为供受体距离 分布f_r(r)，如图8所示。前面距离R₀计算用到光谱重叠积分项，而光谱 重叠项是以供体发射谱来归一化的，仅适用于供体和受体的浓度比为1:1的情 况。引进浓度比例系数因子R_AD＝C_A/C_D，表示受体分子浓度比上供体分子浓度 在供体受体浓度非1:1情况下，光谱的重叠积分项不再是归一化到一条供体发 射谱上，而是归一化到1/R_AD条供体发射谱上来。

光谱重叠积分项修正为：

$J(\lambda ,R_{\mathrm{AD}})={\int }_0^{\infty }{F}_D\left(\lambda \right)R_{\mathrm{AD}}{ϵ}_A\left(\lambda \right){\lambda }^4\mathrm{d\lambda }$

距离修正为：

$R_0^{\prime 6}=\frac{9000\ln 10Q_D{\kappa }^2}{128{\pi }^5{N}_A{n}^4}{\int }_0^{\infty }{F}_D\left(\lambda \right)R_{\mathrm{AD}}{ϵ}_A\left(\lambda \right){\lambda }^4\mathrm{d\lambda }$

利用修正的距离R′₀可以得到修正的能量转移速率函数k_ET(r,R_AD)。此 修正的能量转移速率常数函数用于计算供受体浓度比非1：1情况下的距离分布。 浓度比例系数因子R_AD可由供体和受体扩散部分自相关曲给出。