一种在DNA水平精确判定德国牧羊犬嗅觉灵敏性的方法

摘要

本发明涉及一种在DNA水平精确判定德国牧羊犬嗅觉灵敏性的方法。采用的技术方案是：1)犬全基因组DNA的获取；2)CfOR0041基因和CfOR0149基因片段的PCR扩增与纯化；3)单向延伸引物进行CfOR0041-SNP-632-C/T、CfOR0041-SNP-770-A/T、CfOR0149-SNP-506-G/A位点的PCR扩增与纯化，SAP消化PCR扩增体系中多余的dNTPs；4)毛细管电泳；5)遗传分析系统进行基因型分析，判定受试德国牧羊犬嗅觉灵敏性。本发明通过德国牧羊犬嗅觉灵敏性相关嗅觉受体基因型的检测来实现在DNA水平精确地对德国牧羊犬嗅觉灵敏性的判定。

说明书

技术领域

本发明涉及一种在DNA水平精确判定德国牧羊犬嗅觉灵敏性的方法，特别涉及一种通过 单向延伸引物PCR扩增产物的毛细管电泳的检测、实现对德国牧羊犬嗅觉灵敏性相关嗅觉受 体基因型精确判定的有效方法。

背景技术

警犬技术工作在多项公安工作中发挥着积极、不可替代的特殊作用。选取嗅觉灵敏的犬 警用是警犬技术工作迫切需要解决的问题。动物的嗅觉评估方法很多，包括行为学、影像 学、电生理学、组织形态学等多种类型。行为学方法对动物的嗅觉评估操作简单、但客观性 保障要求较高：具备质量控制的实验设计、个体差异影响评估结果、样本量大、往往需对动 物进行预先训练等。同时，嗅觉功能的客观评估方法如影像学、电生理学、组织学等测量方 法，由于其初期投入较大，对硬件及技术条件要求较高，目前普遍开展难度较大。例如，组 织学检查方法的活体获取检材困难、在灵敏嗅觉犬的选取中可操作性差；电生理学方法中嗅 电图仅限于对嗅区粘膜细胞电位变化的检查、对于粘膜后传导通路没有评估价值；嗅觉脑电 图因产生机制不明确、特异性不高而应用更少；嗅觉诱发电位证明嗅觉传导通路是否畅通、 暂不适合嗅觉定性评估；嗅觉系统功能影像检查的功能磁共振检查需在动物麻醉的情况下实 施；脑功能光学成像确切的生理意义还不明确等。因此，需要一种简单易行、技术成熟、实 用价值强的方法对犬嗅觉功能进行全面、客观、效果肯定的判定方法出现。

发明内容

针对现有犬嗅觉功能评估方法客观性不足或实用价值不强的现状，本发明提供一种新 型的通过单向延伸引物PCR扩增产物的毛细管电泳方法、实现对德国牧羊犬嗅觉灵敏性相关 嗅觉受体基因型精确检测，从而判定德国牧羊犬嗅觉灵敏性的有效方法，以解决犬嗅觉灵敏 性评估方法方面的技术问题。

本发明采用的技术方案是：一种在DNA水平精确判定德国牧羊犬嗅觉灵敏性的方法，步 骤如下：

1)犬全基因组DNA的获取：

选用含EDTA抗凝剂的真空采血管采集犬前肢臂头静脉血2ml、使用试剂盒提取犬全血基 因组DNA，检测DNA浓度与纯度，挑选OD260/OD280值在1.8～2.0之间、DNA浓度≥ 0.5ug/ul的样本于-80℃保存、待用。

2)犬嗅觉受体基因的PCR扩增与纯化：

取犬全基因组DNA作为PCR扩增模板，分别以CfOR0041基因的特异性引物和CfOR0149 基因的特异性引物进行目的基因片段的PCR扩增、分别获得含有待检测SNP位点的 CfOR0041基因片段的PCR产物和CfOR0149基因片段的PCR产物；将获得的PCR产物进行纯 化；

所述的CfOR0041基因的特异性引物的序列是：F:5’-CTGGCCTGTGGAACTGATGT-3’；

                                        R:5’-CAGGAGCTCTGGGGATAGAG-3’；

所述的CfOR0149基因的特异性引物的序列是：F:5’-CTCTCTTGGGCAACAGCACT-3’；

                                        R:5’-CAGCACGGCCAGAATTTCAC-3’；

PCR扩增体系是：PCR总反应体系为25ul：Premix12.5ul；

                                    上下游引物各0.5ul(浓度10uM)；

                                    DNA模板1ul(500ng/ul)；

                                    其余用超纯水补足；

PCR反应条件为:94℃变性30s,57℃退火30s,72℃延伸45s,35 个循环,4℃保存。

3)单向延伸引物的PCR扩增与纯化：

以步骤2)纯化后的CfOR0041基因片段的PCR产物片段为模板，分别以单向延伸引物 CfOR0041-SNP-632-C/T-F和CfOR0041-SNP-770-A/T-F为引物，进行单向延伸PCR扩增；

引物CfOR0041-SNP-632-C/T-F：5’-GGTGTGGGGCTGGTGTGCATCACTG-3’；

引物CfOR0041-SNP-770-A/T-F：5’-AAAAAAAAAACCCACCTCACTGTGGTGGTCGTGCACT-3’；

以步骤2)纯化后的CfOR0149基因片段的PCR产物片段为模板，以单向延伸引物 CfOR0149-SNP-506-G/A-R为引物，进行单向延伸PCR扩增；

引物CfOR0149-SNP-506-G/A-R：5’-AAAAAATCACACGTGAAGTGATCGATGAGATTCCTA-3’；

将获得的单向延伸PCR扩增产物分别经虾碱酶(SAP)消化体系，消化多余的dNTPs；

单向延伸PCR扩增体系是：PCR总反应体系为5ul：Premix1ul；

                                           单向延伸引物0.5ul(浓度1uM)；

                                           DNA模板1ul；

                                           其余用超纯水补足。

PCR反应条件为：96℃变性10s,50℃退火10s,72℃延 伸30s,25个循环,4℃保存。

SAP消化反应体系是：SAP消化总反应体系为5ul：DNA模板4.25ul；

                                           Buffer0.5ul；

                                           SAP0.25ul。

SAP消化反应条件：37℃变性1h,80℃15min。

4)毛细管电泳：

将经虾碱酶消化后的单向延伸引物的PCR扩增产物0.5ul、DNA SIZE STD80 0.5ul、SLS39ul混合均匀后移入上样96孔板、添加一滴矿物质油封盖样品液面；对 应缓冲液96孔板添加3/4孔体积缓冲液，选取SNP-1模块、50℃的条件下电泳，进行 毛细管电泳检测。

5)遗传分析系统进行基因型分析，判定受试德国牧羊犬嗅觉灵敏性：

单向延伸引物CfOR0041-SNP-632-C/T-F的PCR单向扩增产物出现CfOR0041-SNP- 632-C/T位点基因型为CC(黑色单峰)、且单向延伸引物CfOR0041-SNP-770-A/T-F的 PCR单向扩增产物出现CfOR0041-SNP-770-A/T位点基因型为AA(红色单峰)、且单向延 伸引物CfOR0149-SNP-506-G/A-R的PCR单向扩增产物出现CfOR0149-SNP-506-G/A位点 基因为GG(黑色单峰)，则判定待测德国牧羊犬具备灵敏嗅觉。检测结果非前述三种基 因型的受试德国牧羊犬则判定嗅觉灵敏性差。

本发明中，CfOR0041-SNP-632-C/T位点基因型CC、CfOR0041-SNP-770-A/T位点基因型 AA、CfOR0149-SNP-506-G/A位点基因GG在毛细管电泳图上分别呈现黑色、红色、黑色单峰 产物。CfOR0149-SNP-506-G/A位点基因GG，由于单向延伸引物为下游反向引物，故毛细管 电泳图呈黑色单峰产物CC指示受试犬基因型为GG。通过电泳峰值图可以精确检测受试德国 牧羊犬基因型、判定受试德国牧羊犬的嗅觉灵敏性。

本发明的有益效果是：本发明采用单向延伸引物PCR扩增产物的毛细管电泳方法、实现 对德国牧羊犬嗅觉灵敏性相关嗅觉受体基因型精确检测，从而判定德国牧羊犬嗅觉灵敏性的 有效方法，相对于国际上一般使用的动物嗅觉评估方法，如行为学、影像学、电生理学、组 织形态学等多种类型的实验方法而言，能够更加精确地在DNA水平通过检测德国牧羊犬机体 内嗅觉灵敏性相关嗅觉受体基因型，依此来评估德国牧羊犬嗅觉灵敏性。由于犬嗅认能力受 遗传影响的原因，第三代遗传标记SNP决定的嗅觉受体基因型已成为决定犬嗅觉灵敏性的重 要指标。而本发明通过单向延伸引物PCR扩增产物的毛细管电泳方法，实现在DNA水平定性 判断德国牧羊犬嗅觉灵敏性的作用效果，并在分子机理和遗传学上探讨犬嗅觉灵敏机制。本 发明采用单向延伸引物PCR扩增产物的毛细管电泳方法实施德国牧羊犬嗅觉灵敏性相关嗅觉 受体基因型的检测，该法与限制性内切酶法加之琼脂糖凝胶电泳法相比可以节约50％以上 的时间，同时它也克服了限制性内切酶法加之琼脂糖凝胶电泳法样品用量大、检测位点依赖 于限制性内切酶识别的缺点。采用本发明的方法，准确率可达到100％。

附图说明

图1是实例1中灵敏嗅觉德国牧羊犬嗅觉受体基因型CfOR0041-SNP-632-C/T位点基 因型、CfOR0041-SNP-770-A/T位点基因型的毛细管电泳鉴定图。

图2是实例1中灵敏嗅觉德国牧羊犬嗅觉受体基因型CfOR0149-SNP-506-G/A位点基 因型的毛细管电泳鉴定图。

图3是实例2中非灵敏嗅觉德国牧羊犬嗅觉受体基因型CfOR0041-SNP-632-C/T位点 基因型、CfOR0041-SNP-770-A/T位点基因型的毛细管电泳鉴定图。

图4是实例2中非灵敏嗅觉德国牧羊犬嗅觉受体基因型CfOR0149-SNP-506-G/A位点基 因型的毛细管电泳鉴定图。

具体实施方式

德国牧羊犬嗅觉灵敏性相关嗅觉受体基因型：CfOR0041-SNP-632-C/T位点基因型为 CC、CfOR0041-SNP-770-A/T位点基因型为AA、CfOR0149-SNP-506-G/A位点基因型为GG。

实施例1  检测公安部警犬技术学校2008级学生受训犬

该2008级学生受训犬品种为德国牧羊犬，依据现有技术的行为学、影像学、电生理 学、组织形态学等类型的检测结果判定该受试犬的嗅觉灵敏。

采用本发明的方法步骤如下：

1)犬全基因组的DNA的获取：

选用含EDTA抗凝剂的真空采血管采集犬前肢臂头静脉血2ml、使用试剂盒(Universal  Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0,TaKaRa)提取100ul全血基因组DNA，提取的犬全 血基因组DNA经酶标仪(TECAN)检测DNA浓度与纯度，DNA样品的OD260/OD280＝1.83、DNA 浓度＝0.51ug/ul，于-80℃保存，待用。

2)PCR扩增犬嗅觉受体基因与产物纯化：

2.1)PCR扩增体系是：PCR总反应体系为25ul：Premix12.5ul；

                                        上下游引物各0.5ul(浓度10uM)；

                                        DNA模板1ul(500ng/ul)；

                                        其余用超纯水补足；

PCR反应条件为:94℃变性30s,57℃退火30s,72℃延伸45s,35 个循环,4℃保存。每对引物扩增2个PCR体系。

2.2)CfOR0041基因的特异性引物的序列是：F:5’-CTGGCCTGTGGAACTGATGT-3’；

                                      R:5’-CAGGAGCTCTGGGGATAGAG-3’；

    CfOR0149基因的特异性引物的序列是：F:5’-CTCTCTTGGGCAACAGCACT-3’；

                                      R:5’-CAGCACGGCCAGAATTTCAC-3’；

2.3)取步骤1)获得的犬DNA样品作为PCR扩增模板，分别以CfOR0041基因的特异性引物 和CfOR0149基因的特异性引物进行目的基因片段的PCR扩增、分别获得含有待检测SNP位 点的CfOR0041基因片段的PCR产物和CfOR0149基因片段的PCR产物。

分别取5ul获得的PCR产物，分别经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定：CfOR0041基因的PCR产 物大小389bp；CfOR0149基因的PCR产物大小440bp。

将40ul的PCR产物，分别利用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0 (TaKaRa)，通过1％琼脂糖凝胶电泳的方法进行纯化。

3)单向延伸引物的PCR扩增：

3.1)以步骤2)纯化后的嗅觉受体基因CfOR0041基因片段的PCR产物为模板、以单向 延伸引物CfOR0041-SNP-632-C/T-F：5’-GGTGTGGGGCTGGTGTGCATCACTG-3’为引物，进行单 向延伸PCR扩增。PCR扩增体系是：PCR总反应体系为5ul：Premix1ul，引物CfOR0041- SNP-632-C/T-F0.5ul(1uM),DNA模板1ul，其余用超纯水补足。PCR反应条件为:96℃ 变性10s,50℃退火10s,72℃延伸30s,25个循环,4℃保存。产物大小为26bp。扩 增产物经虾碱酶(SAP)消化体系、消化反应多余的dNTPs。SAP消化体系为5ul，包括： DNA模板4.25ul，Buffer0.5ul、SAP0.25ul。SAP酶消化反应条件：37℃变性1h,80℃ 15min。

3.2)以步骤2)纯化后的嗅觉受体基因CfOR0041基因片段的PCR产物为模板、以单向 延伸引物CfOR0041-SNP-770-A/T-F：5’-AAAAAAAAAACCCACCTCACTGTGGTGGTCGTGCACT-3’为 引物，进行单向延伸PCR扩增。PCR扩增体系是：PCR总反应体系为5ul：Premix1ul，引 物CfOR0041-SNP-770-A/T-F0.5ul(1μM),DNA模板1ul，其余用超纯水补足。PCR反应 条件为:96℃变性10s,50℃退火10s,72℃延伸30s,25个循环,4℃保存。产物大小 为38bp。扩增产物经虾碱酶(SAP)消化体系、消化多余的dNTPs。SAP消化体系为5ul， 包括：DNA模板4.25ul，Buffer0.5ul、SAP0.25ul。SAP酶消化反应条件：37℃变性1h, 80℃15min。

3.3)以步骤2)纯化后的嗅觉受体基因CfOR0149基因片段的PCR产物为模板、以单向 延伸引物CfOR0149-SNP-506-G/A-R：5’-AAAAAATCACACGTGAAGTGATCGATGAGATTCCTA-3’为 引物，进行单向延伸PCR扩增。PCR扩增体系是：PCR总反应体系为5ul：Premix1ul，引 物CfOR0149-SNP-506-G/A-R0.5ul(1uM),DNA模板1ul，其余用超纯水补足。PCR反应 条件为:96℃变性10s,50℃退火10s,72℃延伸30s,25个循环,4℃保存。产物大小 分别为38bp。扩增产物经虾碱酶(SAP)消化体系、消化反应多余的dNTPs。SAP消化体系 为5ul，包括：DNA模板4.25ul，Buffer0.5ul、SAP0.25ul。SAP酶消化反应条件：37℃ 变性1h,80℃15min。产物大小为37bp。

4)毛细管电泳：

用Beckman Coulter公司的Separation Gel-LPAI、CEQ SEPARATION BUFFER进行毛 细管电泳检测。将SAP酶消化后的单向延伸引物的PCR扩增产物0.5ul、DNA SIZE STD80 0.5ul、SLS39ul混合均匀后移入上样96孔板、添加一滴矿物质油封盖样品液面。对应缓 冲液96孔板添加3/4孔体积缓冲液。选取SNP-1模块、50℃的条件下电泳，进行毛细管电 泳检测。

5)遗传分析系统进行基因型分析，判定受试德国牧羊犬嗅觉灵敏性：

选用遗传分析系统Default SNP Analysis Parameters(Slope Threshold to30、 Relative Peak Height Threshold to20、SNP ver.2Dye Mobility  Calibration)程序进行图像扫描，分析检测样品CfOR0041-SNP-632-C/T、CfOR0041-SNP- 770-A/T、CfOR0149-SNP-506-G/A位点的基因型。

结果显示：在CfOR0041-SNP-632-C/T位点的基因型为CC(毛细管电泳图呈现黑色单峰 产物)、且CfOR0041-SNP-770-A/T位点的基因型为AA(毛细管电泳图呈现红色单峰产物)、 且CfOR0149-SNP-506-G/A位点的基因为GG(毛细管电泳图呈现黑色单峰产物)。结果如图 1、图2所示。

按照本发明的方法判定该2008级学生受训德国牧羊犬的嗅觉灵敏，与现有技术的判定 结果相同。

实施例2  检测公安部警犬技术学校2008级学生受训犬

该2008级学生受训犬品种为德国牧羊犬，依据现有技术的行为学、影像学、电生理 学、组织形态学等类型的检测结果判定该受试德国牧羊犬嗅觉灵敏性差。

采用本发明的方法步骤如下：方法同实施例1，不同点在于：

5)遗传分析系统进行基因型分析，判定受试德国牧羊犬嗅觉灵敏性：

结果显示：CfOR0041-SNP-632-C/T位点的基因型为CT(毛细管电泳图呈现黑色、兰色 双峰产物)、CfOR0041-SNP-770-A/T位点的基因型为AT(毛细管电泳图呈现红色、兰色双峰 产物)、CfOR0149-SNP-506-G/A位点的基因型为AA(毛细管电泳图呈现兰色单峰，鉴于单向 延伸引物为下游反向引物，故毛细管电泳图呈现兰色单峰产物TT指示受试犬基因型为 AA)。结果如图3、图4所示。

按照本发明的方法判定该2008级学生受训德国牧羊犬的嗅觉灵敏性差，与现有技术的 判定结果相同。

实施例3  检测公安部警犬技术学校2008-2009级学生受训犬

按实施例1和实施例2的方法，对公安部警犬技术学校2008-2009级学生受训德国牧 羊犬50头，进行了嗅觉灵敏性判定试验，结果显示，其中45头具有嗅觉灵敏性高，而5头 嗅觉灵敏性差。与采用现有技术的判定结果相同。

根据实施例1-3以及图1-图4可以看出，本发明采取毛细管电泳、单向引物延伸的 方法在DNA水平精确检测德国牧羊犬嗅觉灵敏性相关嗅觉受体基因型、进而判定受试犬嗅觉 灵敏性的方法可以确定目的嗅觉受体基因的基因型、精准判定犬嗅觉灵敏性，从而在DNA水 平上判断犬嗅觉灵敏性、为在分子机理和遗传学上探讨犬嗅觉灵敏机制提供可能。

实施例1-实施例3用已知的行为学检测方法评定德国牧羊犬嗅觉灵敏性以对本发明 方法进行验证。本发明方法适用于犬性状相关基因型的精确定性检测，对于某一性状已知的 相关基因型，可以按本发明的步骤，采用毛细管电泳、单向引物延伸的方法来定性判定其性 状表型。

实施例4  检测公安部警犬技术学校2010级学生受训犬

该2010级学生受训犬品种为德国牧羊犬.

1)犬全基因组的DNA的获取：

选用含EDTA抗凝剂的真空采血管采集犬前肢臂头静脉血2ml、使用试剂盒(Universal  Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0,TaKaRa)提取100ul全血基因组DNA，提取的犬 全血基因组DNA经酶标仪(TECAN)检测DNA浓度与纯度，DNA样品的OD260/OD280＝1.87、 DNA浓度＝0.53ug/ul，于-80℃保存，待用。

2)PCR扩增犬嗅觉受体基因与产物纯化：方法同实施例1。

3)单向延伸引物的PCR扩增：方法同实施例1。

4)毛细管电泳：方法同实施例1。

5)遗传分析系统进行基因型分析，判定受试犬嗅觉灵敏性：

选用遗传分析系统Default SNP Analysis Parameters(Slope Threshold to30、 Relative Peak Height Threshold to20、SNP ver.2Dye Mobility  Calibration)程序进行图像扫描，分析检测CfOR0041-SNP-632-C/T、CfOR0041-SNP-770- A/T、CfOR0149-SNP-506-G/A样品的基因型。

结果显示：在CfOR0041-SNP-632-C/T位点的基因型为CC(毛细管电泳图呈现黑色单峰 产物)、且CfOR0041-SNP-770-A/T位点的基因型为AA(毛细管电泳图呈现红色单峰产物)、 且CfOR0149-SNP-506-G/A位点的基因为GG(毛细管电泳图呈现黑色单峰产物)。

按照本发明的方法判定该2010级学生受训德国牧羊犬嗅觉灵敏。