一种新麦草属植物细胞染色体中期分裂相标本制备方法

摘要

本发明涉及一种新麦草属植物细胞染色体中期分裂相标本制备方法，包括以下步骤：⑴取材：在一天中任意时间取生长旺盛的盆栽新麦草的新生根并将其放入离心管中；⑵装有根尖的离心管置于高压容器装置内，通N

说明书

技术领域

本发明涉及细胞遗传学领域中植物染色体中期分裂相标本的制备方法，尤其涉及一种新麦草属植物细胞染色体中期分裂相标本制备方法。

背景技术

染色体制片是细胞遗传学研究的基本方法，是研究生物遗传变异、物种演化、分类、远缘杂交以及染色体结构、形态与功能之间关系所不可缺少的重要手段。

染色体标本制备即染色体制片，是以体细胞分裂中期染色体为研究对象，但分裂中期持续的时间很短，一般仅10~30min，使中期染色体细胞出现频率不高。为了克服上述矛盾，常用化学或物理方法对材料进行预处理，预处理是否适宜，关系染色体制片的成败。化学试剂包括秋水仙素、对二氯苯、8-羟基喹啉、α-溴萘等，物理法主要指低温法。上述化学药物可阻止或破坏纺锤体的形成，毒性大，对实验人员身体有害。而低温法，预处理时间长，一次预处理就要1~3天，而且效果不理想。20世纪中叶，俄国科学家发现笑气具有阻止微管的形成，可用于植物染色体标本的制备。与常用方法相比，高压笑气法有处理时间短、实验效果好的特点，笑气相对其它化学试剂毒性小，也更安全。

新麦草属（PsathyrostachysNevski）是禾本科小麦族的植物，多年生，具根茎或形成密丛。该属有很多具有重要利用价值的种。例如新麦草（P. juncea），抗寒、抗旱、耐践踏，是适应于温带干旱半干旱地区种植的一种优良的放牧性牧草，也可用于退化草地的补播和改良。再如，华山新麦草（P. huashanica），是农作物的野生亲缘种，有抗病、抗旱、早熟等优良特性，对小麦新品种的研究有重大意义，同时还是国家一类珍稀保护植物和急需保护的农作物野生亲缘种。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种高效、稳定的新麦草属植物细胞染色体中期分裂相标本制备方法。

为解决上述问题，本发明所述的一种新麦草属植物细胞染色体中期分裂相标本制备方法，包括以下步骤：

⑴取材：在一天中任意时间取生长旺盛的盆栽新麦草的新生根1.5~2cm，并将其放入一个敞口的1.5mL或2.0mL的内壁附着水分的离心管中；

⑵在20~27℃条件下，将所述步骤⑴中装有根尖的离心管置于高压容器装置内，通入0.4~0.9MPa N₂O进行预处理，3.5~4.5h后即得预处理后的新根；

⑶将所述预处理后的新根用滤纸吸干水分，采用卡诺氏液固定20~24h，得到固定后的新根；

⑷将所述固定后的新根用蒸馏水漂洗3次，吸干水分后在体积浓度为45%的冰乙酸中解离3~8min，得到解离后的新根；

⑸将所述解离后的新根中的水分吸干后置于载玻片上，用干净的刀片去掉根尖的最前端的根冠区0.5~1.5mm，取分生区0.5~1.5mm的长度，加一滴体积浓度为45%的冰乙酸，盖上盖玻片，盖玻片的一侧垫一薄刀片，用镊子的基部轻轻敲击盖玻片，使组织成为一薄层，取走所述薄刀片，然后在酒精灯的火焰上烘烤至微热，在所述盖玻片上加一吸水纸，用拇指挤压所述盖玻片使细胞充分分散，得到压片；

⑹将所述压片置于光学显微镜下观察，选择染色体分散、清晰的细胞进行照相，以便进行荧光原位杂交，最后用玻璃刀做好盖玻片位置的标记，将做好的片子放入-80℃的冰箱保存即可。

所述步骤⑵中预处理过程是指压强按恒定值的方式通入N₂O进行或压强按梯度递增的方式通入N₂O进行。

所述步骤⑶中的卡诺氏液是由无水乙醇与冰醋酸按3mL：1 mL的比例混合而成。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明采用高压笑气对实验材料进行预处理，处理效果稳定，制片成功率高，较其它常规方法，取样时间不受限制，处理时间由几十小时缩短为几小时。同时，本发明预处理过程所用试剂安全、低毒、对实验人员身体损害小。

2、本发明获得的染色体样片经镜检和显微检测，可以发现染色体形态好且分散好的细胞比较多（参见图1~2），可用于荧光原位杂交实验，为新麦草资源开发利用等后续研究奠定良好基础。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1为本发明美国地区的新麦草（P. juncea）染色体镜检结果和显微照相示意图。

图2为本发明哈萨克斯坦地区新麦草（P. juncea）的染色体镜检结果和显微照相示意图。

具体实施方式

实施例1    一种新麦草属植物细胞染色体中期分裂相标本制备方法，包括以下步骤：

⑴取材：上午9点取生长旺盛的盆栽美国地区的新麦草（P. juncea）的新生根1.5cm，并将其放入一个敞口的1.5mL的内壁附着水分的离心管中。

⑵在20℃条件下，将步骤⑴中装有根尖的离心管置于高压容器装置内，先通入0.4MPa N₂O处理1.5h，然后在同一温度下，再次通入N₂O，使其分压达到0.75MPa，继续处理2h50min，即得预处理后的新根。

⑶将预处理后的新根用滤纸吸干水分，采用卡诺氏液固定20h，得到固定后的新根。

其中：卡诺氏液是由无水乙醇与冰醋酸按3mL：1 mL的比例混合而成。

⑷将固定后的新根用蒸馏水漂洗3次，吸干水分后在体积浓度为45%的冰乙酸中解离3min，得到解离后的新根。

⑸将解离后的新根中的水分吸干后置于载玻片上，用干净的刀片去掉根尖的最前端的根冠区0.5mm，取分生区0.5mm的长度，加一滴体积浓度为45%的冰乙酸，盖上盖玻片，盖玻片的一侧垫一薄刀片，用镊子的基部轻轻敲击盖玻片，使组织成为一薄层，取走薄刀片，然后在酒精灯的火焰上烘烤至微热，在盖玻片上加一吸水纸，用拇指挤压盖玻片使细胞充分分散，得到压片。

⑹将压片置于光学显微镜下观察，选择染色体分散、清晰的细胞进行照相，以便进行荧光原位杂交，镜检结果和显微照片见图1。最后用玻璃刀做好盖玻片位置的标记，将做好的片子放入-80℃的冰箱保存即可。

实施例2    一种新麦草属植物细胞染色体中期分裂相标本制备方法，包括以下步骤：

⑴取材：下午3:00取生长旺盛的盆栽哈萨克斯坦地区新麦草（P. juncea）的新生根1.5cm，并将其放入一个敞口的2.0mL的内壁附着水分的离心管中。

⑵在25℃条件下，将步骤⑴中装有根尖的离心管置于高压容器装置内，先通入0.4MPa N₂O处理1.5h，然后在同一温度下，再次通入N₂O，使其分压达到0.8MPa，继续处理2.5 h，即得预处理后的新根。

⑶将预处理后的新根用滤纸吸干水分，采用卡诺氏液固定23h，得到固定后的新根。

其中：卡诺氏液同实施例1。

⑷将固定后的新根用蒸馏水漂洗3次，吸干水分后在体积浓度为45%的冰乙酸中解离5min，得到解离后的新根。

⑸将解离后的新根中的水分吸干后置于载玻片上，用干净的刀片去掉根尖的最前端的根冠区1.2mm，取分生区1mm的长度，加一滴体积浓度为45%的冰乙酸，盖上盖玻片，盖玻片的一侧垫一薄刀片，用镊子的基部轻轻敲击盖玻片，使组织成为一薄层，取走薄刀片，然后在酒精灯的火焰上烘烤至微热，在盖玻片上加一吸水纸，用拇指挤压盖玻片使细胞充分分散，得到压片。

⑹将压片置于光学显微镜下观察，选择染色体分散、清晰的细胞进行照相，以便进行荧光原位杂交，镜检结果和显微照片见图2。最后用玻璃刀做好盖玻片位置的标记，将做好的片子放入-80℃的冰箱保存即可。

实施例3    一种新麦草属植物细胞染色体中期分裂相标本制备方法，包括以下步骤：

⑴取材：下午3:00取生长旺盛的盆栽美国地区新麦草（P. juncea）的新生根2cm，并将其放入一个敞口的2.0mL的内壁附着水分的离心管中。

⑵在26℃条件下，将步骤⑴中装有根尖的离心管置于高压容器装置内，先通入0.4MPa N₂O处理1.5h，然后在同一温度下，再次通入N₂O，使其分压达到0.8MPa，继续处理2.5 h，即得预处理后的新根。

⑶将预处理后的新根用滤纸吸干水分，采用卡诺氏液固定23h，得到固定后的新根。

其中：卡诺氏液同实施例1。

⑷将固定后的新根用蒸馏水漂洗3次，吸干水分后在体积浓度为45%的冰乙酸中解离6min，得到解离后的新根。

⑸将解离后的新根中的水分吸干后置于载玻片上，用干净的刀片去掉根尖的最前端的根冠区1.5mm，取分生区1.5mm的长度，加一滴体积浓度为45%的冰乙酸，盖上盖玻片，盖玻片的一侧垫一薄刀片，用镊子的基部轻轻敲击盖玻片，使组织成为一薄层，取走薄刀片，然后在酒精灯的火焰上烘烤至微热，在盖玻片上加一吸水纸，用拇指挤压盖玻片使细胞充分分散，得到压片。

⑹将压片置于光学显微镜下观察，选择染色体分散、清晰的细胞进行照相，以便进行荧光原位杂交，最后用玻璃刀做好盖玻片位置的标记，将做好的片子放入-80℃的冰箱保存即可。

实施例4    一种新麦草属植物细胞染色体中期分裂相标本制备方法，包括以下步骤：

⑴取材：下午3:00取生长旺盛的盆栽哈萨克斯坦地区新麦草（P. juncea）的新生根2cm，并将其放入一个敞口的1.5mL的内壁附着水分的离心管中。

⑵在26℃条件下，将步骤⑴中装有根尖的离心管置于高压容器装置内，先通入0.4MPa N₂O处理1.5h，然后在同一温度下，再次通入N₂O，使其分压达到0.8MPa，继续处理2.5 h，即得预处理后的新根。

⑶将预处理后的新根用滤纸吸干水分，采用卡诺氏液固定22h，得到固定后的新根。

其中：卡诺氏液同实施例1。

⑷将固定后的新根用蒸馏水漂洗3次，吸干水分后在体积浓度为45%的冰乙酸中解离5min，得到解离后的新根。

⑸将解离后的新根中的水分吸干后置于载玻片上，用干净的刀片去掉根尖的最前端的根冠区1.3mm，取分生区1mm的长度，加一滴体积浓度为45%的冰乙酸，盖上盖玻片，盖玻片的一侧垫一薄刀片，用镊子的基部轻轻敲击盖玻片，使组织成为一薄层，取走薄刀片，然后在酒精灯的火焰上烘烤至微热，在盖玻片上加一吸水纸，用拇指挤压盖玻片使细胞充分分散，得到压片。

⑹将压片置于光学显微镜下观察，选择染色体分散、清晰的细胞进行照相，以便进行荧光原位杂交，最后用玻璃刀做好盖玻片位置的标记，将做好的片子放入-80℃的冰箱保存即可。

实施例5    一种新麦草属植物细胞染色体中期分裂相标本制备方法，包括以下步骤：

⑴取材：下午3:30取生长旺盛的盆栽美国地区新麦草（P. juncea）的新生根1.8cm，并将其放入一个敞口的2.0mL的内壁附着水分的离心管中。

⑵在26℃条件下，将步骤⑴中装有根尖的离心管置于高压容器装置内，通入0.85MPa N₂O进行预处理，3.5h后即得预处理后的新根。

⑶将预处理后的新根用滤纸吸干水分，采用卡诺氏液固定23h，得到固定后的新根。

其中：卡诺氏液同实施例1。

⑷将固定后的新根用蒸馏水漂洗3次，吸干水分后在体积浓度为45%的冰乙酸中解离5min，得到解离后的新根。

⑸将解离后的新根中的水分吸干后置于载玻片上，用干净的刀片去掉根尖的最前端的根冠区1mm，取分生区1mm的长度，加一滴体积浓度为45%的冰乙酸，盖上盖玻片，盖玻片的一侧垫一薄刀片，用镊子的基部轻轻敲击盖玻片，使组织成为一薄层，取走薄刀片，然后在酒精灯的火焰上烘烤至微热，在盖玻片上加一吸水纸，用拇指挤压盖玻片使细胞充分分散，得到压片。

⑹将压片置于光学显微镜下观察，选择染色体分散、清晰的细胞进行照相，以便进行荧光原位杂交，最后用玻璃刀做好盖玻片位置的标记，将做好的片子放入-80℃的冰箱保存即可。

实施例6    一种新麦草属植物细胞染色体中期分裂相标本制备方法，包括以下步骤：

⑴取材：在一天中任意时间取生长旺盛的盆栽新麦草的新生根1.5cm，并将其放入一个敞口的1.5mL的内壁附着水分的离心管中。

⑵在20℃条件下，将步骤⑴中装有根尖的离心管置于高压容器装置内，通入0.4MPa N₂O进行预处理，4h后即得预处理后的新根。

⑶将预处理后的新根用滤纸吸干水分，采用卡诺氏液固定20h，得到固定后的新根。

其中：卡诺氏液同实施例1。

⑷将固定后的新根用蒸馏水漂洗3次，吸干水分后在体积浓度为45%的冰乙酸中解离3min，得到解离后的新根。

⑸将解离后的新根中的水分吸干后置于载玻片上，用干净的刀片去掉根尖的最前端的根冠区0.5mm，取分生区0.5mm的长度，加一滴体积浓度为45%的冰乙酸，盖上盖玻片，盖玻片的一侧垫一薄刀片，用镊子的基部轻轻敲击盖玻片，使组织成为一薄层，取走薄刀片，然后在酒精灯的火焰上烘烤至微热，在盖玻片上加一吸水纸，用拇指挤压盖玻片使细胞充分分散，得到压片。

⑹将压片置于光学显微镜下观察，选择染色体分散、清晰的细胞进行照相，以便进行荧光原位杂交，最后用玻璃刀做好盖玻片位置的标记，将做好的片子放入-80℃的冰箱保存即可。

实施例7    一种新麦草属植物细胞染色体中期分裂相标本制备方法，包括以下步骤：

⑴取材：在一天中任意时间取生长旺盛的盆栽新麦草的新生根2cm，并将其放入一个敞口的2.0mL的内壁附着水分的离心管中。

⑵在27℃条件下，将步骤⑴中装有根尖的离心管置于高压容器装置内，通入0.9MPa N₂O进行预处理，4.5h后即得预处理后的新根。

⑶将预处理后的新根用滤纸吸干水分，采用卡诺氏液固定24h，得到固定后的新根。

其中：卡诺氏液同实施例1。

⑷将固定后的新根用蒸馏水漂洗3次，吸干水分后在体积浓度为45%的冰乙酸中解离8min，得到解离后的新根。

⑸将解离后的新根中的水分吸干后置于载玻片上，用干净的刀片去掉根尖的最前端的根冠区1.5mm，取分生区1.5mm的长度，加一滴体积浓度为45%的冰乙酸，盖上盖玻片，盖玻片的一侧垫一薄刀片，用镊子的基部轻轻敲击盖玻片，使组织成为一薄层，取走薄刀片，然后在酒精灯的火焰上烘烤至微热，在盖玻片上加一吸水纸，用拇指挤压盖玻片使细胞充分分散，得到压片。

⑹将压片置于光学显微镜下观察，选择染色体分散、清晰的细胞进行照相，以便进行荧光原位杂交，最后用玻璃刀做好盖玻片位置的标记，将做好的片子放入-80℃的冰箱保存即可。

上述实施例1~7中的用于预处理的高压容器装置是指中国科学院西北高原生物研究所研发的专利号为ZL201320543644.6的用于植物染色体制备预处理的自动计时控温控压装置。