一种结合串联重复序列(TTTACAC)

摘要

本发明涉及一种结合串联重复序列(TTTACAC)

说明书

技术领域

本发明涉及一种结合串联重复序列(TTTACAC)₅的Dof蛋白质,尤其涉及一种可以结合植物串联重复序列(TTTACAC)₅的Dof蛋白因子及其编码基因，属于生物技术领域。

背景技术

转录因子也称为反式作用因子，它通过影响或控制特定基因的表达而参与许多重要的生物过程，如：信号转导、形态发生、环境应激反应等等。众所周知，转录因子可以结合启动子区的顺势调控元件进而调节基因的转录速率，另外，转录因子也可以介导蛋白质-蛋白质相互作用（Nat Rev Genet 2004, 5:276-287）。目前，人们已鉴定了许多转录因子基因家族，这其中有许多是植物特异性的，如WRKY家族、R2R3-MYB家族、bZIP家族、MADS家族等等。Dof( DNA binding with one finger)蛋白也是一类植物特有的转录因子，它通常含有两个结构域：一个是N-末端的DNA结合结构域；另一个是C-末端的调控结构域。其中，N-末端的结合域含有4个位置保守的Cys，它可以形成C₂-C₂锌指结构。这些结构域参与了不同调控蛋白或信号的结合，因而呈现多种生物功能，如：植物抗性（Plant J 1996, 10:955-966）、种子储存蛋白合成（Proc Natl Acad Sci U S A 1997, 94:7685-7690）、植物生长素和赤霉素响应（Plant Cell 1999, 11:323-334; Biochim Biophys Acta 2001, 1520:54-62）、碳水化合物代谢（Plant Cell 1998, 10:75-89）、种子萌发（Plant Cell 2002, 14:1253-1263）、光控植物开花（Trends Plant Sci 2006, 11:550-558）、细胞循环调节（Plant J 2008, 56:779-792）等等。Dof蛋白还可以通过与其它转录因子结合参与生物活性，如：Dof转录因子（OBP1）与bZIP转录因子（OBF4、OBF5）作用可以促进后者与靶DNA的结合（Plant Cell 1995, 7:2241-2252）；小麦WPBF与TaQM作用可以促进参与种子发育的阿尔法麸朊蛋白的转录（Plant Mol Biol 2007, 63:73–84）。

许多试验表明Dof蛋白与AAAG基序特异性结合（Trends Plant Sci2002,7:555-560）。Dof蛋白通过结合启动子上的AAAG 基序激活转录, 而启动子中该序列的突变往往导致转录的消失（Plant Cell 1998,10:75-89; Plant J 2001,28:455-464）。番茄Dof基因通过结合KST1启动子区的TAAAG基序诱导基因在保卫细胞中的表达（Plant J 2001,28:455–464）。

然而，至今还没有Dof转录因子结合串联重复序列的报道。本发明鉴定了一可以结合串联重复序列(TTTACAC)₅的Dof蛋白质，而前期实验(ZL201210087731.5)表明该串联重复序列具有提高植物基因表达活性的特征，因而，该Dof蛋白质具有潜在的调控基因表达活性的功能。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种结合串联重复序列(TTTACAC)₅的Dof蛋白质及其编码基因。

本发明提供的Dof蛋白质是一种转录因子，来源于拟南芥（Arabidopsis thaliana, Columbia ecotype），具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

本发明提供的Dof蛋白质，其编码基因为如下（1）或（2）所示的核苷酸序列：

（1）       具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

（2）       与（1）限定的DNA序列至少具有不低于70%同源性且编码植物转录因子相关的核苷酸序列。

本发明提供的可以结合串联重复序列(TTTACAC)₅的Dof蛋白质是由酵母单杂交实验获得，并且其结合方式已被EMSA（电泳迁移率实验）实验证实。

本发明还提供一种含有Dof蛋白编码序列的重组载体pUC-Dof。

本发明还提供一种含有Dof蛋白编码序列的重组表达载体pET-Dof。

本发明还提供一种重组菌，由重组载体pUC-Dof转化所得。

本发明还提供一种重组菌，由重组载体pET-Dof转化所得。

本发明还提供一种含有三个拷贝的串联重复序列(TTTACAC)₅基因片段的重组载体pHIS2-TR；一种含有重组载体pHIS2-TR的重组大肠杆菌；一种含有重组质粒pHIS2-TR的重组酵母菌。

    本发明的有益效果：利用现有分子生物学技术，本发明首次得到一种可以结合(TTTACAC)₅的Dof转录因子，它们的结合已经酵母单杂交实验及EMSA实验验证。前期实验(ZL201210087731.5)表明该串联重复序列具有提高植物基因表达活性的特征，这对于阐明调控基因表达机制具有重要的理论价值，因此在生产实践中也具有重要意义。

附图说明

图1为pHIS2-TR菌液PCR鉴定图

图2为pHIS2-TR质粒酵母转化结果

图3为文库转化效率结果

图4为Dof蛋白与串联重复序列(TTTACAC)₅酵母单杂交结果

图5为EMSA验证Dof蛋白与该串联重复序列(TTTACAC)₅的结合。

具体实施方式

下面根据具体实施例对本发明进一步的详细描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1：串联重复序列(TTTACAC)₅片段（命名为TR）合成及其与pUC18克隆载体链接

合成三个拷贝的串联重复序列(TTTACAC)₅片段，并在其首尾同时加上EcoRI（识别序列为5’-GAATTC-3’）、SacI（识别序列为5’-GAGCTC-3’）、sfiIA（识别序列为5’-GGCCATTACGGCC-3’）和sfiIB（识别序列为5’-GGCCGCCTCGGCC-3’）酶切位点，合成序列信息如下5’-GAATTCGGCCATTACGGCCTTTACACTTTACACTTTACACTTTACACTTTACACTTTACACTTTACACTTTACACTTTACACTTTACACTTTACACTTTACACTTTACACTTTACACTTTACACGGCCGCCTCGGCCGAGCTC-3’，其中下划线处为添加的酶切位点，该基因片段由上海桑尼生物科技有限公司合成。该片段与pUC18-T载体（购自大连宝生物）链接后转化大肠杆菌Top10感受态细胞（购自上海捷瑞生物工程有限公司），命名为pUC-TR，进行扩增和质粒提取，获得足够量的目的片段。

实施例2：TR片段与酵母单杂交诱饵载体pHIS2链接

对实施例1中获得的pUC-TR质粒进行EcoRI/SacI双酶切，切开的片段链接到相同双酶切的pHIS2（购自上海海科生物技术有限公司）载体上，连接产物转化大肠杆菌感受态后长出的转化子（pHIS2-TR），随机挑取12个转化子接种于带卡那抗性的液体LB培养基，于37℃，250 rpm振荡培养16 h（过夜）后，分别取1μL菌液进行PCR扩增，将产物用2%琼脂糖凝胶进行电泳鉴定。实验表明：空载体可以扩增出约150bp的片段，而成功插入目的片段的载体可以扩出300bp左右的片段，由图1可见，条带1，2，5，7，12可能为成功插入目的片段的转化子。对其进行进一步测序鉴定后，经比对确定其序列正确。

实施例3：pHIS2-TR质粒转化酵母

从YPDA（完全培养基）平板上挑取Y187酵母菌落接种于3mL YPDA液体培养基，30℃，220 rpm，振荡培养18-20小时。转接YPDA液体培养基，培养体积为50 mL，使初始OD₆₀₀=0.2，30℃，220 rpm，振荡培养4-5小时，至OD₆₀₀=0.6。然后，室温下1000g离心5min收集菌体。用20 mL无菌水重悬菌体，混匀，室温下1000 g，离心5 min收集菌体，弃上清。用5mL 0.1 M LiAc（醋酸锂）重悬菌体，混匀，室温下1000 g，离心5 min收集菌体，弃上清。用1mL 0.1 M LiAc重悬菌体，混匀，分装至1.5mL离心管，每个100μL，备用。在每个1.5mL离心管中依次加入240μL 50% PEG3350、36μL 1M LiAc、25μL ssDNA(10mg/mL)、5μL pHIS2-TR质粒，用枪头吹打混匀或剧烈震荡1min左右，至完全混匀。30℃水浴孵育，30 min后再42℃水浴热激，25 min，然后再30℃水浴复苏，1小时。室温下700g离心5min，弃上清。用100μL无菌水悬浮菌液，温和混匀，涂布在SD-Trp-His+50mM 3AT缺陷平板上，30℃恒温培养3-4天，结果如图2，已获得pHIS2-TR质粒转化酵母。

实施例4：酵母单杂交筛库

用实施例3中含有正确pHIS2-TR诱饵载体的酵母菌Y187作为受体菌制备感受态，将拟南芥cDNA酵母单杂交文库（购自上海海科生物技术有限公司）质粒转入其中，涂SD-Trp-Leu-His+50mM 3AT平板。具体实验步骤如下：从SD-Trp-Leu-His+50mM 3AT平板挑取单克隆菌种接于液体SD-Trp-Leu-His+50mM 3AT培养基3 mL，在30℃，250 rpm振荡培养8 h。将3mL菌液全部转接至SD-Trp-Leu-His+50mM 3AT液体培养基50mL，30℃，250 rpm，振荡培养过夜，12-14h。然后再转接于600 mL YPDA液体培养基中，使初始OD₆₀₀=0.2，30℃，250 rpm，振荡培养4-5 h，至OD₆₀₀=0.6。室温下1000 g离心5 min，收集菌体。用30 mL无菌水重悬菌体，混匀，室温下1000 g离心5 min，收集菌体，弃上清。然后再用10 mL 0.1M LiAc重悬菌体，混匀，室温下1000 g离心5 min，收集菌体，弃上清。用5 mL 0.1M LiAc重悬菌体，混匀，室温下1000 g离心5 min，收集菌体，弃上清。向离心管中依次加入9.6mL 50%PEG3350、1.44mL 1MLiAc、800μL ssDNA(10mg/mL)、25μg拟南芥cDNA酵母单杂交文库质粒，用枪头吹打混匀，或剧烈振荡1 min左右，至完全混匀。先在30℃水浴孵育30 min后，转入42℃水浴热激25 min。室温下700g离心3min收集菌体，弃上清。加入5mL 2×YPD，轻轻吹打混匀，30℃，100rpm震荡培养1.5 h。取20 μL培养物梯度稀释后涂SD-Trp-Leu-His+50mM 3AT平板。30℃恒温培养3天后观察。图3列举了4中不同稀释度（分别是10倍稀释、100倍稀释、1000倍稀释和10000倍稀释）后，转化菌体涂布SD-Trp-Leu-His+50mM 3AT平板生长出的转化子，根据转库效率检测平板的转化子数量可以计算文库的转化效率，该文库的转化效率为:（320+230+1200+100）/(4*20)*5000/25μg=7*10³/μg DNA（图3）。

实施例5：酵母单杂交阳性克隆鉴定

    将检测的阳性克隆菌株接入SD-Trp-Leu液体培养基，振荡培养过夜后抽提酵母质粒。 然后，酵母质粒转化大肠杆菌Top10新鲜感受态进行扩增。将含有阳性克隆的Top10转化子转接含有Amp⁺的LB液体培养扩增后抽提质粒，对质粒进行DNA测序和BLAST比对。鉴定结果得出：Dof基因（SEQ ID NO.2）可以结合该串联重复序列TR（图4）。

实施例6：Dof蛋白表达与探针标记

    根据实施例5中所鉴定的Dof基因序列，在拟南芥cDNA中,利用特异性引物：上游引物 5’-GGATCCATGTCTAAATCTAGAGATACGGAGAT-3’（内含BamHI酶切位点）；下游引物5’-GAGCTCTTATTGTTGCATGCTCTCCCTGAAGT-3’（内含SacI酶切位点）克隆全长Dof基因，然后将该基因首先连接到pUC18-T（购自大连宝生物）载体上，获得重组载体，命名为pUC-Dof，然后通过BamHI和SacI双酶切质粒后，获得Dof基因片段，再连接到pET30a（购自Novagen公司）原核表达载体上，获得重组载体，命名为pET-Dof，在大肠杆菌中进行蛋白表达后，HPLC（高效液相色谱法）纯化蛋白，备用。利用罗氏EMSA试剂盒标记探针，溶解探针为10pmol/μL，95℃，10min，然后慢慢冷却到室温。用灭菌的TEN-buffer将溶解探针稀释到3-4pmol/μL，加3.85pmol的双链核苷酸，用ddH₂O定容到10μL。在冰上加入5×labeling buffer 4μL；CoCl₂-solution 4μL；DIG-ddUTP solution 1μL；Terminal transferase (400U) 1μL，混匀，37℃放置15min。然后加入2μL 0.2 M EDTA (pH 8.0)停止反应。

实施例7：凝胶迁移率实验（EMSA）验证Dof蛋白与串联重复序列的结合

    提前配制非变性PAGE胶，预跑5min。在冰上加入Binding buffer 4μL、poly[d(I-C)] 1μL、poly L-lysine 1μL、DIG标记的探针（见实施例6）2μL、ddH₂O 12μL、非标记的探针、Oct2A factor 1μL、Dof纯化蛋白（以上的探针、非标记的探针和蛋白可根据自己的需要而改变）。混匀，室温下放置15min后放到冰上，再加5μL Loading buffer，上样跑非变性PAGE胶。转膜、洗膜后放置于Detection buffer加底物CSPD中，室温下放置5min后再置于37℃10min。最后用X射线胶片曝光30min，用显影液漂洗5min，再用定影液漂洗5min，结果如图5，由图得知：该Dof蛋白可以结合串联重复序列(TTTACAC)₅。 

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  江苏大学

 

<120>  一种结合串联重复序列(TTTACAC)5的Dof蛋白质

 

<130>  一种结合串联重复序列(TTTACAC)5的Dof蛋白质

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  399

<212>  PRT

<213>  拟南芥（Arabidopsis thaliana, Columbia ecotype）

 

<400>  1

 

Met Ser Lys Ser Arg Asp Thr Glu Ile Lys Leu Phe Gly Arg Thr Ile

1               5                   10                  15     

 

 

Thr Ser Leu Leu Asp Val Asn Cys Tyr Asp Pro Ser Ser Leu Ser Pro

            20                  25                  30         

 

 

Val His Asp Val Ser Ser Asp Pro Ser Lys Glu Asp Ser Ser Ser Ser

        35                  40                  45             

 

 

Ser Ser Ser Cys Ser Pro Thr Ile Gly Pro Ile Arg Val Pro Val Lys

    50                  55                  60                  

 

 

Lys Ser Glu Gln Glu Ser Asn Lys Phe Lys Asp Pro Tyr Ile Leu Ser

65                  70                  75                  80 

 

 

Asp Leu Asn Glu Pro Pro Lys Ala Val Ser Glu Ile Ser Ser Pro Arg

                85                  90                  95     

 

 

Ser Ser Lys Asn Asn Cys Asp Gln Gln Ser Glu Ile Thr Thr Thr Thr

            100                 105                 110        

 

 

Thr Thr Ser Thr Thr Ser Gly Glu Lys Ser Thr Ala Leu Lys Lys Pro

        115                 120                 125            

 

 

Asp Lys Leu Ile Pro Cys Pro Arg Cys Glu Ser Ala Asn Thr Lys Phe

    130                 135                 140                

 

 

Cys Tyr Tyr Asn Asn Tyr Asn Val Asn Gln Pro Arg Tyr Phe Cys Arg

145                 150                 155                 160

 

 

Asn Cys Gln Arg Tyr Trp Thr Ala Gly Gly Ser Met Arg Asn Val Pro

                165                 170                 175    

 

 

Val Gly Ser Gly Arg Arg Lys Asn Lys Gly Trp Pro Ser Ser Asn His

            180                 185                 190        

 

 

Tyr Leu Gln Val Thr Ser Glu Asp Cys Asp Asn Asn Asn Ser Gly Thr

        195                 200                 205            

 

 

Ile Leu Ser Phe Gly Ser Ser Glu Ser Ser Val Thr Glu Thr Gly Lys

    210                 215                 220                

 

 

His Gln Ser Gly Asp Thr Ala Lys Ile Ser Ala Asp Ser Val Ser Gln

225                 230                 235                 240

 

 

Glu Asn Lys Ser Tyr Gln Gly Phe Leu Pro Pro Gln Val Met Leu Pro

                245                 250                 255    

 

 

Asn Asn Ser Ser Pro Trp Pro Tyr Gln Trp Ser Pro Thr Gly Pro Asn

            260                 265                 270        

 

 

Ala Ser Phe Tyr Pro Val Pro Phe Tyr Trp Gly Cys Thr Val Pro Ile

        275                 280                 285            

 

 

Tyr Pro Thr Ser Glu Thr Ser Ser Cys Leu Gly Lys Arg Ser Arg Asp

    290                 295                 300                 

 

 

Gln Thr Glu Gly Arg Ile Asn Asp Thr Asn Thr Thr Ile Thr Thr Thr

305                 310                 315                 320

 

 

Arg Ala Arg Leu Val Ser Glu Ser Leu Arg Met Asn Ile Glu Ala Ser

                325                 330                 335    

 

 

Lys Ser Ala Val Trp Ser Lys Leu Pro Thr Lys Pro Glu Lys Lys Thr

            340                 345                 350        

 

 

Gln Gly Phe Ser Leu Phe Asn Gly Phe Asp Thr Lys Gly Asn Ser Asn

        355                 360                 365            

 

 

Arg Ser Ser Leu Val Ser Glu Thr Ser His Ser Leu Gln Ala Asn Pro

    370                 375                 380                

 

 

Ala Ala Met Ser Arg Ala Met Asn Phe Arg Glu Ser Met Gln Gln

385                 390                 395                

 

 

<210>  2

<211>  1200

<212>  DNA

<213>  拟南芥（Arabidopsis thaliana, Columbia ecotype）

 

<400>  2

atgtctaaat ctagagatac ggagataaag ttgtttggga ggacaatcac atctctttta     60

 

gatgtgaatt gttatgatcc gtcgtcgttg tcccctgttc acgatgtttc ttctgatcca    120

 

agcaaggagg attcgtcttc ttcttcatct tcttgttctc caactattgg accaatcagg    180

 

gttccggtta aaaaaagtga gcaagagagt aacaaattca aagatccata tatattatcc    240

 

gatctaaacg aaccaccaaa agcagtatct gagatttcat caccaagaag ttccaagaac    300

 

aactgtgatc aacagagcga gatcacaaca acaactacca caagtactac atcaggagag    360

 

aaatcaacgg ctctcaagaa accggacaag cttattccat gtcctagatg tgaaagcgca    420

 

aacaccaaat tctgttatta caacaactac aacgtgaacc agccacgtta cttctgcagg    480

 

aactgtcaga ggtattggac agctggtgga tctatgagga acgttcctgt tggctcaggt    540

 

cgtcgcaaga acaaaggatg gccttcttca aaccattact tgcaagtcac ttctgaggat    600

 

tgtgataata ataactcggg gacgatcctt agtttcggtt cttcggagtc ttcggttaca    660

 

gagactggta agcatcagtc aggtgataca gcaaagataa gtgctgattc agtttctcaa    720

 

gaaaataaaa gctaccaagg gtttcttcct ccgcaagtaa tgttacctaa taattcttct    780

 

ccttggcctt accaatggag tccaacgggt cctaacgcta gtttctaccc tgtccccttc    840

 

tactggggat gcacggttcc gatataccct acctcagaga cttcatcatg tttaggaaaa    900

 

cggtcaagag atcaaactga aggaagaatc aatgatacta atacaacaat aactactaca    960

 

agagcaagat tggtctcaga atctcttaga atgaatatcg aagctagtaa gagcgctgtg   1020

 

tggtctaagt taccgacaaa acccgagaaa aaaacgcaag gattcagttt gttcaatgga   1080

 

tttgacacaa agggaaacag caacagaagt agcttggtct ccgaaacttc tcacagtcta   1140

 

caagcaaacc ctgcagcgat gtctagagct atgaacttca gggagagcat gcaacaataa   1200