亚历山大病相关基因突变、其检测方法及其用途

摘要

本发明涉及遗传神经疾病领域，具体而言涉及亚历山大病领域。更具体而言，本发明公开了亚历山大病相关基因突变、其检测方法及其用途。本发明提供了亚历山大病的生物标记物，即突变的GFAP基因或蛋白：c.1289G>A、p.R430H；检测突变的GFAP基因或蛋白的方法；所述方法中使用的引物对和探针；以及包含所述引物对和探针的试剂盒。

说明书

技术领域

本发明涉及遗传神经疾病领域，具体而言涉及亚历山大病。

背景技术

亚历山大病是一种罕见的致命性的遗传神经性退化疾病。1949年 由亚历山大首先提出此病，是一种由于星型胶质细胞功能异常导致的 脑白质营养不良性疾病。典型病例表现为以额叶为主的白质异常和巨 脑，组织学检测显示脑内存在Rosenthal纤维，为中间丝等几种类型细 胞细胞骨架的组成部分，包括中枢神经系统星形胶质细胞和室管膜细 胞。亚历山大病的诊断标准：以额叶为主的广泛脑白质异常；脑室周 缘T1加权像呈高信号而T2加权像呈低信号；基底节和丘脑异常；脑 干异常，特别累及了中脑和延髓；一个或多个结构（包括脑室周缘、 额叶白质、视交叉、穹隆、基底节、丘脑、齿状核和脑干）的对比强 化。以上5条标准符合4条即可确诊。

亚历山大病的遗传方式尚不十分清楚，多为散发病例，也有一些 家系报道，可能为常染色体显性遗传。根据发病年龄及临床表现的不 同，通常可分为婴儿型、青年型和成年型。婴儿型，目前为最常见类 型，多在2岁以内起病，表现为智力发育迟缓、肢无力、肌张力降低、 吸吮、饮水困难、构音不清、小脑性共济失调，70％的患者有癫痫发 作、巨脑。婴儿型亚历山大病的病情严重，常在10岁前死亡。青年型， 比婴儿型少见，在4-14岁起病，男女均可发病临床特征与婴儿型有很 多相似处，不同点为少见癫痫发作、巨脑表现。青年型亚历山大病的 病情发展相对缓慢。成年型，罕见，在20-70岁起病，男女均可发病， 首先表现为下丘脑、脑干和脊髓受损的症状。成年型亚历山大病的病 情进展缓慢，临床上不易与多发性硬化相鉴别。研究表明，虽然各种 类型亚历山大病的临床表型不同，但是截止到目前发现的各种类型亚 历山大病的大部分病例均为GFAP基因突变，但是也有部分确诊为亚 历山大病患者中并没有发现GFAP基因突变。另外，2%存在GFAP 基因突变的人表型正常。对于GFAP基因突变的病例，相同的GFAP 突变位点，男女患者临床症状不同，这提示性别可能会影响亚历山大 疾病的发展程度。对于GFAP基因突变的家系病例，相同的GFAP基 因突变位点，但是家系内患者临床症状不同，这提示可能存在修饰基 因或者其他因素导致患者的临床特性不一致。

因此，有必要深入研究亚历山大病的遗传机制。而且，本领域仍 然需要发现亚历山大病相关的基因突变，以及检测亚历山大病的方法。

发明内容

本发明涉及到的一个患病家系，两个患者，同母异父，父母正常。 两名患者临床表型不一致，而影像学MRI检测发现两名患者均具有成 年型亚历山大疾病的特征。

本发明人经过不懈的努力，发现了亚历山大病基因的新突变，并 由此提供了下述发明：

本发明涉及亚历山大病基因新的突变，具体为：GFAP基因 c.1289G>A（p.R430H）；HDAC6基因c.2566C>T（p.P856S），其中 GFAP蛋白突变p.R430H发生在GFAP-ε上。

在第一方面，本发明涉及亚历山大病的生物标记物，即突变的 GFAP和/或HDAC6基因或蛋白，所述生物标记物是具有选自如下的 突变基因或蛋白：

GFAP基因c.1289G>A（p.R430H）；和/或

HDAC6基因c.2566C>T（p.P856S）。

在一个实施方案中，本发明的突变GFAP基因分别为具有以下突 变的SEQ ID NO:1：c.1289G>A。

在一个实施方案中，本发明的突变HDAC6基因分别为具有以下突 变的SEQ ID NO:2：c.2566C>T。

在一个实施方案中，本发明的突变的GFAP-ε蛋白为具有以下突 变的SEQ ID NO:3：p.R430H。

在一个实施方案中，本发明的突变的HDAC6蛋白为具有以下突 变的SEQ ID NO:4：p.P856S。

在第二方面，本发明涉及一种检测亚历山大病的方法，所述方法 包括检测受试者的GFAP和/或HDAC6基因或蛋白中是否存在突变位 点，如果有突变位点，则所述受试者被鉴定为患有亚历山大病或易患 亚历山大病，或者其后代会患有亚历山大病或易患亚历山大病，所述 突变位点选自如下任一种或其组合：

GFAP基因c.1289G>A（p.R430H）；和/或

HDAC6基因c.2566C>T（p.P856S）。

在一个实施方案中，GFAP基因为SEQ ID NO:1的序列表示。

在一个实施方案中，GFAP-ε蛋白为SEQ ID NO:3的序列表示。

在一个实施方案中，HDAC6基因为SEQ ID NO:2的序列表示。

在一个实施方案中，HDAC6蛋白为SEQ ID NO:4的序列表示。

在一个实施方案中，本发明的检测亚历山大病的方法包括如下至 少一组引物扩增的步骤：

SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；

SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。

在一个实施方案中，本发明的检测亚历山大病的方法中检测突变 位点通过选自如下的技术进行：测序、电泳、核酸杂交、原位杂交、 PCR、逆转录酶链反应和变性高效液相色谱。

在本发明第二方面的方法中，优选检测杂合的突变GFAP基因。

在本发明第二方面的方法中，优选检测纯合的突变HDAC6基因。

在第三方面，本发明涉及一种检测突变GFAP和/或HDAC6基因 或蛋白的方法，所述方法包括检测受试者的GFAP和/或HDAC6基因 或蛋白中是否存在突变位点，所述突变位点选自如下任一种或其组合：

GFAP基因c.1289G>A（p.R430H）；和/或

HDAC6基因c.2566C>T（p.P856S）。

在一个实施方案中，GFAP基因为SEQ ID NO:1的序列表示。

在一个实施方案中，GFAP-ε蛋白为SEQ ID NO:3的序列表示。

在一个实施方案中，HDAC6基因为SEQ ID NO:2的序列表示。

在一个实施方案中，HDAC6蛋白为SEQ ID NO:4的序列表示。

在一个实施方案中，本发明的检测突变GFAP和/或HDAC6基因 或蛋白的方法包括如下至少一组引物扩增的步骤：

SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；

SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。

在一个实施方案中，本发明的检测突变GFAP和/或HDAC6基因 或蛋白的方法中检测突变位点通过选自如下的技术进行：测序、电泳、 核酸杂交、原位杂交、PCR、逆转录酶链反应和变性高效液相色谱。

在第四方面，本发明涉及通过PCR检测突变GFAP和/或HDAC6 基因或蛋白中使用的引物对，所述突变是选自如下任一种或其组合：

GFAP基因c.1289G>A（p.R430H）；和/或

HDAC6基因c.2566C>T（p.P856S）。

其中所述引物对分别基于选自如下的位置在基因组序列或cDNA 序列上前后设计，使得扩增该位置：GFAP基因cDNA序列第1289位 和/或HDAC6基因cDNA序列第2566位。

在第五方面，本发明涉及与突变GFAP和/或HDAC6基因互补的 核酸探针，所述突变是选自如下任一种或其组合：

GFAP基因c.1289G>A；和/或

HDAC6基因c.2566C>T。

所述探针与突变GFAP和/或HDAC6基因的互补区包括选自如下 的基因组序列或cDNA序列上的位置：GFAP基因cDNA序列第1289 位和/或HDAC6基因cDNA序列第2566位。

在第六方面，本发明涉及检测突变GFAP和/或HDAC6基因或蛋 白的试剂盒，包含一组或多组引物对，其中所述突变是选自如下任一 种或其组合：

GFAP基因c.1289G>A（p.R430H）；和/或

HDAC6基因c.2566C>T（p.P856S）。

其中所述引物对分别基于选自如下的位置在基因组序列或cDNA 序列上设计，使得其扩增产物涵盖该位置：GFAP基因cDNA序列第 1289位和/或HDAC6基因cDNA序列第2566位。

在一个实施方案中，所述检测突变GFAP和/或HDAC6基因或蛋 白的试剂盒包含选自如下的至少一组引物：

SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；

SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。

在第七方面，本发明涉及检测突变GFAP和/或HDAC6基因的试 剂盒，包含一个或多个核酸探针，所述突变是选自如下任一种或其组 合：

GFAP基因c.1289G>A；和/或

HDAC6基因c.2566C>T。

所述探针与突变GFAP和/或HDAC6基因上包含选自如下位置的 基因组序列或cDNA序列上的区域互补：GFAP基因cDNA序列第1289 位和/或HDAC6基因cDNA序列第2566位。

在第八方面，本发明涉及GFAP基因的突变外显子7A和/或 HDAC6基因突变外显子25。

在本发明中，引物对SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6用于扩增 GFAP基因的野生型或突变外显子7A；引物对SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8用于扩增HDAC6基因的野生型或突变外显子25。

本发明人发现，本发明的GFAP基因的杂合突变即致病；而本发 明的HDCA6基因杂合并不致病，如本文中患者的母亲，本发明的 HDCA6基因突变使患者的临床病症不同。

本发明发现了亚历山大病相关基因的2个新的突变位点，对该基 因位点的检测可能用于亚历山大病患者的辅助诊断，并且可能有利于 明确亚历山大病患者的分子诊断。因此，本发明的检测突变GFAP和/ 或HDAC6基因或蛋白的方法可以用于诊断亚历山大病的目的，例如产 前诊断、植入前遗传学诊断（PGD）、患者筛查。然而，本发明的方法 并不仅限于用于诊断疾病的目的。

另外，本发明的检测突变GFAP和/或HDAC6基因或蛋白的方法 也可以用于非诊断疾病的目的。所述的非检测疾病的目的包括但不限 于研究SNP分布和多态性，用于家族演化研究。本发明可以对亚历山 大病的发病机理提供重要线索，对亚历山大病的诊断治疗具有十分重 要的意义。这样的应用也是本领域技术人员可以理解的。

例如，根据本文的描述可以看出，有些个体携带本发明所述的突 变HDAC6基因但不患亚历山大病，例如仅一条染色体携带突变的杂合 基因型。对这部分人群的检测可以任何不涉及诊断疾病的目的，因为 这些个体并不患病。但对于他们进行检测的结果可以作为例如有用信 息使用，例如作为育前检查的重要指标，指导生育，或者用于突变携 带者筛查，或者作为SNP分布和多态性研究的工具或者追踪基因突变 或家族演化。

附图说明

图1患者家系图，示出患者（II-2、II-4）及其父母（I-1-3）、兄 弟姐妹（II-1、II-3和II-5-7）和子女（III-1-4）的关系图。圆表示女 性，方框表示男性。

图2患者脑部MRI图，其中患者Pt1（b、c、d、e、g），患者Pt2 （a、f）。

图3GFP转录本结构图。

图4患者Pt1、Pt2及患者母亲GFP突变位点的测序。

图5患者Pt1、Pt2及患者母亲HDAC6突变位点的测序图。Wt 是指野生型。

图6HDAC6功能验证。Ct指对照。

野生型HDAC6基因和GFAP基因的cDNA和所编码的蛋白序列 说明（下划线示出本发明相关的突变发生的位置）：

GFAPcDNA，示出野生型GFAP基因的cDNA的核苷酸序列，1296 nt（SEQ ID NO:1）：

ATGGAGAGGAGACGCATCACCTCCGCTGCTCGCCGCTCCTACGTCTCCTCAGGGGAGATGATGGTGGGGG GCCTGGCTCCTGGCCGCCGTCTGGGTCCTGGCACCCGCCTCTCCCTGGCTCGAATGCCCCCTCCACTCCC GACCCGGGTGGATTTCTCCCTGGCTGGGGCACTCAATGCTGGCTTCAAGGAGACCCGGGCCAGTGAGCGG GCAGAGATGATGGAGCTCAATGACCGCTTTGCCAGCTACATCGAGAAGGTTCGCTTCCTGGAACAGCAAA ACAAGGCGCTGGCTGCTGAGCTGAACCAGCTGCGGGCCAAGGAGCCCACCAAGCTGGCAGACGTCTACCA GGCTGAGCTGCGAGAGCTGCGGCTGCGGCTCGATCAACTCACCGCCAACAGCGCCCGGCTGGAGGTTGAG AGGGACAATCTGGCACAGGACCTGGCCACTGTGAGGCAGAAGCTCCAGGATGAAACCAACCTGAGGCTGG AAGCCGAGAACAACCTGGCTGCCTATAGACAGGAAGCAGATGAAGCCACCCTGGCCCGTCTGGATCTGGA GAGGAAGATTGAGTCGCTGGAGGAGGAGATCCGGTTCTTGAGGAAGATCCACGAGGAGGAGGTTCGGGAA CTCCAGGAGCAGCTGGCCCGACAGCAGGTCCATGTGGAGCTTGACGTGGCCAAGCCAGACCTCACCGCAG CCCTGAAAGAGATCCGCACGCAGTATGAGGCAATGGCGTCCAGCAACATGCATGAAGCCGAAGAGTGGTA CCGCTCCAAGTTTGCAGACCTGACAGACGCTGCTGCCCGCAACGCGGAGCTGCTCCGCCAGGCCAAGCAC GAAGCCAACGACTACCGGCGCCAGTTGCAGTCCTTGACCTGCGACCTGGAGTCTCTGCGCGGCACGAACG AGTCCCTGGAGAGGCAGATGCGCGAGCAGGAGGAGCGGCACGTGCGGGAGGCGGCCAGTTATCAGGAGGC GCTGGCGCGGCTGGAGGAAGAGGGGCAGAGCCTCAAGGACGAGATGGCCCGCCACTTGCAGGAGTACCAG GACCTGCTCAATGTCAAGCTGGCCCTGGACATCGAGATCGCCACCTACAGGAAGCTGCTAGAGGGCGAGG AGAACCGGATCACCATTCCCGTGCAGACCTTCTCCAACCTGCAGATTCGAGGGGGCAAAAGCACCAAAGA CGGGGAAAATCACAAGGTCACAAGATATCTCAAAAGCCTCACAATACGAGTTATACCAATACAGGCTCAC CAGATTGTAAATGGAACGCCGCCGGCTCGCGGTTAG

HDAC6cDNA，示出野生型HDAC6基因的cDNA的核苷酸序列， 3648nt（SEQ ID NO:2）：

ATGACCTCAACCGGCCAGGATTCCACCACAACCAGGCAGCGAAGAAGTAGGCAGAACCCCCAGTCGCCCC CTCAGGACTCCAGTGTCACTTCGAAGCGAAATATTAAAAAGGGAGCCGTTCCCCGCTCTATCCCCAATCT AGCGGAGGTAAAGAAGAAAGGCAAAATGAAGAAGCTCGGCCAAGCAATGGAAGAAGACCTAATCGTGGGA CTGCAAGGGATGGATCTGAACCTTGAGGCTGAAGCACTGGCTGGCACTGGCTTGGTGTTGGATGAGCAGT TAAATGAATTCCATTGCCTCTGGGATGACAGCTTCCCGGAAGGCCCTGAGCGGCTCCATGCCATCAAGGA GCAACTGATCCAGGAGGGCCTCCTAGATCGCTGCGTGTCCTTTCAGGCCCGGTTTGCTGAAAAGGAAGAG CTGATGTTGGTTCACAGCCTAGAATATATTGATCTGATGGAAACAACCCAGTACATGAATGAGGGAGAAC TCCGTGTCCTAGCAGACACCTACGACTCAGTTTATCTGCATCCGAACTCATACTCCTGTGCCTGCCTGGC CTCAGGCTCTGTCCTCAGGCTGGTGGATGCGGTCCTGGGGGCTGAGATCCGGAATGGCATGGCCATCATT AGGCCTCCTGGACATCACGCCCAGCACAGTCTTATGGATGGCTATTGCATGTTCAACCACGTGGCTGTGG CAGCCCGCTATGCTCAACAGAAACACCGCATCCGGAGGGTCCTTATCGTAGATTGGGATGTGCACCACGG TCAAGGAACACAGTTCACCTTCGACCAGGACCCCAGTGTCCTCTATTTCTCCATCCACCGCTACGAGCAG GGTAGGTTCTGGCCCCACCTGAAGGCCTCTAACTGGTCCACCACAGGTTTCGGCCAAGGCCAAGGATATA CCATCAATGTGCCTTGGAACCAGGTGGGGATGCGGGATGCTGACTACATTGCTGCTTTCCTGCACGTCCT GCTGCCAGTCGCCCTCGAGTTCCAGCCTCAGCTGGTCCTGGTGGCTGCTGGATTTGATGCCCTGCAAGGG GACCCCAAGGGTGAGATGGCCGCCACTCCGGCAGGGTTCGCCCAGCTAACCCACCTGCTCATGGGTCTGG CAGGAGGCAAGCTGATCCTGTCTCTGGAGGGTGGCTACAACCTCCGCGCCCTGGCTGAAGGCGTCAGTGC TTCGCTCCACACCCTTCTGGGAGACCCTTGCCCCATGCTGGAGTCACCTGGTGCCCCCTGCCGGAGTGCC CAGGCTTCAGTTTCCTGTGCTCTGGAAGCCCTTGAGCCCTTCTGGGAGGTTCTTGTGAGATCAACTGAGA CCGTGGAGAGGGACAACATGGAGGAGGACAATGTAGAGGAGAGCGAGGAGGAAGGACCCTGGGAGCCCCC TGTGCTCCCAATCCTGACATGGCCAGTGCTACAGTCTCGCACAGGGCTGGTCTATGACCAAAATATGATG AATCACTGCAACTTGTGGGACAGCCACCACCCTGAGGTACCCCAGCGCATCTTGCGGATCATGTGCCGTC TGGAGGAGCTGGGCCTTGCCGGGCGCTGCCTCACCCTGACACCGCGCCCTGCCACAGAGGCTGAGCTGCT CACCTGTCACAGTGCTGAGTACGTGGGTCATCTCCGGGCCACAGAGAAAATGAAAACCCGGGAGCTGCAC CGTGAGAGTTCCAACTTTGACTCCATCTATATCTGCCCCAGTACCTTCGCCTGTGCACAGCTTGCCACTG GCGCTGCCTGCCGCCTGGTGGAGGCTGTGCTCTCAGGAGAGGTTCTGAATGGTGCTGCTGTGGTGCGTCC CCCAGGACACCACGCAGAGCAGGATGCAGCTTGCGGTTTTTGCTTTTTCAACTCTGTGGCTGTGGCTGCT CGCCATGCCCAGACTATCAGTGGGCATGCCCTACGGATCCTGATTGTGGATTGGGATGTCCACCACGGTA ATGGAACTCAGCACATGTTTGAGGATGACCCCAGTGTGCTATATGTGTCCCTGCACCGCTATGATCATGG CACCTTCTTCCCCATGGGGGATGAGGGTGCCAGCAGCCAGATCGGCCGGGCTGCGGGCACAGGCTTCACC GTCAACGTGGCATGGAACGGGCCCCGCATGGGTGATGCTGACTACCTAGCTGCCTGGCATCGCCTGGTGC TTCCCATTGCCTACGAGTTTAACCCAGAACTGGTGCTGGTCTCAGCTGGCTTTGATGCTGCACGGGGGGA TCCGCTGGGGGGCTGCCAGGTGTCACCTGAGGGTTATGCCCACCTCACCCACCTGCTGATGGGCCTTGCC AGTGGCCGCATTATCCTTATCCTAGAGGGTGGCTATAACCTGACATCCATCTCAGAGTCCATGGCTGCCT GCACTCGCTCCCTCCTTGGAGACCCACCACCCCTGCTGACCCTGCCACGGCCCCCACTATCAGGGGCCCT GGCCTCAATCACTGAGACCATCCAAGTCCATCGCAGATACTGGCGCAGCTTACGGGTCATGAAGGTAGAA GACAGAGAAGGACCCTCCAGTTCTAAGTTGGTCACCAAGAAGGCACCCCAACCAGCCAAACCTAGGTTAG CTGAGCGGATGACCACACGAGAAAAGAAGGTTCTGGAAGCAGGCATGGGGAAAGTCACCTCGGCATCATT TGGGGAAGAGTCCACTCCAGGCCAGACTAACTCAGAGACAGCTGTGGTGGCCCTCACTCAGGACCAGCCC TCAGAGGCAGCCACAGGGGGAGCCACTCTGGCCCAGACCATTTCTGAGGCAGCCATTGGGGGAGCCATGC TGGGCCAGACCACCTCAGAGGAGGCTGTCGGGGGAGCCACTCCGGACCAGACCACCTCAGAGGAGACTGT GGGAGGAGCCATTCTGGACCAGACCACCTCAGAGGATGCTGTTGGGGGAGCCACGCTGGGCCAGACTACC TCAGAGGAGGCTGTAGGAGGAGCTACACTGGCCCAGACCACCTCGGAGGCAGCCATGGAGGGAGCCACAC TGGACCAGACTACGTCAGAGGAGGCTCCAGGGGGCACCGAGCTGATCCAAACTCCTCTAGCCTCGAGCAC AGACCACCAGACCCCCCCAACCTCACCTGTGCAGGGAACTACACCCCAGATATCTCCCAGTACACTGATT GGGAGTCTCAGGACCTTGGAGCTAGGCAGCGAATCTCAGGGGGCCTCAGAATCTCAGGCCCCAGGAGAGG AGAACCTACTAGGAGAGGCAGCTGGAGGTCAGGACATGGCTGATTCGATGCTGATGCAGGGATCTAGGGG CCTCACTGATCAGGCCATATTTTATGCTGTGACACCACTGCCCTGGTGTCCCCATTTGGTGGCAGTATGC CCCATACCTGCAGCAGGCCTAGACGTGACCCAACCTTGTGGGGACTGTGGAACAATCCAAGAGAATTGGG TGTGTCTCTCTTGCTATCAGGTCTACTGTGGTCGTTACATCAATGGCCACATGCTCCAACACCATGGAAA TTCTGGACACCCGCTGGTCCTCAGCTACATCGACCTGTCAGCCTGGTGTTACTACTGTCAGGCCTATGTC CACCACCAGGCTCTCCTAGATGTGAAGAACATCGCCCACCAGAACAAGTTTGGGGAGGATATGCCCCACC CACACTAA

GFP蛋白序列，示出GFAPcDNA序列编码的胶质纤维酸性蛋白 的氨基酸序列，431aa（SEQ ID NO:3）：

MERRRITSAARRSYVSSGEMMVGGLAPGRRLGPGTRLSLARMPPPLPTRVDFSLAGALNAGFKETRASER AEMMELNDRFASYIEKVRFLEQQNKALAAELNQLRAKEPTKLADVYQAELRELRLRLDQLTANSARLEVE RDNLAQDLATVRQKLQDETNLRLEAENNLAAYRQEADEATLARLDLERKIESLEEEIRFLRKIHEEEVRE LQEQLARQQVHVELDVAKPDLTAALKEIRTQYEAMASSNMHEAEEWYRSKFADLTDAAARNAELLRQAKH EANDYRRQLQSLTCDLESLRGTNESLERQMREQEERHVREAASYQEALARLEEEGQSLKDEMARHLQEYQ DLLNVKLALDIEIATYRKLLEGEENRITIPVQTFSNLQIRGGKSTKDGENHKVTRYLKSLTIRVIPIQAH QIVNGTPPARG

HDAC6蛋白序列，示出HDAC6cDNA序列编码的组蛋白去乙酰 化酶6的氨基酸序列，1215aa（SEQ ID NO:4）：

MTSTGQDSTTTRQRRSRQNPQSPPQDSSVTSKRNIKKGAVPRSIPNLAEVKKKGKMKKLGQAMEEDLIVG LQGMDLNLEAEALAGTGLVLDEQLNEFHCLWDDSFPEGPERLHAIKEQLIQEGLLDRCVSFQARFAEKEE LMLVHSLEYIDLMETTQYMNEGELRVLADTYDSVYLHPNSYSCACLASGSVLRLVDAVLGAEIRNGMAII RPPGHHAQHSLMDGYCMFNHVAVAARYAQQKHRIRRVLIVDWDVHHGQGTQFTFDQDPSVLYFSIHRYEQ GRFWPHLKASNWSTTGFGQGQGYTINVPWNQVGMRDADYIAAFLHVLLPVALEFQPQLVLVAAGFDALQG DPKGEMAATPAGFAQLTHLLMGLAGGKLILSLEGGYNLRALAEGVSASLHTLLGDPCPMLESPGAPCRSA QASVSCALEALEPFWEVLVRSTETVERDNMEEDNVEESEEEGPWEPPVLPILTWPVLQSRTGLVYDQNMM NHCNLWDSHHPEVPQRILRIMCRLEELGLAGRCLTLTPRPATEAELLTCHSAEYVGHLRATEKMKTRELH RESSNFDSIYICPSTFACAQLATGAACRLVEAVLSGEVLNGAAVVRPPGHHAEQDAACGFCFFNSVAVAA RHAQTISGHALRILIVDWDVHHGNGTQHMFEDDPSVLYVSLHRYDHGTFFPMGDEGASSQIGRAAGTGFT VNVAWNGPRMGDADYLAAWHRLVLPIAYEFNPELVLVSAGFDAARGDPLGGCQVSPEGYAHLTHLLMGLA SGRIILILEGGYNLTSISESMAACTRSLLGDPPPLLTLPRPPLSGALASITETIQVHRRYWRSLRVMKVE DREGPSSSKLVTKKAPQPAKPRLAERMTTREKKVLEAGMGKVTSASFGEESTPGQTNSETAVVALTQDQP SEAATGGATLAQTISEAAIGGAMLGQTTSEEAVGGATPDQTTSEETVGGAILDQTTSEDAVGGATLGQTT SEEAVGGATLAQTTSEAAMEGATLDQTTSEEAPGGTELIQTPLASSTDHQTPPTSPVQGTTPQISPSTLI GSLRTLELGSESQGASESQAPGEENLLGEAAGGQDMADSMLMQGSRGLTDQAIFYAVTPLPWCPHLVAVC PIPAAGLDVTQPCGDCGTIQENWVCLSCYQVYCGRYINGHMLQHHGNSGHPLVLSYIDLSAWCYYCQAYV HHQALLDVKNIAHQNKFGEDMPHPH

具体实施方式

发明人收集到一个意大利的异父同胞家系，父母（图1中I中的 1-3）表型正常，异父同胞的女性患者（II-2）和男性患者（II-4）均表 现为神经类疾病，但是两者临床症状不同。

患者Pt1（图1，II-2），女，68岁。55岁发病，起病隐袭、智力 减退伴随中度共济失调、构音障碍、吞咽困难、腭肌阵挛。61岁脑电 图EEG检查表现出非特异性刺激性异常、PEV改变、EMG正常、眼 球运动正常、简易精神状态检查MMSE得分为22/30。该综合征病程 发病缓慢、起病时出现尿失禁。

患者Pt2（图1，II-4），男，60岁。52岁因隐袭性渐进性行走困 难就诊、患者46岁时出现右下肢僵硬无力、3-5年后逐渐累及到右上 肢和左上下肢。56岁需辅助轮椅行走；发音、吞咽困难；伴随严重四 痉挛、双侧踝阵挛；双侧巴宾斯基征；双侧颞肌、骨间肌和胫骨前肌 发育不良。感官检验和植物神经系统检查均正常，例如眼球运动正常。 肌电图EMG显示神经源性异常、无自发颤动。神经传导研究表明， 下肢运动性轴索型神经病变、外周感觉神经传导正常。上述检测结果 显示患者具有严重的肢体和延髓区运动神经元疾病（MND）；病程呈 缓慢、渐进性发展；患者无认知功能减退。

颅脑MRI（来自患者Pt1和Pt2在医院检查的图像。图2，其中 患者Pt1（b、c、d、e、g），患者Pt2（a、f））示两个患者均表现出 轻微的恶化，包括蝌蚪状的延髓和颈脊髓萎缩，前后中央脑回和额底 区呈现萎缩段，齿状核，脑室周缘、皮质下白质异常信号，与文献中 亚历山大病患者MRI的症状极为相似。

由于患者Pt1和Pt2为同母异父，因此对mtDNA进行了测序，未 发现mtDNA基因突变，排除了线粒体遗传mtDNA基因突变导致的疾 病。发明人对GFAP的9个外显子进行了sanger测序未见突变，因此 发明人利用Agilent Sureselect50M Kit结合Solexa高通量测序技术对 病例PtI和Pt2进行了外显子组测序，具体方法参见实施列3。

结果，发明人在病例Pt1中发现有87380个单核苷酸多态性（SNP） 和6866处的插入/缺失，在病例Pt2中发现有89065个单核苷酸多态性 （SNP）和6760处的插入/缺失。随后通过dbSNP数据库 （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_summary.cgi）、千 人基因组数据库（www.1000genomes.org/）、HapMap8数据库 （http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/）等公共数据库的过滤，去掉所有 已知的且在数据库中等位基因频率大于0.005的变异。去掉同义突变， 将剩下的非同义/剪接位点突变和微小插入缺失进行优先选择：根据患 者症状，优先考虑已知亚历山大病致病基因GFAP基因，发明人找到 了GFAP基因上的一个新突变，G到A的错义突变c.1289G>A，导致 R430H的氨基酸改变。

为了进一步解释Pt1和Pt2临床症状差异是否还有其他突变导致， 发明人进一步用Endeavour software （http://homes.esat.kuleuven.be/bioiuser/endeavour/tool/endeavourwe b.php）对候选基因进行优先级排序，位于染色体Xp11.23的HDAC6 基因综合排名第一，该基因编码组蛋白去乙酰化酶6。患者Pt2为半合 子突变，C到T的错义突变c.2566C>T，导致P856S氨基酸改变。

然后，发明人又通过Polyphen2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2)、 SIFT(http://sift.bii.a-star.edu.sg)、 Mutpred(http://mutpred.mutdb.org)、 Pmut(http://mmb.pcb.ub.es/PMut)软件按照标准方法进行预测，进一步 确认了上述2个突变基因。

已知，GFAP基因（OMIM:*137780）位于17号染色体，编码胶 质纤维酸性蛋白。胶质纤维酸性蛋白被认为是星形胶质细胞的成熟标 志。对于健康成人，星形胶质细胞占中枢神经系统细胞总数的40%。 GFAP蛋白是细胞质内中间丝蛋白的主要构成部分，在胶质细胞分化 中参与细胞骨架的形成。已有实验证实GFAP蛋白在脑损伤发生发展 过程中具有重要作用。GFAP基因突变会导致脑内Rosenthal纤维的积 累，而脑内Rosenthal纤维是确诊亚历山大病的组织学前提。由于选择 性剪接，GFAP基因存在多个转录本，见图3，GFAP-α（GenBank登 录号NP_002046.1），含有9个外显子。GFAP-ε（GenBank登录号 NP_001124491.1），由于选择性剪接，C末端最后35个氨基酸与 GFAP-α不同。GFAP-κ（GenBank登录号NP_001229305.1）C末端 与GFAP-α不同，存在7B外显子。最常见的转录本是GFAP-α，截止 到目前，GFAP基因的突变都是在这个转录本上。临床上遗传检测通 常检测该转录本上9个外显子是否存在突变。但是目前仍有少数确诊 的患者该基因未发现突变。发明人在GFAP-α转录本上尚未找到致病 突变，通过外显子测序后意外发现，2个患者GFAP-ε转录本外显子 7A编码区上均存在c.1289G>A和p.R430H的杂合突变。这个突变也 可以在GFAP-κ转录本的3’-UTR上找到。

已知HDAC6基因位于X染色体，编码组蛋白去乙酰化酶6，为 HDAC家族中b类成员之一，催化组蛋白和非组蛋白的赖氨酸残基去 乙酰化。HDAC6蛋白拥有两个独特的催化区域，且高度同源，均有去 乙酰化酶活性，决定了它可以使不同底物去乙酰化。C末端有一个保 守的半胱氨酸和组氨酸富含区构成锌指结构ZnF-UBP。在体内， HDAC6蛋白能够催化组蛋白和非组蛋白如去乙酰化酶，在体内 HDAC6蛋白除有组蛋白去乙酰化酶活性外，还可介导非组蛋白如α- 微管蛋白（tubulin）、热休克蛋白90（HSP90）和抗氧化蛋白去乙酰 化。在小鼠和果蝇的模型中，HDAC6基因的突变会导致如帕金森病、 亨廷顿病神经退行性变疾病。α-微管蛋白是HDAC6蛋白去乙酰化的底 物之一，在体内去乙酰化的微管蛋白快速解聚，而乙酰化的α-微管蛋 白易于聚集而有利于微管的稳定。有意思的是，与肌萎缩性侧索硬化 （Amyotrophic lateral sclerosis）疾病相关的RNA结合调控因子 TDP-43和FUS/TLS以HDAC6mRNA作为特异性底物。在果蝇模型 中，沉默TDP-43导致HDAC6基因下调表达，而过量表达HDAC6基 因，使患脊髓小脑性共济失调的果蝇症状得到缓解。

由于外显子组测序存在一定程度的假阳性，接下来，发明人又利 用Sanger测序方法，对这两个基因的突变位点在家系内进行了验证， GFAP基因在患者Pt1和Pt2中均为杂合突变，而在家系内I-2（母亲）、 II-6、II-7、Ⅲ-1、Ⅲ-4均无突变（见图4）。HDAC6基因在患者Pt2 中为半合子突变，患者Pt1中无突变，家系内I-2（母亲）为杂合突变， II-6、II-7均无突变（见图5）。EVS外显子数据库 （http://evs.gs.washington.edu/EVS）中未发现这两个位点的突变。

为了进一步解释HDAC6基因突变导致患者Pt2特有的运动神经元 疾病表型，发明人测定了Pt1和Pt2患者以及正常人成纤维细胞中 HDAC6基因的表达量，结果表明两个患者及对照中HDAC6基因表达 量并无明显差异（图6A）。接着发明人利用免疫沉淀的方法检测到患 者Pt2乙酰化的α-微管蛋白较患者Pt1及对照明显增加（图6B）。免 疫细胞化学染色显示患者Pt2成纤维细胞核周区域乙酰化α-微管蛋白 成块异常聚集（图6C，上排、中排为20倍镜，下排为100倍镜）。 从图6D可以明显地看出患者Pt2成纤维细胞中多叶核/多形核的比例 较对照和患者Pt1显著性增加，而对照和患者Pt1之间无显著性差异。 因此可以推测HDAC6基因突变，导致微管组织中心功能失调，打破了 α-微管蛋白乙酰化与去乙酰化的动态平衡，最终导致神经退行性病变， 使患者表现出运动神经元疾病的症状。

因此，综上所述，发明人认为本发明找到的GFAP基因的突变是 成年型亚历山大疾病的另一致病突变位点，而HDAC6基因的半合子突 变使Pt2患者具有不同于患者Pt1的临床表型（见表1）。

表1.2名患者的基因突变位点

突变型亚历山大病相关GFAP基因与野生型亚历山大病相关 GFAP基因在序列上的区别是c.1289G>A；突变型亚历山大病相关 HDAC6基因与野生型亚历山大病相关HDAC6基因在序列上的区别是 c.2566C>T。

其中c.1289G>A表示野生型GFAP基因第1289位的碱基为G， 突变型亚历山大病相关GFAP基因第1289位碱基突变为A；c.2566C>T 表示野生型HDAC6基因第2566位的碱基为C，突变型亚历山大病相 关HDAC6基因的第2566位碱基突变为T。

在本发明中，采用本领域通用表示法表示突变。c.1289G>A表示cDNA 第1289位核苷酸由G变成A；p.R430H表示蛋白质水平第430位密码子由R 变成H；c.2566C>T表示cDNA第2566位核苷酸由C变成T；p.P856S表示蛋 白质水平第856位密码子由P变成S。

在一个实施方案中，GFAP基因为SEQ ID NO:1的序列表示。

在一个实施方案中，GFAP-ε蛋白为SEQ ID NO:3的序列表示。

在一个实施方案中，HDAC6基因为SEQ ID NO:2的序列表示。

在一个实施方案中，HDAC6蛋白为SEQ ID NO:4的序列表示。

在本发明中，A和/或B，等价于以下三种情况：A；B；A和B。 例如，GFAP基因c.1289G>A；和/或HDAC6基因c.2566C>T，表示以 下三种情形：GFAP基因c.1289G>A；HDAC6基因c.2566C>T；GFAP 基因c.1289G>A和HDAC6基因c.2566C>T。

对于本发明说明书和权利要求书中，提及基因序列，本领域技术人员 应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说 明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开 了与之互补的另一条链。例如提及GFAP基因或HDAC6基因的cDNA序 列，实际上包括该序列以及其互补序列。例如，提及SEQ ID NO:1，实际 包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一 条链，反之亦然。

本申请中的基因序列包括DNA形式或RNA形式，公开其中一种，意 味着另一种也被公开。例如提及GFAP基因或HDAC6基因的cDNA序列， 实际也包括相应的RNA序列。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人 员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的 范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的 技术或条件（例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验 指南》，第三版，科学出版社）或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪 器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例

实施例1样本收集

根据世界医学会《赫尔辛基宣言》的要求，患者和其他参与者与 BGI合作机构意大利分子神经遗传学研究所伦理委员会签署了知情同 意书。

样本来源如下：

实施例2样品制备

取患者Pt1和Pt2外周静脉血，利用常规酚-氯仿法抽提基因组 DNA用于高通量测序。利用分光光度计测量DNA的浓度及纯度，所 得的每个标本基因组DNA的OD260/OD280均位于1.7-2.0之间，浓度 不少于200ng/μl，总量不少于30μg。

实施例3文库构建和高通量测序

1.利用超声波仪（CovarisS2,Massachusetts,USA）将各基因组 DNA样本随机打断成100-200bp左右的片段，随后按照制造商提供的 操作说明书，在片段两端分别连接上接头制备文库（可参见： http://www.illumina.com/提供的Illumina/Solexa标准建库说明书，通 过参照将其全文并入本文）。文库检测合格后即可上机测序，以便获 得原始测序数据。其中，参照Illumina标准的成簇和测序的步骤进行 测序，测序平台为Illumina Hiseq2000，读取长度为90bp，样本的平 均测序深度为82.5×。利用Illumina basecalling Software1.7对上述获 得的原始测序数据进行处理，经过过滤去污染后，使用 SOAPaligner/SOAP2（可参见：Li R,Li Y,Kristiansen K,et al,SOAP: short oligonucleotide alignment program.Bioinformatics2008, 24(5):713-714；Li R,Yu C,Li Y,et al.,SOAP2:an improved ultrafast tool for short read alignment.Bioinformatics2009,25(15):1966-1967.， 通过参照将其全文并入本文）比对到参考基因组Hg19(snp132)，以便 获得比对到基因组上的唯一比对序列。然后利用SOAPsnp（可参见： Li R,Li Y,Fang X,Yang H,et al,SNP detection for massively parallel whole-genome resequencing.Genome Res2009, 19(6):1124-1132.，通过参照将其全文并入本文）确定靶区域的基因型。 Indel采用BWA（version0.5.9-r16）（可参见Li H,Durbin R.Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics2010;26(5):589-595）。

2.比对到参考基因组Hg19（snp132），然后利用GATK（version v1.0.4705）（可参见McKenna,A,Hanna M,Banks E,et al.The genome analysis toolkit:a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data.Genome Research2010; 20(9):1297-1303）确定indel的类型。

实施例4Sanger法测序验证

采集家系内的患者Pt1和Pt2及正常人I-2、II-6、II-7、Ⅲ-1、Ⅲ-4 外周血，利用常规酚-氯仿法抽提外周血白细胞中的基因组DNA，并利 用分光光度计测量DNA的浓度及纯度，所得的每个标本基因组DNA 的OD260/OD280均位于1.7-2.0之间，浓度不少于200ng/μl，总量不 少于30μg。

然后，分别对家系内的患者Pt1和Pt2及正常人I-2、II-6、II-7、 Ⅲ-1、Ⅲ-4进行检测，针对GFAP基因7A外显子、HDAC625号外显 子之间的序列设计引物，通过PCR扩增、产物纯化、测序的方法获得 GFAP、HDAC6基因有关序列，并根据序列测定结果属于突变型还是 野生型，验证GFAP、HDAC6与患者临床表型之间的相关性。具体方 法步骤如下：

1、DNA提取：

分别采取家系内的患者Pt1和Pt2及正常人I-2、II-6、II-7、Ⅲ-1、 Ⅲ-4的外周静脉血，按照实施例1的方法提取基因组DNA，分光光度 计测定DNA含量。

2、引物设计及PCR反应

参考人类基因组序列数据库GRCh37/hg19设计GFAP和HDAC6 基因外显子特异性引物，具体见下表。

a)引物序列：

b)接着，按以下配比分别配置各基因组DNA样本的PCR反应体 系PCR Core System Components：

反应体系：50μL

c)然后，将各PCR反应体系按照以下反应条件分别进行PCR反 应：

95℃2分钟；

30个循环：

95℃30秒，

58℃30秒，

72℃1分钟；

72℃5分钟；

4℃保持。

由此，获得患者和家系内正常人的PCR扩增产物。

3、测序

将步骤2中获得的获自患者Pt1和Pt2及正常人I-2、II-6、II-7、 Ⅲ-1、Ⅲ-4的PCR扩增产物直接进行DNA测序（ABI Prism3130XL）。

患者PI和PII及其母亲的GFAP基因c.1289G>A突变位点及 HDAC6基因c.2566C>T突变位点的Sanger测序验证峰图分别见图4 和图5。

综上，在患者家族成员中对GFAP基因7A外显子进行突变位点 验证发现：患者Pt1和Pt2均为c.1289G>A杂合突变，而家系内检测 的其他正常人均无此突变。在患者家族成员中对HDAC6基因25号外 显子进行突变位点验证发现：Pt2为c.2566C>T半合子突变，患者母 亲为杂合突变，患者Pt1及家系内其他检测的正常人无突变。EVS外 显子数据库中未发现这两个突变位点。

GFAP突变导致Pt1出现亚历山大病的症状，而GFAP与HDAC6 协同作用导致病例Pt2与Pt1不一样的临床表型。