头孢菌素类抗生素原料物质(7-ACA)生产用变异酶

摘要

本发明涉及头孢菌素类抗生素（cephalosporin antibiotics）原料物质7-ACA生产用变异酶，尤其涉及一种通过点突变（Point mutation）制造头孢菌素（Cephalosporin）C活性增加的变异头孢菌素C酰基转移酶（acylase）及利用此制造7-ACA的制造方法。本发明的变异CPC酰基转移酶（acylase）与野生型CPC酰基转移酶（acylase）相比，对CPC基质的活性增加5倍至26倍，只通过1个阶段以CPC直接制造7-ACA的效果尤为显著。

说明书

技术领域

本发明涉及头孢菌素类抗生素（cephalosporin antibiotics）原料物质7-ACA生产用变异酶，尤其涉及一种通过点突变（Point mutation）制造头孢菌素（Cephalosporin）C活性增加的变异头孢菌素C酰基转移酶（acylase）及利用此制造7-ACA的制造方法。 

背景技术

头孢菌素C（Cephalosporin C，下面简称为“CPC”）是β-内酰胺（β-lactam）类抗生物质，由丝状菌（Filamentous fungus）霉菌（mold）产黄头孢霉(Acremonium chrysogenum)等一些微生物生产，对革兰氏阴性（Gram negative）细菌通过阻碍细胞壁合成表现出抗生活性，但其程度非常微弱。因此其主要应用于制造半合成头孢菌素类抗生素（semi-synthetic cephalosporin antibiotics）的原料物质。特别是，从CPC去除氨基己二酰侧链（D—amino adipoyl side chain）而得到的7-氨基头孢烷酸（7-aminocephalosporanic acid，下面简称为“7-ACA”）正作为占全球抗生素市场40%以上的大部分头孢菌素类抗生素（cephalosporin antibiotics）的原料物质使用。 

利用CPC制造7-ACA的现有工艺有化学工艺和酶工艺。化学工艺的反应条件复杂、环境处理费用高，因此现在大部分企业都以环保形酶工艺生产7ACA。 

目前，企业以商用层面使用的酶工艺通常由两个阶段构成。第1阶段中利用D-氨基酸氧化酶（D-amino acid oxidase，下面简称为“DAO”）的酶反应，把CPC转化成戊二酰-7-氨基头孢烷酸（Glutaryl-7-aminocephalosporanic acid，下面简称为“Gl-7-ACA”），第2阶段中通过Gl-7-ACA酰基转移酶（acylase）的酶反应，把Gl-7ACA转化成7ACA（参考图1）。 

但第2阶段酶工艺的生产收率低。其原因在于第1阶段的酶反应所生成的过氧化氢对基质（CPC）、反应生成物（Gl-7-ACA）及DAO进行攻击。从而有必要开发一种酶工艺，在第1阶段，通过头孢菌素C酰基转移酶（Cephalosporin C acylase，下面简称为‘CPC酰基转移酶（acylase）’），从CPC直接制造7ACA。 

由于CPC酰基转移酶（acylase）不存在于自然界，因此同归改良存在于自然界的各种Gl-7-ACA酰基转移酶（也称作戊二酰酰胺酶（Glutaryl amidase：GA））制造CPC酰基转移酶（acylase）。Gl-7-ACA酰基转移酶（acylase）对CPC的活性非常弱，需要提高其活性。 

用于第2阶段酶工艺的Gl-7-ACA酰基转移酶（acylase）多见于各种土壤微生物，索纳韦恩（Sonawane）以如下【表1】的方式把Gl-7-ACA分为5个群组(Sonawane,Crit.Rev.Biotech.26:95-120,2006)。属于同一群组内的，蛋白质大小、氨基酸序列、基质特征、反应特征等非常相似，但不同群组的差别比较大。 

【表1】 

Gl-7-ACA酰基转移酶（acylase）的分类 

属于群组（Group）III的Gl-7-ACA酰基转移酶（acylase）存在容易被反应产物7-ACA及无机盐类阻碍活性、酶反应稳定性差的缺点，如果改良群组III的Gl-7ACA酰基转移酶（acylase）、则会继承上面的缺点。但群组II-B的Gl-7-ACA酰基转移酶（acylase）不存在群组III酶的缺点。从而，有必要通过改良群组III-B的Gl-7ACA酰基转移酶（acylase），获得7-ACA生产用第1阶段酶工艺所需变异酶。 

据此，本发明的发明人从属于群组II-B的假单胞菌（Pseudomonas）属GK16系列Gl-7ACA酰基转移酶（acylase），发现对CPC的活性增大的变异CPC酰基转移酶（acylase），完成了本发明。 

发明内容

发明的课题 

本发明的目的在于提供一种变异CPC酰基转移酶（acylase），其由序列号3所示氨基酸 序列的α亚基（α-subunit）与序列号4所示氨基酸序列的β亚基构成的野生型CPC（Cephalosporin C）酰基转移酶（acylase）序列中，F58β氨基酸被缬氨酸（Valine）置换。 

本发明的另一目的在于提供一种对所述变异CPC酰基转移酶（acylase）进行加密的基因。 

本发明的另一目的在于提供一种包括所述基因的重组表达载体（expression vector）。 

本发明的另一目的在于提供一种通过所述表达载体（expression vector）被形质转换（transformation）的宿主细胞。 

本发明的另一目的在于提供一种通过所述表达载体（expression vector）被形质转换（transformation）的微生物。 

本发明的另一目的在于提供一种包括所述变异CPC酰基转移酶（acylase）的7-ACA(7-Aminocephalosporanic acid)制造用合成物。 

本发明的另一目的在于提供一种利用所述CPC酰基转移酶（acylase）的7-ACA制造方法。 

实施方案 

为了达到上述目的，本发明提供一种变异CPC酰基转移酶（acylase），其由序列号3所示氨基酸序列的α亚基（α-subunit）与序列号4所示氨基酸序列的β亚基构成的野生型CPC（Cephalosporin C）酰基转移酶（acylase）序列中，F58β氨基酸被缬氨酸（Valine）置换。 

本发明提供一种对所述变异CPC酰基转移酶（acylase）进行加密的基因。 

本发明提供一种包括所述基因的重组表达载体（expression vector）。 

本发明提供一种通过所述表达载体（expression vector）被形质转换（transformation）的宿主细胞。 

本发明提供一种通过所述表达载体（expression vector）被形质转换（transformation）的微生物。 

本发明提供一种包括所述变异CPC酰基转移酶（acylase）的7ACA制造用合成物。 

本发明提供一种利用所述CPC酰基转移酶（acylase）的7-ACA制造方法。 

下面对本发明进行详细说明。 

本发明提供一种变异CPC酰基转移酶（acylase），其由序列号3所示氨基酸序列的α亚基（α-subunit）与序列号4所示氨基酸序列的β亚基构成的野生型CPC（Cephalosporin C）酰基转移酶（acylase）序列中，F58氨基酸被缬氨酸（Valine）置换。 

所述变异CPC酰基转移酶（acylase）可追加包括从由Y153βT、F177βL及Y153βT+F177βL构成的群中选择的突变。所述‘Y153βT+F177βL’意味着同时具有Y153βT及F177βL突变。另外，以Y153βT为例说明的话，标记突变的编码应解释为β亚基（序列号4）第153个位置的酪氨酸（TyrosineY）被苏氨酸（Threonine T）置换。 

本发明的所述变异CPC酰基转移酶（acylase），其对CPC基质的活性高于野生型CPC酰基转移酶（acylase）。本发明所述“对CPC基质的活性增加”是指对CPC基质的比活性（specific activity）增加或指由反应产物引发的终端物抑制（end-product inhibition）现象减小。 

从大部分Gl-7-ACA酰基转移酶（acylase）基因翻译所获氨基酸序列的顺序为α亚基（α-subunit）、间隔肽（Spacer Peptide）、β亚基。本发明中使用的基本基因（basic gene：ga基因）经过转录及翻译过程后生成由约77kDa大小非活性（inertness）单链构成的多肽（polypeptide）。之后，间隔肽掉落，形成由约18kDa大小α亚基（α-subunit）（序列号3）及58kDa大小β亚基（序列号4）构成的二量体（dimer）形态。 

使用通过ga基因制造的野生型CPC酰基转移酶（acylase），依靠点突变(Point Mutation)及基因操作技术，制造了对CPC酰基转移酶（acylase）基质的活性增大的变异CPC酰基转移酶（acylase）。 

为了选择对野生型CPC酰基转移酶（acylase）引发点突变的位置，以三维结构模型及假设突变结果为基础，研究已知候补变异残基（residue），选择了4种残基（F31β,F58β,Y153β,F177β）。F31β意味着β亚基氨基酸序列中位于第31位的苯基丙氨酸(Phenylalanine,Phe,F)。 

对所述选择的四种残基（F31β,F58β,Y153β,F177β）实施饱和突变。其结果，F31β、Y153β、F177β残基三点饱和突变后，对CPC的活性没有增加，只有F58的被缬氨酸(Valine)置换的突变体（F58V，也表现为变异酶）增加了活性（参考实施例2-2）。野生型CPC酰基转移酶（acylase）活性看做1时，所述S17变异酶的活性为野生型的5.3倍（参考实施例4）。 

为了增加F58βV突变体对CPC的活性，以F58βV突变体为对象，对F31β、Y153β、F177β等残基分别实施饱和突变（两点突变）。结果，F31的饱和突变没有增加活性，而F58βV/F177βL('A5变异酶')及F58βV/Y153βT('B2变异酶')变异体相对于野生型、活性分别增加了9.8倍、14.5倍（参考实施例2-3及实施例4）。该结果说明，Y153βT、F177βL突变对野生型没有效果，但在F58βV突变体中提高对CPC基质的活性。F58βV/Y153βT/F177βL（三点突变）变异体（‘R1变异酶’），与对野生型相比，对CPC基质的活性高16.8倍（参考实施例4）。 

S17、A5、B2及R1变异体还可以追加包括I45β或V382β氨基酸被其他氨基酸置换的突变。最好是R1变异体还可以追加包括I45β或V382β上的突变。 

所述追加包括的突变，其特征在于：I45β被蛋氨酸(Methionine)、缬氨酸（Valine)、丙氨酸(Alanine)、半胱氨酸(Cysteine)、亮氨酸(Leucine)中的某一种氨基酸置换，V382β被亮氨酸(Leucine)或异亮氨酸（Isoleucine）置换。 

本发明的变异CPC酰基转移酶（acylase），其特征在于：所述变异CPC酰基转移酶（acylase）由序列号6所示氨基酸序列的α亚基（α-subunit）与序列号7所示氨基酸序列的β亚基构成。 

为了让实施例2-4中制造的F58βV/Y153βT/F177βL（R1变异酶）变异体的活性增加，实施例随机突变。以所述三点变异体基因DNA为模板通过易错聚合酶连锁反应（Error-prone PCR）诱导随机点突变。其结果，发现45βM/F58βV/Y153βT/F177βL('M23变异酶')及F58βV/Y153βT/F177βL/V382βI('M27变异酶')的四点变异体对CPC的活性高于R1变异酶（实施例3-1）。与野生型比较结果，M23比野生型高18.8倍，M27比野生型高出20.3倍（参考实施例4）。 

通过实施例3-1的结果可知，I45β,V382β残基变异会提高CPC酰基转移酶（acylase）活性。在此，对F58βV/Y153βT/F177βL三点变异体制造I45β及V382β两点饱和突变（5点突变）库（Library），筛选（Screening）了活性增加程度高于M27变异酶的变异体。其结果，选出了5个五点变异体(I45βV/F58βV/Y153βT/F177βL/V382βL,I45βA/F58βV/Y153βT/F177βL/V382βI,I45βC/F58βV/Y153βT/F177βL/V382βL,I45βM/F58βV/Y153βT/F177βL/V382βL,I45βL/F58βV/Y153βT/F177βL/V382βI)（参考实施例3-2）。 

上面的各酶中，PM2(I45βV/F58βV/Y153βT/F177βL/V382βL)变异酶的活性最高。所述PM2变异酶，其特征在于：由序列号6所示氨基酸系列的α亚基（α-subunit）及序列号7所示氨基酸序列的β亚基构成。 

所述实施例3-2结果的特征在于：I45β残基中异亮氨酸（Isoleucine）被蛋氨酸、缬氨酸(Valine)、丙氨酸、半胱氨酸或亮氨酸置换，V382β中缬氨酸(Valine)被亮氨酸或异亮氨酸置换。 

实施例3揭示了提高CPC酰基转移酶（acylase）活性的新一种残基（I45β及V382β），具有很大的意义。图2为实施例2至3的变异体选拔过程模式图。 

本发明提供对所述各种变异CPC酰基转移酶（acylase）进行加密的基因。最好是，所述基因可通过序列号5所示碱基序列表示。 

用于制造变异CPC酰基转移酶（acylase）的基本基因为来自属于群组（Group）II-B的假单胞菌（Pseudomonas）属GK16系列的戊二酰酰胺酶（Glutaryl amidase：GA）基因（下面简称为“ga基因”）。这里，对为各氨基酸加密、提高蛋白质合成效率的密码子（codon），以大肠菌经常使用的密码子为主，定了碱基序列。通过这种方法合成的ga碱基序列以序列号1（2079个碱基）表示，氨基酸序列以序列号2（692个氨基酸）表示。 

所述ga基因中，除了α亚基（α-subunit）及β亚基之外，还包括对间隔肽进行加密的碱基序列，这对于本发明的变异CPC酰基转移酶（acylase）加密基因也相同。由于本发明的变异酶只在野生型β亚基中引发突变，因此变异酶及野生型酶具有相同的氨基酸序列的α亚基（α-subunit）和间隔肽。 

作为其例，把对活性表现最高的变异体PM2进行加密的基因碱基序列表示在序列号5中。 

本发明提供包括对变异CPC酰基转移酶（acylase）进行加密的基因的重组表达载体（expression vector）。 

本发明中，‘表达载体（expression vector）’是指对硫基裂解酶（Thiolase）加密的多核苷酸（Polynucleotide）被克隆（Cloning）的质体（Plasmid）、病毒或其他媒介体。本发明中被克隆的多核苷酸序列可操作地连接在适当的表达调节序列上。所述可操作地连接的基因序列，可存在于同时还包括选择标记及复制起点(replication origin)的一个表达载体（expression vector）内。所述‘可操作地连接（operably linked）’是指所述多核苷酸序列以可让基因表达的方式连接在表达调节序列上。所述‘表达调节序列（expression control sequence）’是指在特定宿主细胞上，对可操作地连接的多核苷酸序列的表达进行调节的DNA序列。这种调节序列包括由用于实施转录的启动子（promoter）、用于调节转录的任意操纵基因（operator）序列、对适当的mRNA脂质体（liposome）结合部位进行编码（coding）的序列、对转录及解读的结束进行调节的序列等构成的群中所选的某一种以上。 

作为所述表达载体（expression vector）的母载体使用的载体，没有特别的限制。在本发明所属技术领域、作为宿主细胞使用的微生物中，为了表达所使用的所有质体、病毒或其他媒介体等均可使用。比如作为所述质体有来自大肠菌的质体(pBR322,pBR325,pUC118及pUC119,pET-22b(+))、来自枯草杆菌(bacillus subtilis)的质体(pUB110及pTP5)及来自酵母的质体(YEp13,YEp24及YCp50)等，作为所述病毒有逆转录病毒（Retrovirus）、腺病毒（adenovirus）或牛痘病毒（vaccinia virus）等动物病毒、杆状病毒（baculovirus）等昆虫病毒，但不受限于此。 

所述重组表达载体（expression vector）最好是包括以序列号5所示碱基序列表示的基因。 

由序列号5加密的变异CPC酰基转移酶（acylase）作为变异酶PM2，制造了包括序列号5所示基因的重组表达载体（expression vector）pBC-PM2质体（参考实施例4）。 

另外，本发明提供通过所述表达载体（expression vector）得到形质转换（transformation）的宿主细胞及微生物。 

所述宿主细胞的含义包括通常使用的所有种类单细胞有机体、比如各种细菌（比如属 （Clostridia）、大肠菌等）等的原核细胞微生物及酵母等真核细胞微生物，比如包括但不局限于梭菌(Clostridia)属微生物(比如、丙酮丁醇梭杆菌（Clostridium acetobutylicum）、拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）、糖化过氧丁基乙腈梭菌（Clostridium saccharoperbutylacetonicum）、糖化丁基乙腈梭菌(Clostridium saccharobutylicum))、大肠菌等。 

所述形质转换（transformation）可以通过把包含变异CPC酰基转移酶（acylase）加密多核苷酸序列的表达载体（expression vector）引入到宿主细胞时所使用的一些方法执行。比如，把所述表达载体（expression vector）引入到宿主细胞的方法包括但不局限于氯化钠(CaCl2)及热冲击(heat shock)法、粒子枪冲击法(particle gun bombardment)、碳化硅晶须(Silicon carbide whiskers)、超声波处理(sonication)、电穿孔(electroporation)、通过PEG(polyethylenglycol)的沉淀法。 

所述微生物是通过含序列号5所示碱基序列基因的重组表达载体（expression vector）pBC-PM2得到形质转换（transformation）的大肠埃希氏菌（Escherichia coli）MC1061/pBC-PM2(登记号：KCTC12344BP)。 

本发明提供包括本发明变异CPC酰基转移酶（acylase）的7-ACA制造用合成物。 

把通过插有本发明变异CPC酰基转移酶（acylase）加密基因或具与之同等功能序列基因的重组表达载体（expression vector）得到形质转换（transformation）的宿主细胞，在适当的培养基和条件下培养，制造变异CPC酰基转移酶（acylase）。另外，把通过插有本发明变异CPC酰基转移酶（acylase）的α亚基（α-subunit）加密基因或具与之同等功能序列的基因的重组表达载体（expression vector）得到形质转换（transformation）的宿主细胞，与通过插有本发明变异CPC酰基转移酶（acylase）β亚基加密基因或具与之同等功能序列基因的重组表达载体（expression vector）得到形质转换（transformation）的宿主细胞，分别在适当的培养基和条件下培养，制造变异CPC酰基转移酶（acylase）亚基蛋白后，在试管内（in vitro）混合两种亚基蛋白，制造变异CPC酰基转移酶（acylase）。 

通过所述方法制造的本发明变异CPC酰基转移酶（acylase）可以直接使用、制造目标产物，或者可提纯使用。作为变异CPC酰基转移酶（acylase）的分离提纯方法，可利用已知CPC酰基转移酶（acylase）性质，通过多种以色谱法(chromatography)分离蛋白质的分离方法，或者按实验目的略微变形使用一般的分离方法。另外，通过利用组氨酸肽（histidine peptide）和镍柱（Column）成分的结合力或纤维素结合域（cellulose binding domain,CBD）、与纤维素的结合力等特定结合力性质的亲和色谱法(affinity chromatography)方法，提纯变异CPC酰基转移酶（acylase）也可以。 

另外，本发明的变异CPC酰基转移酶（acylase）不仅可以以游离状态使用，也可以以固定化状态使用。变异CPC酰基转移酶（acylase）的固定化，可通过本行业公知的通常方法进行。作为载体可使用纤维素、淀粉、右旋糖酐（dextran）、琼脂糖(agarose)等天然聚合物（polymer）；聚丙烯酰胺(polyacrylamide)、聚丙烯酸酯(polyacrylate)、聚甲基丙烯酸酯(polymethacylate)、亚克力C(Eupergit C)等合成聚合物；或硅土(silica)、膨润土(bentonite)、金属等矿物质。另外，在这些载体上可通过共价结合（covalent bond）、离子结合、疏水结合、物理吸附、卫星胶囊（microencapsulation）等方式，结合变异CPC酰基转移酶（acylase）。也可让这些载体-酶结合体在戊二醛(glutaraldehyde)、溴化氢(cyanogen bromide)等的作用下、形成共价结合，固定变异CPC酰基转移酶（acylase）。另外，更好的方法是不提纯变异CPC酰基转移酶（acylase），直接把含变异CPC酰基转移酶（acylase）的微生物细胞固定化使用。诸如此类整体细胞固定(whole cell immobilization)时，为了提高含于微生物的变异CPC酰基转移酶（acylase）的反应性，可适用给细胞穿孔或表面表达等技术。 

包括本发明变异CPC酰基转移酶（acylase）的7-ACA制造用合成物包括由变异CPC酰基转移酶（acylase）、对所述酶进行编码的多核苷酸、包括所述多核苷酸的表达载体（expression vector）、通过所述表达载体（expression vector）得到形质转换（transformation）的形质转换（transformation）体构成的群中选择的某一种以上。 

本发明提供利用所述变异CPC酰基转移酶（acylase），以如下化学式1的化合物或其盐，制造如下化学式2的化合物或其盐所需制造方法。 

下面的化学式中，R为乙酰氧基(-OCOCH₃)、羟基(-OH)、氢基(-H)。最好是，下面的化学式的R为乙酰氧基(-OCOCH₃)、下面化学式的最佳化合物的盐形态是碱性金属（比如：钠盐、钾盐、锂盐等）。另外，化学式1的化合物是CPC基质化合物，化学式2的化合物是7ACA化合物为宜。 

化学式1 

化学式2 

本行业人员可让通过所述方法制造的变异CPC酰基转移酶（acylase）生产菌株的培养物或以含变异CPC酰基转移酶（acylase）合成物形式，或让分离的酶按游离状态或固定化状态，与所述化学式1的化合物接触制造所述化学式2的化合物。本发明的变异CPC酰基转移酶（acylase）与所述化合物1的接触在水溶液（水或缓冲溶液）中实施为宜。化合物1的浓度最好是在1~500mM范围内，本发明变异CPC酰基转移酶（acylase）添加量最好是在0.1~100U/Ml范围内，反应混合液的pH值最好是在7~10范围内，反应时间最好是在0.1~24小时范围内，反应温度最好是在4~40℃范围内选择。通过这种酶反应生成的化合物2，可通过一般的方法从反应液分离、提纯。 

另外，在生物体内（in vivo），通过让本发明变异CPC酰基转移酶（acylase）与所述化合物1接触，制造所述化合物2。在所述化合物1的具有生物合成能力的产黄头孢霉(Acremonium chrysogenum)等菌株中，引入插有本发明变异CPC酰基转移酶（acylase）加密基因或具有与之同等功能序列的衍生物的重组表达载体（expression vector），在适当培养基和条件下培养所述形质转换（transformation）体，可在形质转换（transformation）体内、通过让生物合成的化合物1与本发明变异CPC酰基转移酶（acylase）自然接触、制造化合物2。 

发明效果 

本发明的变异CPC酰基转移酶（acylase）与野生型CPC酰基转移酶（acylase）相比，对CPC基质的活性增加5倍至26倍，只通过1个阶段以CPC直接制造7-ACA的效果尤为显著。 

附图说明

图1为以CPC制造7ACA的第1阶段酶工艺及第2阶段酶工艺流程图。 

图2为本发明变异CPC酰基转移酶（acylase）制造过程示意图。 

具体实施方式

在此，对本发明进行详细说明。 

下面的实施例只是本发明的示例，本发明的内容部受限于下述实施例。 

<实施例1> 

CPC酰基转移酶(Cephalosporin C Acylase)的制造及活性检测 

<1-1>pBC-GA质体的制造 

用于制造变异CPC酰基转移酶（acylase）的基本基因为来自假单胞菌（Pseudomonas）属GK16系列(Matsuda et.al.,J.Bacteriol.163:1222-1228,1985)的戊二酰酰胺酶（Glutaryl amidase：GA）基因（下面简称为“ga基因”）。 

pBC-GA质体是把序列号1所示ga结构基因DNA片段插入到pBC KS(+)载体(Stratagene公司、美国)的XbaI与NotI限制酶（restriction enzyme）辨认部位所制造的。 

为了向所述结构基因引入限制酶（restriction enzyme）辨认部位及核糖体（ribosome）结合部位等，实施了聚合酶连锁反应（PCR）。PCR反应的成分配比为10ng合成gaDNA、各50pmol的GA-F处理剂（primer；序列号为12）和GA-R处理剂(序列号:13)、Taq缓冲溶液(5mM KCl、5mM Tris-HCl(pH8.3)、1.5mM MgCl2)、0.2mM dNTP混合液、2.5单位ExTaq聚合酶(Takara公司、日本)，最终容积调节为100μl。另外，PCR使用了循环变温加热器(Peltier Thermal Cycler PTC-200;MJ Research公司、美国)，反应条件为95℃下、让混合物进行5分钟先变性(pre-denaturation)反应，在95℃1分钟变性(denaturation)反应，58℃30秒退货处理(annealing)及72℃条件下、进行90秒聚合(polymerization)反应，并反复进行所述反应25次后，在72℃条件下、进行10分钟后聚合(post-polymerization)反应。把通过所述PCR获得的约2.1kb大小PCR产物以限制酶（restriction enzyme）XbaI与NotI进行切断后、以提纯设备(QIAEX Gel ExtractionKit;Qiagen公司、德国)进行提纯，把此作为插入DNA使用。另外，把对pBC KS(+)载体DNA以限制酶（restriction enzyme）XbaI和NotI进行切断后、以CIP脱磷酸化所得DNA片段作为载体DNA使用。把所述插入DNA和载体DNA，利用连接酶（ligase：Roche公司、德国)在16条件下，进行12~16小时结扎(ligation)后，利用所述结扎液，以电穿孔(electrophoration)执行了E.coli MC1061菌株的形质转换（transformation）。把所述菌株涂抹在浓度25ug/mL含氯霉素（chloramphenicol）抗生素的LB琼脂（agar）培养基，在30℃条件下静止培养一个晚上，选别了各形质转换（transformation）体。从该形质转换（transformation）体分离质体，决定插入DNA的碱基序列，制造了包括具序列号1所示碱基序列的ga结构基因的pBC-GA。 

为了检测利用含pBC-GA质体重组大肠菌生产CPC酰基转移酶（acylase）的生产效率，以如下方法制造了CPC酰基转移酶（acylase）粗酶溶液（crude enzyme solution）。把所述大肠菌形质转换（transformation）体分别接种到含25ug/mL氯霉素的3ml LB培养基(1% Bacto-tryptone,0.5%Yeast Extract,0.5%NaCl)后，以30℃、200rpm条件进行16小时振荡培养。之后把培养液50uL接种到含25ug/mL氯霉素的50mL新LB培养基后，以25℃、200rpm条件，进行48小时振荡培养。把该烧瓶培养液进行离心分离(4℃,8,000rpm,10分钟)，回收菌体后，把0.1M磷酸钾（potassium phosphate；pH8.0)，洗涤2次。用该菌体以5mL同一缓冲溶液进行悬浊后，在4℃条件下，以超声波粉碎机粉碎10分钟，以4℃,15,000rpm条件离心分离20分钟后，取上层液，制造了CPC酰基转移酶（acylase）粗酶溶液。 

<1-2>CPC酰基转移酶（acylase）活性检测 

为了检测所述实施例<1-1>中合成的CPC酰基转移酶（acylase）活性程度，以变形的朴（Park）等的方法(Park等,Kor.J.Appl.Microbiol.Biotechnol.23:559-564,1995)，实施如下。 

把CPC基质(纯度90%;哈药公司、中国)，以20mg/mL溶液于0.1M磷酸钾（potassium phosphate）(pH8.0)缓冲溶液后，以1N NaOH调节pH为8.0，制造了基质溶液。向该CPC基质溶液20uL添加酶溶液20uL，在37℃条件下反应5分钟后，添加50mM NaOH-20%冰醋酸(glacial acetic acid;1:2)溶液200uL，使反应停止。之后进行离心分离、回收的上层液，向该上层液200uL、添加溶解于甲醇的0.5%(w/v)PDAB(p-二甲氨基苯甲醛（dimethylaminobenzaldehyde）;Sigma,美国)40uL、反应10分钟后，在415波长下检测吸光度，与标准物质的定量曲线比较，进行了定量。这里，1单位(unit)定义为每分钟以CPC生成1微摩尔（umole）的7-ACA的酶量。另外，对于CPC基质的比活性，以布拉德福德(Bradford,M.,Anal.Biochem.72:248-254,1976)的方法检测酶溶液中蛋白质的，之后以对应于1mg蛋白质的活性单位表示。 

通过所述方法制造粗酶溶液，检测了CPC酰基转移酶（acylase）活性。其结果，通过重组E.coli MC1061(pBC-GA)菌株生产CPC酰基转移酶（acylase）的生产效率约为40单位/L。 

<实施例2> 

利用饱和突变制造变异CPC酰基转移酶（acylase） 

<2-1>根据公知结构信息选别GA变异残基 

为了改良对CPC基质的活性非常微弱的所述实施例1的CPC酰基转移酶（acylase）（野生型），以公知的三维结构模型和假设突变信息为基础，对GA活性部位进行突变处理。 

为此，优先检讨了Fritz-Wolf等(Fritz-Wolf et.al.,Protein Sci.11:92-103,2002)提出的8个GA活性部位各氨基酸残基(Y149β,L24β,Y33β,Q50β,R57β,V70β,Y153β, F177β)，还同时检讨了金等提出的来自假单细胞属CAD的Gl-7-ACA酰基转移酶（acylase）活性部位残基(Kim et.al.,J.Biol.Chem.276:48376-48381,2001)。其结果，作为野生型GA的活性部位变异残基，选择了4个残基(F31β,F58β,Y153β,F177β)。 

<2-2>F58β变异体的制造 

为了制造CPC酰基转移酶（acylase）活性得到增加的变异CPC酰基转移酶（acylase），对GA活性部位残基——F31β,F58β,Y153β,F177β残基，分别实施以20种氨基酸置换的饱和突变(saturation mutagenesis)处理，建立了4种突变库。具体突变库建立过程如下。 

具体地，为了构建F31β残基饱和突变库，以pBC-GA质体为模板，实施使用M13-R处理剂(序列号:11)和F31b-R处理剂(序列号:15)的PCR，回收了0.7kb大小的PCR产物。另外，以pBC-GA质体为模板，实施使用F31b-F处理剂(序列号:14)和M13-F处理剂(序列号:10)的PCR，回收了1.5kb大小PCR产物。混合所述0.7kb的PCR产物和1.5kb大小的PCR产物，在不添加处理剂的情况下，以所述方法实施PCR，回收了两种PCR产物连接为一个的约2.1kb大小的PCR产物。以通过所述方法获得的2.1kb大小的PCR产物为模板，实施使用T3处理剂(序列号:8)和T7处理剂(序列号:9)的PCR，增幅了约2.1kb大小的一点变异体DNA片段。 

对通过所述PCR获得的变异基因，即2.1kb的PCR产物，以限制酶（restriction enzyme）XbaI和NotI进行切断后以提纯设备(QIAEX Gel Extraction Kit)进行提纯，作为插入DNA使用。对pBC KS(+)载体DNA，以限制酶（restriction enzyme）XbaI和NotI进行切断，把以CIP进行脱磷酸化的DNA片段作为载体DNA使用。对所述插入DNA和载体DNA，利用T4 DNA连接酶，在16℃条件下进行16结扎后，利用所述结扎液，以电穿孔法进行了E.coli MC1061菌株的形质转换（transformation）。把所属菌株涂抹在含25ug/mL浓度氯霉素抗生素的LB琼脂培养基上，在30℃条件下，静置培养一个晚上，构建了F31β残基突变体库。 

以同上方法，分别构建了F58β,Y153β,F177β残基饱和突变库。这里，构建F58β残基饱和突变库时使用了F58b-F处理剂(序列号:16)和F58b-R处理剂(序列号:17)，构建Y153β残基饱和突变库时使用了Y153b-F处理剂(序列号:18)和Y153b-R处理剂(序列号:19)，构建F177β残基饱和突变库时使用了F177b-F处理剂(序列号:20)和F177b-R处理剂(序列号:21)。 

从所述饱和突变库中，以如下方法筛选了对CPC基质的反应性增加的变异CPC酰基转移酶（acylase）。 

把含发生突变的CPC酰基转移酶（acylase）基因的E.coli MC1061形质转换（transformation）体，接种到分别移接有含氯霉素抗生素的LB液体培养基200uL的96孔 板（well plate）后，以30℃,180rpm条件，进行60~70小时振荡培养。之后从所述孔板中分别取100uL培养液，把之移接到新96-孔板。把所述培养液与100uL细胞分解溶液(含0.67mg/mL溶解酶(lysozyme),1.3mM EDTA,0.13%Triton X-100的0.1M磷酸钾（potassium phosphate）(pH8.0)缓冲溶液)混合，在30℃条件下，放置2小时。之后添加溶解于0.1M磷酸钾（potassium phosphate）(pH8.0)缓冲溶液的2.5%(w/v)CPC基质，在28℃条件下，进行14~16小时CPC基质加水分解反应。进行CPC基质的加水分解反应后，把反应液以4,200rpm离心分离20分钟、获得上层液。把获得的上层液50uL移接到新96-孔板。这里，添加反应停止液(醋酸（acetic acid）:250mM NaOH,2:1)160uL，让酶反应停止后，添加显色剂(溶解于甲醇的0.5%(w/v)PDAB溶液)40uL，在室温下放置10分钟。之后使用96-孔板阅读器在415nm下检测吸光度，筛选了对CPC基质活性增加的变异体。 

以同上方法对F31β,F58β,Y153β,F177β残基4点饱和突变库进行了筛选。其结果，F31β、Y153β、F177β残基三点的饱和突变库中，未发现与野生型GA相比CPC酰基转移酶（acylase）活性得到增加的变异体。但F58残基饱和突变库中选拔了CPC酰基转移酶（acylase）活性增加的变异体1种(S17)。通过决定对该变异体进行加密的基因碱基序列，确认了S17变异酶的F58β残基被缬氨酸(Valine)置换。S17变异酶的氨基酸序列表示为序列号28。 

<2-3>F31β/F58β,F58β/Y153β,F58β/F177β两点变异体的制造 

为了进一步增加所述F58βV变异体的CPC酰基转移酶（acylase）活性，以F58βV变异体基因为对象，以与实施例<1-3>相同的方法，对F31β,Y153β,F177β残基构建了饱和突变库。 

之后，以与实施例<2-2>相同的方法，筛选了三点饱和突变库。其结果，F31残基饱和突变库中未能筛选出与F58βV变异体相比CPC酰基转移酶（acylase）活性得到增加的变异体。但从Y153β残基及F177β残基饱和突变库中各筛选出1种（B2及A5）CPC酰基转移酶（acylase）活性增加的变异体。通过决定对这些变异体加密的基因碱基序列，确认到B2变异酶的Y153β残基被氨酸（Threonin）置换，A5变异酶的F177β残基被置换成亮氨酸（leucine）。即，B2变异酶是F58βV/Y153βT两点变异体，A5是F58βV/F177βL两点变异体。 

<2-4>F58β/Y153β/F177β三点变异体的制造 

从所述实施例<2-3>中可以看出向F58βV变异体引入Y153βT或F177βL，有助于提高CPC酰基转移酶（acylase）活性。进而，制造F58βV/Y153βT/F177βL三点变异体，开发了基于公知结构信息的变异CPC酰基转移酶（acylase）。 

具体地，向F58βV/Y153βT两点变异体引入F177βL变异，制造了F58βV/Y153βT/F177βL三 点变异体。这里，使用F177bL-F处理剂(序列号:22)和F177bL-R处理剂(序列号:23)，以与实施例<2-2>相同的方法，制造了含三点变异基因的形质转换（transformation）体。从该形质转换（transformation）体分离质体，决定碱基序列，以此确认变异是否得到正常接入。对通过此制造的F58βV/Y153βT/F177βL三点变异酶进行加密的变异CPC酰基转移酶（acylase）基因命名为R1。 

<实验例3> 

基于随机突变的变异CPC酰基转移酶（acylase）的制造 

<3-1>I45β/F58β/Y153β/F177β及F58β/Y153β/F177β/V382β四点变异体的制造 

为了进一步提高所述实施例<2-4>的F58βV/Y153βT/F177βL三点变异体CPC酰基转移酶（acylase）活性，把F58βV/Y153βT/F177βL三点变异体DNA作为模板DNA使用，实施易错聚合酶连锁反应，在随机位置上诱发点突变，构建了相应突变库。具体的突变库构建方法如下。 

易错聚合酶连锁反应PCR反应液由作为模板DNA5ng的F58βV/Y153βT/F177βL三点变异体DNA、各50pmol的T3处理剂(序列号:8)和T7处理剂(序列号:9)、5mM KCl、5mM Tris-HCl(pH8.3)、3.5mM MgCl2、0.025mM MnCl2、各0.2mM的dATP和dGTP、各1mM的dCTP和dTTP、5单位的rTaq聚合酶(Takara公司、日本)构成，最终容积调节为100uL。PCR使用了循环变温加热器（Peltier Thermal Cycler），反应条件为95℃下、让混合物进行3分钟先变性(pre-denaturation)反应，在95℃1分钟变性(denaturation)反应，58℃30秒退货处理(annealing)及72℃条件下、进行90秒聚合(polymerization)反应，并反复进行所述反应25次后，在72℃条件下、进行10分钟后聚合(post-polymerization)反应。 

把通过所述易错聚合酶连锁反应获得的变异基因、即约2.1kb大小PCR产物以限制酶（restriction enzyme）XbaI与NotI进行切断后、以提纯设备(QIAEX Gel Extraction Kit;Qiagen公司、德国)进行提纯，把此作为插入DNA使用，并把pBC-GA质体以限制酶（restriction enzyme）XbaI与NotI进行切断所回收的3.4kb大小DNA片段作为载体DNA使用。把所述插入DNA和载体DNA，利用连接酶（ligase)在16℃条件下，进行16小时结扎(ligation)后，利用所述结扎液，以电穿孔(electrophoration)执行了E.coli MC1061菌株的形质转换（transformation）。把所述菌株涂抹在浓度25ug/mL含氯霉素（chloramphenicol）抗生素的LB琼脂（agar）培养基，在30℃条件下静止培养一个晚上，构建了随机突变库。 

从所述随机突变库以实施例<2-2>的方法筛选了对CPC基质的活性增加的变异CPC酰基转移酶（acylase）。其结果，约25000种变异体中筛选出了与F58βV/Y153βT/F177βL三点变异体相比，CPC活性增加的变异体两点（M23及M27）。通过决定对这些变异体加密的基因碱基 序列，确认到M23变异酶的I45β残基被蛋氨酸置换，M27变异酶的V382β残基被异亮氨酸置换。 

<3-2>I45β/F58β/Y153β/F177β/V382β五点变异体的制造 

所述<3-1>的结果表明，向F58βV/Y153βT/F177βL三点变异体引入I45βM或V382βI的突变时，CPC酰基转移酶（acylase）活性会增加。为了进一步提高CPC酰基转移酶（acylase）活性，构建了以F58βV/Y153βT/F177βL三点变异体为基础的I45β残基及V382β残基的两点饱和突变库。具体的突变库构建过程如下。 

为了构建I45β残基及V382β残基两点饱和突变库，以F58βV/Y153βT/F177βL三点变异体DNA作为模板，实施使用M13-R处理剂(序列号:11)和I45b-R处理剂(序列号:25)的PCR，回收了0.7kb大小的PCR产物，并以F58βV/Y153βT/F177βL三点变异体DNA作为模板，实施使用I45b-F处理剂(序列号:24)和V382b-R处理剂(序列号:27)的PCR，回收了1.0kb大小PCR产物，同时以F58βV/Y153βT/F177βL三点变异体DNA作为模板，实施使用V382b-F处理剂(序列号:26)和M13-F处理剂(序列号:10)的PCR，回收了0.5kb大小的PCR产物。混合所述0.7kb的PCR产物和1.0kb的PCR产物及0.5kb大小的PCR产物，在不加处理剂的情况下、实施PCR，回收了三种PCR产物连接成一个的约2.1kb大小的PCR。把以此获得的2.1kb大小PCR产物作为模板，实施使用T3处理剂(序列号:8)和T7处理剂(序列号:9)的PCR，增幅了约2.1kb大小的五点变异体DNA片段。把以此获得的2.1kb大小PCR产物，以与实施例<2-2>相同的方法插入到pBC KS(+)载体DNA中，实施E.coli MC1061菌株的形质转换（transformation），制造了I45β残基及V382β残基两点饱和突变体库。 

从所述两点饱和突变库，以实施例<2-2>的方法，筛选了与M27变异酶(F58βV/Y153βT/F177βL/V382βI四点变异体)相比、对CPC基质的活性增加的变异CPC酰基转移酶（acylase）。结果，筛选出与M27变异酶相比CPC酰基转移酶（acylase）活性增加的5种五点变异体(I45βV/F58βV/Y153βT/F177βL/V382βL,I45βA/F58βV/Y153βT/F177βL/V382βI,I45βC/F58βV/Y153βT/F177βL/V382βL,I45βM/F58βV/Y153βT/F177βL/V382βL,I45βL/F58βV/Y153βT/F177βL/V382βI)。 

<实施例4> 

变异CPC酰基转移酶（acylase）的活性检测 

对所述实施例2至实施例3的变异CPC酰基转移酶（acylase）活性程度，以与实施例<1-2>相同的方法进行了检测。其结果如下【表2】所示。五种五点变异体都表现出相近的活性。其中PM2变异体的活性最高，因此作为代表，检测了PM2。野生型酶的数值看做1，变异酶的活性以相对野生型酶活性的倍数表示。 

【表2】 

变异CPC酰基转移酶（acylase）的变异残基及CPC酰基转移酶（acylase）活性程度比较 

变异酶 变异残基 对CPC基质的相对活性(倍) GA 野生型 1.0 S17 F58V 5.3 A5 F58V/F177L 9.8 B2 F58V/Y153T 14.5 R1 F58V/Y153T/F177L 16.8 M23 I45M/F58V/Y153T/F177L 18.8 M27 F58V/Y153T/F177L/V382I 20.3 PM2 I45V/F58V/Y153T/F177L/V382L 25.3

形质转换（transformation）成含对所述变异酶中的PM2变异酶进行加密的基因（序列号5）的pBC-PM2质体的E.coli MC1061菌株命名为大肠杆菌（Escherichia coli）MC1061/pBC-PM2，在2012年12约30日向韩国生命工学研究院基因银行进行了登记（登记号:KCTC12344BP)。 

产业利用可行性 

本发明的变异CPC酰基转移酶（acylase）与CPC酰基转移酶（acylase）相比，对CPC基质的活性提高5倍至26倍，只通过1个阶段以CPC直接制造7-ACA，其产业上的利用可行性很高。