参与采后柿果实脱涩的两个转录因子及应用

摘要

本发明提供参与采后柿果实脱涩的两个转录因子（DkERF19和DkERF22），通过：利用DkERF19和DkERF22全长序列依据柿果实的RNA-Seq数据库信息，应用cDNA末端快速扩增技术基因克隆，再作基因相对表达量分析，通过实时定量PCR结果显示，在可使采后柿果实脱涩的二氧化碳处理过程中，两个转录因子的表达量显著升高，进一步调作控靶基因活性分析：经双荧光素酶分析结果显示，可分别增强柿果实脱涩靶基因DkPDC2和DkPDC3启动子活性，进而参与采后柿果实的脱涩。本发明的两个转录因子可在调控采后柿果实的脱涩中应用。

说明书

技术领域

本发明属于植物分子生物技术和基因工程领域，涉及参与采后柿果实脱涩的两个新型转录因子（DkERF19和DkERF22）及其应用。

背景技术

柿原产中国，其味道鲜美，对人类健康良好，是东亚地区（中国，日本，韩国等）最受欢迎的水果之一，柿果独特之处在于其果实在发育期间能累积大量单宁（PAs），单宁是高分子物质，其中可溶性单宁是柿果实涩味的主要呈现者。

柿子根据其脱涩类型可分为甜柿和涩柿两种。甜柿果实发育早期丧失合成单宁的能力，在树上能自然脱涩，成熟采收时可直接食用；然而涩柿果实因积累大量单宁，采后必需经脱涩处理方可食用。涩柿果实脱涩方法很多，例如树上乙醇蒸气包裹果实法，高浓度的二氧化碳或氮气处理，温水浸泡或者交替冻融等，其中研究和生产中应用最广泛的是高浓度的二氧化碳处理。高浓度二氧化碳处理中柿果实无氧呼吸产生的乙醛在其脱涩过程中起着重要的作用，其中乙醇脱氢酶（ADH）和丙酮酸脱羧酶（PDC）是柿果实内乙醛合成的关键酶，成员DkADH1、DkPDC2和DkPDC3作为关键的靶基因参与了柿果实的脱涩。

近几年来，无氧呼吸的研究已深入到转录调控水平。转录因子是一类可通过识别结构基因启动子中特异的顺式作用元件而调节结构基因转录的调控因子。在模式植物拟南芥的基因组中，有5%的基因编码1500多个转录因子，它们参与植株各种生物代谢的调节过程，亦是植株适应各种生物或非生物胁迫所必需的调控因子，在生命活动中起着不可替代的作用。因此，不同转录因子基因功能的验证已成为目前研究的热点，是各种生理机制解析研究必需做的功课。

作为一类重要的转录因子，乙烯响应因子（Ethylene Response Factor，ERF）家族第7亚族成员在植物低氧胁迫的无氧呼吸过程中起关键作用。模式植物拟南芥中发现ERF家族成员HRE1和RAP2.2通过调控ADH和PDC参与低氧胁迫。对柿果实的研究发现，多个ERF成员可参与涩柿果实的采后脱涩进程，如柿果实中乙烯信号转导途径中DkERF1，DkERF4，DkERF5和DkERF6等4个ERF成员可能参与了柿果实采后脱涩进程；DkERF9和DkERF10能够分别调控无氧呼吸相关基因DkADH1和DkPDC2基因的启动子进而完成柿果实的脱涩。

发明内容

本发明的目的是提供参与采后柿果实脱涩的两个转录因子，所述两个转录因子是DkERF19和DkERF22，其核苷酸序列如SEQ：NO. 14、SEQ：NO. 15所示。

本发明的另一个目的是提供所述两个转录因子在调控采后柿果脱涩中的应用。

DkERF19和DkERF22参与采后柿果实脱涩的具体步骤如下： 

1、基因克隆

依据柿果实的RNA-Seq数据库信息，筛选出两个可能参与采后柿果实脱涩的乙烯响应因子Unigene46180和Unigene16466，应用序列为SEQ：NO. 1和SEQ：NO. 2及SEQ：NO. 3和SEQ：NO. 4的引物，利用3'cDNA末端快速扩增（3'RACE）技术分别获得 DkERF19（序列为SEQ：NO. 5）和DkERF22（序列为SEQ：NO. 6）的3'UTR序列，进而应用序列为SEQ：NO. 7和SEQ：NO. 8的引物，利用5'cDNA末端快速扩增（5'RACE）技术分别获得DkERF19（序列为SEQ：NO. 9）的5'UTR序列，根据3'和5'UTR拼接得到的序列分别为SEQ：NO. 10和SEQ：NO. 11及SEQ：NO. 12和SEQ：NO. 13的引物，该引物设计包含起始密码子和终止密码子，分别扩增得到两个转录因子DkERF19（序列为SEQ：NO. 14）和DkERF22（序列为SEQ：NO. 15）的全长序列。

2、基因相对表达量分析： 

依据DkERF19（SEQ：NO. 5）和DkERF22（SEQ：NO. 6）的3'UTR序列分别设计实时定量PCR（QPCR）特异引物SEQ：NO. 16和SEQ：NO. 17及SEQ：NO. 18和SEQ：NO. 19，PCR产物包含终止密码子，长度分别为109 bp和162 bp，引物特异性经熔点曲线分析、凝胶电泳分析和QPCR产物再测序验证。分别提取经二氧化碳（CO₂）脱涩处理和未做任何处理的采后柿果实RNA，逆转录合成cDNA。参照Ssofast EvaGreen Supermix kit（Bio-Rad，美国）说明书，应用CFX96仪器（Bio-Rad，美国）分析样品中基因相对表达量。

3、调控靶基因活性分析： 

将存放于-80℃的甘油菌（转录因子与启动子）划线接种于含25 μg/ml庆大霉素、5 μg/ml四环素和50 μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，28℃培养36-48 h，选取少量菌落涂布到新的相同LB固体培养基上，28℃培养12-24 h。刮取生长良好的菌落，用渗透液（10 mM MES, 10 mM MgCl₂, 150 mM 乙酰丁香酮, pH 5.6）悬浮，调其OD₆₀₀为0.75左右。含转录因子与结构基因启动子的菌株按10：1体积混合，然后用无菌注射器将渗透液注入6周大小的本氏烟草叶片中，3天后应用Dual-Luciferase Reporter Assay System（Promega，USA）和Modulus Luminometer（Promega，USA）检测叶片中两种荧光素酶（LUC和REN）的比值，据此分析转录因子与目标基因启动子之间互作关系。

其中步骤（1）中：RACE程序中第一轮PCR程序为94℃，5min，5个循环的94℃ 10 s和72℃ 2m30 s，5个循环的94℃ 10 s，70℃ 30s和72℃ 2m30 s，30个循环的94℃ 10 s，67℃ 30s和72℃ 2m30 s，72℃ 10m, 4℃ hold。第二轮PCR程序为94℃，5min，30个循环的94℃ 10 s，65℃ 30s和72℃ 2m30 s，72℃ 10m, 4℃ hold。

步骤（2）中：应用Bio-Rad的CFX96仪器完成。采用20 μl体系：其中10 μl 2 ×Ssofast EvaGreen Supermix (Bio-Rad，美国)，1.0 μl上游引物（10 μM），1.0 μl下游引物（10 μM），2.0 μl稀释的cDNA和6.0 μl H₂O。PCR反应程序为：94℃，10 min；45个循环的94℃ 10 s和60℃ 30 s。

步骤（3）中：构建表达载体选用的Fast stat high fidelity PCR system 酶，PCR体系为 Buffer（with Mgcl₂ 3 μl, dNTP (2.5 μm) 2.4 μl, Primer  各1 μl, cDNA 0.6 μl, 酶0.3 μl, 水21.3μl）。

步骤（3）中：将存放于-80℃的甘油菌（转录因子与启动子）划线接种于含25μg/ml庆大霉素、5μg/ml四环素和50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，28℃培养36-48h，选取少量菌落涂布到新的相同LB固体培养基上，28℃培养12-24 h。刮取生长良好的菌落，用渗透液（10 mM MES, 10 mM MgCl₂, 150 mM 乙酰丁香酮, pH 5.6）悬浮，调其OD₆₀₀为0.75左右。含转录因子与结构基因启动子的菌株按10：1体积混合，然后用无菌注射器将渗透液注入6周大小的本氏烟草叶片中，3天后应用Dual-Luciferase Reporter Assay System（Promega，USA）和Modulus Luminometer（Promega，USA）检测叶片中两种荧光素酶（LUC和REN）的比值，据此分析转录因子与目标基因启动子之间互作关系。

本发明依据柿果实的RNA-Seq数据库信息，应用cDNA末端快速扩增（RACE）技术克隆获得两个ERF转录因子DkERF19和DkERF22。与已发现的参与柿果实脱涩的ERF成员相比，DkERF19和DkERF22分别属于第九和第十亚族，在可使采后柿果实脱涩的二氧化碳（CO₂）处理过程中，DkERF19和DkERF22的表达量显著升高，而且DkERF19和DkERF22可分别增强柿果实脱涩靶基因DkPDC2和DkPDC3启动子活性，进而参与采后柿果实的脱涩。综合上述功能特征，DkERF19和DkERF22是两个全新的、可调控采后柿果实脱涩进程的ERF转录因子。且该转录因子转入涩柿果实后预期能使涩柿果实涩味移除，不用经过脱涩处理方可直接食用。

本发明在上述柿果实研究的基础上，进一步鉴定出两个全新的ERF转录因子，即DkERF19和DkERF22，分别属于ERF家族第九和第十亚族。DkERF19和DkERF22具有如下特征：在柿果实脱涩过程中，DkERF19和DkERF22的表达量显著上调；DkERF19和DkERF22可显著增强柿果实脱涩靶基因DkPDC2和DkPDC3启动子的活性，进而参与柿果实的脱涩。

附图说明

图1是柿子果实中DkERF19和DkERF22在二氧化碳脱涩处理中的基因表达模式。

图2是转录因子DkERF19和DkERF22对DkPDC2和DkPDC3启动子的调控作用。

具体实施例

下面结合附图和实施例对本发明做进一步阐述，但实施例不限制本发明的保护范围。在下述实施例中常规的基因操作方法参照《分子克隆实验指南》（第三版）。以不具有此功能的基因DkERF7，以及DkERF19和DkERF22为例，对DkERF19和DkERF22参与采后柿果实脱涩进程进行具体阐述。

实施例1：两个转录因子的获得

1．DkERF19和DkERF22基因克隆

依据柿果实的RNA-Seq数据库信息，筛选出两个可能参与采后柿果实脱涩的乙烯响应因子Unigene46180和Unigene16466，应用序列为SEQ：NO. 1和SEQ：NO. 2及SEQ：NO. 3和SEQ：NO. 4的引物，利用3'cDNA末端快速扩增（3'RACE）技术分别获得 DkERF19（序列为SEQ：NO. 5）和DkERF22（序列为SEQ：NO. 6）的3'UTR序列，进而应用序列为SEQ：NO. 7和SEQ：NO. 8的引物，利用5'cDNA末端快速扩增（5'RACE）技术分别获得DkERF19（序列为SEQ：NO. 9）的5'UTR序列，根据3'和5'UTR拼接得到的序列分别为SEQ：NO. 10和SEQ：NO. 11及SEQ：NO. 12和SEQ：NO. 13的引物，该引物设计包含起始密码子和终止密码子，分别扩增得到两个转录因子DkERF19（序列为SEQ：NO. 14）和DkERF22（序列为SEQ：NO. 15）的全长序列。

2．实时定量荧光PCR分析DkERF19和DkERF22在二氧化碳处理及未处理柿果实中的表达模式；

依据DkERF19（SEQ：NO. 5）和DkERF22（SEQ：NO. 6）的3'UTR序列分别设计实时定量PCR（QPCR）特异引物SEQ：NO. 19和SEQ：NO. 20及SEQ：NO. 21和SEQ：NO. 22，PCR产物包含终止密码子，长度分别为109bp和162bp，引物特异性经熔点曲线分析、凝胶电泳分析和QPCR产物再测序验证。分别提取经二氧化碳（CO₂）脱涩处理和未做任何处理的采后柿果实RNA，逆转录合成cDNA。参照Ssofast EvaGreen Supermix kit（Bio-Rad，美国）说明书，应用CFX96仪器（Bio-Rad，美国）分析样品中基因相对表达量。实时定量PCR分析表明和对照相对比，高浓度二氧化碳能不同程度的诱导DkERF19和DkERF22基因表达（附图1）。

3. 双荧光素酶系统

将存放于-80℃的甘油菌（转录因子与启动子）划线接种于含25 μg/ml庆大霉素、5 μg/ml四环素和50 μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，28℃培养36-48h，选取少量菌落涂布到新的相同LB固体培养基上，28℃培养12-24h。刮取生长良好的菌落，用渗透液（10 mM MES, 10 mM MgCl₂, 150 mM 乙酰丁香酮, pH 5.6）悬浮，调其OD₆₀₀为0.75左右。含转录因子与结构基因启动子的菌株按10：1体积混合，然后用无菌注射器将渗透液注入6周大小的本氏烟草叶片中，3天后应用Dual-Luciferase Reporter Assay System（Promega，USA）和Modulus Luminometer（Promega，USA）检测叶片中两种荧光素酶（LUC和REN）的比值，据此分析转录因子与目标基因启动子之间互作关系。双荧光素酶系统分析发现DkERF19和DkERF22能分别调控脱涩目标基因DkPDC2和DkPDC3启动子（附图2）。

实施例2：描述两个转录因子的应用的具体实施例

果树作为多年生木本植物，转基因的工作开展较难，因此，我们预期这两个转录因子转入涩柿果实中后，能够使得涩柿果实的涩味移除，不用脱涩即可直接食用。

本发明利用RACE，实时定量PCR以及烟草双荧光素酶系统技术分离得到两个新型转录因子DkERF19和DkERF22。这两个基因在柿果实脱涩过程中表达量显著上调，且DkERF19和DkERF22可显著增强柿果实脱涩靶基因DkPDC2和DkPDC3启动子的活性，进而参与柿果实的脱涩。且该转录因子转入涩柿果实后预期能使涩柿果实涩味移除，不用经过脱涩处理方可直接食用。

<110> 浙江大学

<120> 参与采后柿果实脱涩的两个转录因子及应用

<160> 19

 

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<211> 23

<212> 碱基序列

<213> 人工序列

<400> 1

GGAGCTTCGTCGGAGAGCAATAA　

 

<210> 2  

<211> 25

<212> 碱基序列

<213>人工合成

<400> 2

AGCTTCGTCGGAGAGCAATAATTCG　

 

<210> 3

<211> 25

<212> 碱基序列

<213> 人工合成

<400> 3

 ACGAAAGCACAAGCGAAACCCTTAC

 

<210> 4

<211> 25

<212> 碱基序列

<213> 人工合成

<400> 4

TTATAACGACGAGCTCCAGCAAAGC

 

<210> 5

<211> 747

<212>DNA序列

<213>柿子（Diospyros kaki）

<400> 5

AGCTTCGTCGGAGAGCAATAATTCGTTCACCGGAGGAATGAATGGGGGCGGCAACAAAGAAGAGGAGGTGAACTCCAGGCCGAACGGAGAAGAAGAAGAATTCGAGCCGGGGAAGAAGAAGGAGAAGAAGGAATCGTACAGGGGAGTCCGGCGGAGGCCGTGGGGGAAGTTCGCGGCGGAGATAAGGGACTCGACGAGGAACGGCATGCGGGTGTGGCTGGGGACCTTCGACAGCGCGGAGGAGGCGGCGATGGCGTACGACCAGGCGGCGTTGGCTATGCGGGGGACGAGGGCGGTGCTCAATTTTCCGGCGGAGAGGGTGGTGGAGTCGCTGAGGGGGATGGAGTGCGGGTGCGAGGAAGGTGCGTCCCCGGTGGTGGCTCTTAAGAAGAGGCACTCCATGGGGAAGCGGCCAGCCGGCAAACGGAGCAGAGTGGAGGAGGTGAAGCCGGAATTTGTGATGGTTTTGGAGGATTTGGGGGCTGATTACTTGGAGGAGCTTTTGTCTTCTTCCCAGACTCAAAGTATCTGATGATGATGAACTCCTTATCTTCTTCTTCCTTTCCAGTTCCATTAATTTTGCTTCCTTCTCTTATGTCCCTGTCTTTCCCATTTTGTTTCTTCTTCCCACTTGCTAGTGATCTGAGGCCATTCATGGCCCTCATCTCTGTAAATTAACCTCAAAATTGTGAATTAGAGGACCCCCCCGCTGTTACTACTGAAAAAAaaAaAaaaaaaaAaAAaaaA

 

<210> 6

<211> 792

<212> DNA序列

<213>柿子（Diospyros kaki）

<400>6     

TTATAACGACGAGCTCCAGCAAAGCCGCCGGACCTTCTGCATCGACAACAATGGCAAGAAGGTGAACAAAGACAAAACGGTAACCGAAATTGGGACGGCCAGTGAGCAGCTCTTCGAGAAGAACGTGACGCCGAGCGACGTTGGAAAACTGAACCGGCTCGTGATCCCGAAGCAATACGCGGAAAGGCACTTTCCGCTGCAGATTGGAGGCAACTCGAAGGGCTTGCTGTTGAATTTCAAGGACGTGGCCGGAAAAGTTTGGCGATTCCGGTACTCGTACTGGAACAGTAGCCAGAGCTATGTTCTGACCAAAGGCTGGAGCCGATTTGTGAAGGAGAAGAATTTGAAGGCCGGAGACGTCGTCAGCTTCCACCGGTCCACCGGCGCCGAGAAGCAGCTGTACATAGCTTGCAAGCCTAGAGCGGAGTCGGCCGTGGCAAGGTTTTCGATTCCGGCCAGCCAAGTTCAGGCGCCCGTGCAGATTCTGAGACTATTTGGAGTGGACATATTTAAGGTTCCGGCAGTGAGCTGTGTTGTTGACGGTAAGAGAAGTAGAGAGATGGAGTTGTTGGCATTGGAGTGCAGTAAGAAGCCAAGAATCATTGGAGCTTTGTAACATTTTCTCCTTCTTCTTCTT(C)CTTCTCTATCGGCTCCAGTTTTTCGTTTTGGCCTTCTGTGAAAGTTGACTTGTATAGTATGTTACAGAGACTGTCTAATATATAGTTCCAAACACAAACAAATTATACCATATATAATGCTAAAGCTGTTGATTATCGCAAAAAAAAAAAAA

 

<210> 7

<211> 26

<212> 碱基序列

<213> 人工合成

<400> 7

      TCCGCCAGAACGCCGAACAGCAGCAT

 

<210> 8

<211> 26

<212> 碱基序列

<213> 人工合成

<400> 8

CCTCTTCTTTGTTGCCGCCCCCATTC

 

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<211> 223

<212> DNA序列

<213>柿子（Diospyros kaki）

<400> 9

AGACTCCAGAGCCTGCAATTTTGATTTCGGGGATTTTAATAAGAACAAGAAGTGAAAGGAGAAACAAACTCCATGGATTCTTTCTGGATCCACGGTTCACTGCCGTTTGACGTCAACGACTCCGAGGAGATGCTGCTGTTCGGCGTTCTGGCGGAGGGAGCTTCGTCGGAGAGCAATAATTCGTTCACCGGAGGAATGAATGGGGGCGGCAACAAAGAAGAGG

 

<210> 10

<211> 23

<212> 碱基序列

<213> 人工合成

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TGAAAGGAGAAACAAACTCCATG

 

<210> 11

<211> 22

<212> 碱基序列

<213> DNA序列

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TAAGGAGTTCATCATCATCAGA

 

<210> 12

<211> 21

<212> 碱基序列

<213> DNA序列

<400> 12

ATGGACGGTATTTACGTGAACG

 

<210> 13

<211> 23

<212> 碱基序列

<213> 人工合成

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AGAAGGAGAAAATGTTACAAAGC

 

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<212> DNA序列

<213>柿子（Diospyros kaki）

<400> 14

ATGGATTCTTTCTGGATCCACGGTTCACTGCCGTTTGACGTCAACGACTCCGAGGAGATGCTGCTGTTCGGCGTTCTGGCGGAGGGAGCTTCGTCGGAGAGCAATAATTCGTTCACCGGAGGAATGAATGGGGGCGGCAACAAAGAAGAGGAGGTGAACTCCAGGCCGAACGGAGAAGAAGAAGAATTCGAGCCGGGGAAGAAGAAGGAGAAGAAGGAATCGTACAGGGGAGTCCGGCGGAGGCCGTGGGGGAAGTTCGCGGCGGAGATAAGGGACTCGACGAGGAACGGCATGCGGGTGTGGCTGGGGACCTTCGACAGCGCGGAGGAGGCGGCGATGGCGTACGACCAGGCGGCGTTGGCTATGCGGGGGACGAGGGCGGTGCTCAATTTTCCGGCGGAGAGGGTGGTGGAGTCGCTGAGGGGGATGGAGTGCGGGTGCGAGGAAGGTGCGTCCCCGGTGGTGGCTCTTAAGAAGAGGCACTCCATGGGGAAGCGGCCAGCCGGCAAACGGAGCAGAGTGGAGGAGGTGAAGCCGGAATTTGTGATGGTTTTGGAGGATTTGGGGGCTGATTACTTGGAGGAGCTTTTGTCTTCTTCCCAGACTCAAAGTATCTGA

 

<210> 15

<211> 1020

<212> DNA序列

<213>柿子（Diospyros kaki）

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ATGGACGGTATTTACGTGAACGAAAGCACAAGCGAAACCCTTACAATTGCAGCGGCGTCGCCGGCCACGAAGTCGCCGGAGAGCCTTGTAGACTCCGACGGCGGTGGCGAGGTCGAGTCCCGGGGGAAGCTGCCGTCGTCGAGGTTCAAAGGCGTGGTTCCGCAGCCGAACGGCCGGTGGGGGGCCCAGATCTACGAGAAGCACCAGCGCGTCTGGCTCGGAACTTTCAACGAAGAGGAAGAAGCCGCCCGGGCGTACGACGTGGCAGCCCAGCGCTTCCGCGGCCGGGACGCCGTCACCAACCTCAGGCTGCTAGCGGCGGAGGGCGACGCCGACGAGGCGGAAGCCGCTTTTTTGAGTTCCCACTCAAAGGCCGAGATCGTCGACATGCTCCGGAAACACACTTATAACGACGAGCTCCAGCAAAGCCGCCGGACCTTCTGCATCGACAACAATGGCAAGAAGGTGAACAAAGACAAAACGGTAACCGAAATTGGGACGGCCAGTGAGCAGCTCTTCGAGAAGAACGTGACGCCGAGCGACGTTGGAAAACTGAACCGGCTCGTGATCCCGAAGCAATACGCGGAAAGGCACTTTCCGCTGCAGATTGGAGGCAACTCGAAGGGCTTGCTGTTGAATTTCAAGGACGTGGCCGGAAAAGTTTGGCGATTCCGGTACTCGTACTGGAACAGTAGCCAGAGCTATGTTCTGACCAAAGGCTGGAGCCGATTTGTGAAGGAGAAGAATTTGAAGGCCGGAGACGTCGTCAGCTTCCACCGGTCCACCGGCGCCGAGAAGCAGCTGTACATAGCTTGCAAGCCTAGAGCGGAGTCGGCCGTGGCAAGGTTTTCGATTCCGGCCAGCCAAGTTCAGGCGCCCGTGCAGATTCTGAGACTATTTGGAGTGGACATATTTAAGGTTCCGGCAGTGAGCTGTGTTGTTGACGGTAAGAGAAGTAGAGAGATGGAGTTGTTGGCATTGGAGTGCAGTAAGAAGCCAAGAATCATTGGAGCTTTGTAA

 

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<212> 碱基序列

<213> 人工合成

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CCCAGACTCAAAGTATCTGATGA

 

<210> 17

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<212>碱基序列

<213>人工合成

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AAAGACAGGGACATAAGAGAAGG

 

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<212>碱基序列

<213>人工合成

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GCAGTAAGAAGCCAAGAATCAT

 

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<211> 1020

<212>碱基序列

<213>人工合成

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GAAAAACTGGAGCCGATAGAG