MYB/ERF级联效应和WRKY/ERF复合体参与柿果实采后脱涩

摘要

柿（Diospyros kaki）一般分为涩柿和甜柿，主栽品种多为涩柿，采后须经人工脱涩后才能食用。本文以4个涩柿品种（‘磨盘柿’、‘镜面柿’、‘刀根早生’、‘恭城水柿’）为材料，通过采后AHCA处理（95％CO2+1％O2，常称为高CO2处理）脱涩，利用RNA-seq数据分析和DkPDC2（关键靶标基因之一）启动子筛库实验，鉴别了介入柿果实采后脱涩的转录因子，并解析它们的作用机制，进一步丰富柿果实采后脱涩的转录调控机制。主要结果如下:
　　1.基于转录组，发现了参与柿果实采后脱涩的DkMYB/DkERF转录级联效应。研究发现AHCA处理能够诱导柿果实乙醇乙醛的积累，进而导致可溶性单宁含量的降低，实现柿果实脱涩。通过RNA-seq筛选并通过实时定量PCR验证得到柿果实采后脱涩过程中9个受AHCA处理诱导表达的转录因子，进一步通过双荧光素酶体系和酵母单杂交以及点突变技术，发现DkMYB10可以直接结合DkERF9启动子并诱导其活性，DkERF21和DkERF22可以间接激活DkERF10启动子活性，DkERF18、DkERF9和DkMYB6可以直接结合DkERF19启动子并激活其活性，果实圆片瞬时表达发现，与对照相比，DkMYB6、DkMYB10、DkERF18和DkERF19可以显著降低柿果实圆片中可溶性单宁含量并诱导下游靶标基因（目标DkERF转录因子）的表达，表明这些转录因子通过TF-TF的级联效应参与了柿果实采后脱涩进程。
　　2.基于酵母单杂筛库，发现了参与柿果实采后脱涩的DkWRKY/DkERF转录因子复合体。在RNA-seq数据分析基础上，进一步通过DkPDC2启动子筛库得到了3个新型的ERF-IX亚家族的转录调控因子DkERF23/24/25，以及2个具有调控效应的WRKY转录因子DkWRKY1/7，且AHCA处理均能诱导其表达。进一步通过烟草双荧光素酶体系、酵母双杂交和BiFC体系验证DkERF24与DkWRKY1对DkPDC2启动子调控存在协同增效效应，且两者之间存在蛋白-蛋白互作关系。同样的实验现象在拟南芥同源基因中同样存在（AtERF1和AtWRKY53）。
　　综上所述，本论文发现了受AHCA处理诱导的转录因子间（主要为MYB和ERF）的通过TF-TF的信号级联传递效应参与柿果实的采后脱涩调控;也发现了参与柿果实采后脱涩的转录因子复合体(WRKY与ERF)及其协同调控现象。这些结果在前期转录调控的基础上，进一步揭示了柿果实采后脱涩的新型调控机制，也进一步丰富了植物响应高CO2/低氧胁迫的分子机理。

目录

声明

致谢

摘要

缩略语表

1 绪论

1．1 柿果实分类

1．2 单宁

1．2．1 单宁的分类与组成

1．2．2 柿单宁的功能与应用

1．2．3 植物单宁的代谢

1．2．4 柿单宁代谢及转录调控

1．3 柿果实脱涩

1．3．1 柿果实采后脱涩处理

1．3．2 柿果实采后脱涩机理

1．3．3 柿果实采后脱涩的转录调控机制

1．4 研究目标和内容

2 高二氧化碳／低氧响应转录因子参与柿果实采后脱涩

2．1 材料与方法

2．1．1 植物材料与处理

2．1．2 单宁印迹

2．1．3 可溶性单宁含量测定

2．1．4 乙醇乙醛含量测定

2．1．5 RNA的提取和cDNA的合成

2．1．6 RACE和全长序列克隆

2．1．7 基因表达分析

2．1．8 烟草双荧光素酶体系(调控效应分析)

2．1．9 酵母单杂交(转录因子-启动子互作)

2．1．10 启动子点突交

2．1．11 柿果实圆片瞬时过量表达分析(基因功能验证)

2．1．12 统计分析

2．2 结果与分析

2．2．2 AHCA和AHNA处理对不同转录因子的诱导表达分析

2．2．3 AHCA响应转录因子对DkADH1和DkPDC2启动子的调控效应

2．2．4 AHCA响应转录因子对DkERF9／10／19启动子的调控效应

2．2．5 TFs与脱涩相关基因启动子结合能力分析

2．2．6 AHCA响应转录因子在柿果实圆片中瞬时过量表达分析

2．3 讨论

3 DkERF24和DkWRKY1协同调控柿果实采后脱涩

3．1 材料与方法

3．1．1 植物材料与处理

3．1．2 RNA提取和cDNA合成

3．1．3 酵母单杂交文库构建

3．1．4 DkPDC2启动子酵母单杂文库筛选

3．1．5 RACE和全长序列克隆

3．1．6 酵母单杂交分析(单一验证)

3．1．7 烟草双荧光素酶体系分析(调控效应分析)

3．1．8 基因表达分析

3．1．9 亚细胞定位

3．1．10 酵母双杂交(蛋白互作)

3．1．11 双分子荧光互补(蛋白互作)

3．1．12 拟南芥基因获得

3．1．13 统计分析

3．2 结果与分析

3．2．2 DkERF23／24／25和DkWRKY1／5／6／7对DkPDC2启动子的调控效应分析

3．2．3 AHCA处理对DkERF23／24／25和DkWRKYI／5／6／7的诱导表达分析

3．2．4 DkERF23／24／25和DkWRKY1／5／6／7亚细胞定位分析

3．2．6 酵母双杂分析DkERF24和DkWRKY1蛋白互作关系

3．2．7 双分子荧光互补验证DkERF24与DkWRKY1蛋白互作

3．2．8 拟南芥中同源基因对DkPDC2启动子的调控效应和结合能力分析

3．2．9 AtERF1与AtWRKY53组合对DkPDC2启动子的调控效应

3．2．10 双分子荧光互补验证AtERF1与AtWRKY53蛋白互作

3．3 讨论

4 小结与展望

4．1 小结

4．2 展望

参考文献

附图

作者简历及在学期间所取得的科研成果