鉴别肝素中牛基因来源的荧光PCR检测试剂及制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种鉴别肝素中牛基因来源的荧光PCR检测试剂及制备方法和应用，通过对牛基因的测序和比对，提供了用于检测肝素粗成品中牛成分来源的检测方法、实时荧光定量PCR引物和探针，对牛成分检测的扩增目标片段长度为92bp，本发明还提供了对牛基因进行定量检测的试剂盒。本发明的检测方法及检测试剂盒具有检测准确、灵敏度高、特异性强等优点，具有良好的标本检测能力。

说明书

技术领域

本发明涉及一种能鉴别肝素中牛基因来源的生物检测试剂，以及这种试剂的 制备方法和应用。

背景技术

肝素是一种抗凝剂，是由二种多糖交替连接而成的多聚体，在体内外都有抗 凝血作用。临床上主要用于血栓栓塞性疾病、心肌梗死、心血管手术、心脏导管 检查、体外循环、血液透析等。随着药理学及临床医学的进展，肝素的应用不断 扩大。

2010年我国肝素及其盐的出口量创历史新高，已跃居成为我国第一大西药 重点出口商品。2010年，我国肝素及其盐共出口到51个国家和地区，出口集中 度很高，前五大出口市场为法国、美国、德国、奥地利和意大利，所占出口比重 累计高达86.32%。肝素原料药可直接被用于制成标准肝素制剂，或进一步加工 制成低分子肝素原料药再制成低分子肝素制剂。标准肝素制剂和低分子肝素制剂 可直接应用于临床治疗。肝素类产品主要包括肝素粗品、肝素原料药、标准肝素 制剂、低分子肝素原料药以及低分子肝素制剂。

由于肝素类药物主要是运用于心脑血管疾病和血液透析治疗，其中在血液透 析重症治疗中是唯一有效的特效药物，其使用者集中于老龄和肥胖人群，主要消 费市场分布集中在欧洲、美国和日本等发达国家。国际市场对肝素原料药的需求 十分强劲，主要是由于其下游产品肝素类药物市场迅速扩容，并保持高速增长趋 势。预计到2015年，全球肝素类药品的市场规模将达到79亿美元，这意味着全 球医药市场对肝素的需求仍将强劲增长。但是2008年的“肝素钠事件”发生后 全球肝素类药物企业高度关注肝素钠原料药的质量，对通过FDA和CEP认证的 肝素钠原料药需求量大幅增加，而那些不具备这项质量认证的企业今后将无法立 足国际市场。因此，对于肝素钠的质量检测成为了一个热点问题，新版药典中对 于肝素钠的来源检测做出了明确规定，原因如下：

肝素首先从肝脏发现而得名，它也存在于肺、血管壁、肠粘膜等组织中，是 动物体内一种天然抗凝血物质。天然存在于肥大细胞，现在主要从牛肺或猪小肠 粘膜提取。但是由于牛等反刍动物可能携带致病性朊蛋白，从而患传染性海绵状 脑病（俗称羊瘙痒病和疯牛病）。人类可能被携带病毒的动物传染而患新型克雅 氏症。由于牛海绵状脑病以及其他动物病毒疾病的存在，猪来源的唯一性就成为 了确保肝素安全性的一条关键要求。因此，为确保肝素供应链的安全，各国在肝 素进口方面明确要求肝素原料药不允许来自于牛，同时加大了对中国出口肝素产 品的质量、来源等方面的质量要求和抽检力度。故开发一种高效的检测肝素来源 的试剂及方法显得尤为必要。

目前，粗品肝素中有害杂质的检测方法主要有核磁共振、高效液相色谱等方 法。随着分子生物学技术的迅猛发展，PCR技术得到了快速发展。由于肝素在 制备的过程中需要经过多次提取与纯化，当中的DNA会受到影响而降解为许多 小片段，如果检测目的片段太大，可能在检测中无法发现阳性片段。而受电泳检 测有效性的限制，一般PCR难以采纳小片段目的产物。中国专利申请号 200810123709.5由黄亚红、侯亚义等人公开了一种通过巢式PCR的方法鉴定肝 素中动物基因的来源。但一般的PCR方法需要对PCR产物进行凝胶电泳完成整 个检测，而且通过电泳条带进行检测灵敏度偏低，当样品中基因浓度差异不大时， 条带亮度很难反应出差异，进而影响对肝素中牛基因有无的判断。而且凝胶电泳 检测会延长整个检测时间，拖延检测进度。因此，这种方法存在着检测灵敏度低、 操作复杂等问题。中国专利申请号200910094768.9公开的鉴别反刍动物源性成 分的荧光PCR检测试剂及制备方法和应用的发明专利中，涉及了一种能同时鉴 别包含牛、山羊及绵羊三种反刍动物品种的生物检测试剂，以及这种试剂的制备 方法和应用。但此体系并不适用于肝素中牛基因的检测，主要原因可以归纳为以 下三点：1）经多人的研究结果表明，肝素多糖对于PCR扩增酶有抑制作用，不 能直接用于real-time PCR实验，必须经过一定的处理才可行；2）此专利中方 法较为复杂，多重PCR不利于肝素中牛基因的检测；3）此外这种方法的反应体 系为50μl，对试剂的消耗较大，大大提高了检测成本，不利于实现企业规模化检 测。

发明内容

本发明提供了一种能鉴别检测肝素粗制样品的来源组成（牛基因）的荧光定 量PCR检测试剂，及其制备方法和应用。本发明利用TaqMan荧光定量PCR 方法克服了普通PCR的不足之处，是检测肝素原料药中的反刍动物基因的最佳 方法，具有灵敏度高、线性范围广、分析时间短、操作简便、重复性好、结果直 观等特点。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种鉴别肝素中牛基因来源的生物检测试剂，包括一对引物和一条TaqMan 探针，所述一对引物分别是SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列， 所述TaqMan探针是SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

进一步的，所述TaqMan探针SEQ ID NO.3的5’端连接有荧光报告基团，3’ 端连接有淬灭集团。

进一步的，所述5’端连接的荧光报告集团为6-羧基荧光素（FAM），所述3’ 端连接的淬灭集团为6-羧基四甲基诺丹明（TAMRA）。上述的FAM全称为 6-carboxy-fluorescein，是标记在探针5’端的6-羧基荧光素；TAMRA的全称为 Carboxytetramethylrhodamine，是标记在探针3端的6-羧基四甲基诺丹明。

本发明的另一目的是通过以下技术方案实现的：

一种鉴别肝素中牛基因来源的生物检测试剂的制备方法，所述制备方法包括 以下步骤：

1）选择牛线粒体基因中特异和保守的Bov-A2基因的保守序列片段为靶目 标，其基因片段的扩增目标核苷酸序列为SEQ ID NO.4；

2）根据牛特异和保守的线粒体基因保守序列的特点，应用Primer Express 3.0软件和DNAStar中的PrimerSelect软件，设计合成待测引物和探针；

3）引物和探针的合成使用全自动DNA合成仪进行OligoDNA的合成；

4）探针合成同时进行两端标记，探针5’端标记的荧光报告基团是FAM（6- 羧基荧光素），3’端标记的基团是TAMRA（6-羧基四甲基诺丹明）；

5）将设计合成的引物和探针进行最佳配对筛选实验后，得到上述的引物和 探针。

所述的鉴别肝素中牛基因来源的生物检测试剂的应用，所述一种鉴别肝素中 牛基因来源的生物检测试剂可用于制备荧光定量PCR标准化试剂盒。

本发明的另一目的是通过以下技术方案实现的：

一种鉴别肝素中牛基因来源的生物检测方法，所述检测方法包括以下步骤：

A.待检测肝素的前处理

（1）将粉末状肝素样品0.03g加至灭菌离心管中，向管中加入1ml无酶水， 振荡混匀，离心机3500rpm，30s，100℃水浴5min，放冷至室温；

（2）枪头反复吸取搅拌至样品溶解，从溶解的样品溶液中取10μl至一新的 灭菌离心管中，再加入990μl无酶水，振荡混匀，用1ml注射器使溶液通过45μm 微孔滤膜过滤；

（3）从上一步得到的溶液中取45μl溶液，加入0.7μl试剂肝素酶，振荡混 匀，28℃水浴18h，得到待测肝素样品；

B.荧光定量PCR

（1）PCR反应体系

荧光定量PCR采用25μl体积反应液，反应扩增体系与扩增条件按下述反应 参数进行：

实时荧光定量PCR反应总体积为25μl，向反应管中加入下列组分，反应体系为：

MIX 12.5μl

上游引物F 0.5μl 下游引物R 0.5μl 探针 6.5μl 待测肝素样品 5μl

所述上游引物F和下游引物R分别是SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的 核苷酸序列，所述探针是SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；

（2）PCR扩增条件

实时荧光定量PCR的扩增条件为：

C.结果分析和判定

（1）结果分析条件设定

根据扩增曲线的荧光素种类，FAM代表牛源性成分，直接读取检测结果； 基线和阈值设定原则根据仪器进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲 线的最高点为准；

（2）样本检测时均设立阴、阳性对照，检测中两种对照为有效扩增时，结 果判断标准如下：

Ct值大于40的样本为阴性结果：Ct值大于38或无扩增曲线，表示样品中 无牛源性成分；

Ct值小于等于35的样本为阳性结果：Ct值小于或等于35，且出现明显的 扩增曲线，表示样品中存在牛源性成分。

本发明相比现有技术的有益效果是：

1、本发明根据需求可以确定肝素粗品和原料药中含有动物基因的来源，粗 品肝素和精品肝素均适用；

2、本发明所用的TaqMan荧光定量PCR方法克服了普通PCR的不足之处， 是检测肝素原料药中的反刍动物基因的最佳方法，具有灵敏度高、线性范围广、 分析时间短、操作简便、重复性好、结果直观等特点；

3、本发明对样品中低含量的牛源性成分或经高温高压处理后造成样品中牛 源性成分DNA降解为小片段的样品进行准确检测的方法，具备高敏感性、高特 异性和高准确性；

4、本发明所述的方法经过多次试验牛基因标准曲线都达到R2≥0.99；基因 检测范围：0.001～100ng/ml；基因检测限：>0.01ng/ml；

5、本发明建立了特异、敏感、安全、准确、快速的牛源性肝素的检测方法， 在有力监管和严格杜绝牛商品的掺杂使假现象等多方面具有重要意义。

附图说明

图1为实时荧光定量PCR检测牛基因标准曲线图，其中横坐标为阳性模板 浓度的对数值，纵坐标为反应体系检测不同浓度阳性模板的Ct值，图中数字标 示的模板浓度为1：100ng/ml；2：10ng/ml；3：1ng/ml；4：0.1ng/ml；5：0.01ng/ml； 6：0.001ng/ml，R2=0.993；

图2为本发明检测粗品肝素中牛基因结果图：1表示样品中存在牛源性成分， 2表示样品中无牛源性成分；

图3为本发明检测精品肝素中牛基因结果图：1表示样品中存在牛源性成分， 2表示样品中无牛源性成分。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不 背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换， 均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手 段。

实施例1：

一种鉴别肝素中牛基因来源的生物检测试剂，包括一对引物和一条TaqMan 探针，所述一对引物分别是SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列， 所述TaqMan探针是SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

进一步的，所述TaqMan探针SEQ ID NO.3的5’端连接有荧光报告基团，3’ 端连接有淬灭集团。

进一步的，所述5’端连接的荧光报告集团为6-羧基荧光素（FAM），所述3’ 端连接的淬灭集团为6-羧基四甲基诺丹明（TAMRA）。

一种鉴别肝素中牛基因来源的生物检测试剂的制备方法，所述制备方法包括 以下步骤：

1）选择牛线粒体基因中特异和保守的Bov-A2基因的保守序列片段为靶目 标，其基因片段的扩增目标核苷酸序列为SEQ ID NO.4；

2）根据牛特异和保守的线粒体基因保守序列的特点，应用Primer Express 3.0软件和DNAStar中的PrimerSelect软件，设计合成待测引物和探针；

3）引物和探针的合成使用全自动DNA合成仪进行OligoDNA的合成；

4）探针合成同时进行两端标记，探针5’端标记的荧光报告基团是FAM（6- 羧基荧光素），3’端标记的基团是TAMRA（6-羧基四甲基诺丹明）；

5）将设计合成的引物和探针进行最佳配对筛选实验后，得到上述的引物和 探针。

所述的鉴别肝素中牛基因来源的生物检测试剂的应用，所述一种鉴别肝素中 牛基因来源的生物检测试剂可用于制备荧光定量PCR标准化试剂盒。

一种鉴别肝素中牛基因来源的生物检测方法，所述检测方法包括以下步骤：

A.待检测肝素的前处理

（1）将粉末状肝素样品0.03g加至灭菌离心管中，向管中加入1ml无酶水， 振荡混匀，离心机3500rpm，30s，100℃水浴5min，放冷至室温；

（2）枪头反复吸取搅拌至样品溶解，从溶解的样品溶液中取10μl至一新的 灭菌离心管中，再加入990μl无酶水，振荡混匀，用1ml注射器使溶液通过45μm 微孔滤膜过滤；

（3）从上一步得到的溶液中取45μl溶液，加入0.7μl试剂肝素酶，振荡混 匀，28℃水浴18h，得到待测肝素样品；

B.荧光定量PCR

（1）PCR反应体系

荧光定量PCR采用25μl体积反应液，反应扩增体系与扩增条件按下述反应 参数进行：

实时荧光定量PCR反应总体积为25μl，向反应管中加入下列组分，反应体系为：

MIX 12.5μl 上游引物F 0.5μl 下游引物R 0.5μl 探针 6.5μl 待测肝素样品 5μl

所述上游引物F和下游引物R分别是SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的 核苷酸序列，所述探针是SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；

（2）PCR扩增条件

实时荧光定量PCR的扩增条件为：

C.结果分析和判定

（1）结果分析条件设定

根据扩增曲线的荧光素种类，FAM代表牛源性成分，直接读取检测结果； 基线和阈值设定原则根据仪器进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲 线的最高点为准；

（2）样本检测时均设立阴、阳性对照，检测中两种对照为有效扩增时，结 果判断标准如下：

Ct值大于40的样本为阴性结果：Ct值大于38或无扩增曲线，表示样品中 无牛源性成分；

Ct值小于等于35的样本为阳性结果：Ct值小于或等于35，且出现明显的 扩增曲线，表示样品中存在牛源性成分。

实施例2：

本实施例是实施例1的优选方案，是粗品肝素中牛基因的检测。

1、设计引物和探针

本实施例选择牛线粒体基因中特异和保守的Bov-A2基因的保守序列片段 为靶目标，通过收集大量GenBank中报道的牛线粒体基因序列以及其他多种 反刍动物、非反刍动物的线粒体基因序列，进行序列分析和比较，应用Primer Express3.0软件和DNAStar中的PrimerSelect软件，设计合成待测引物和 探针。将设计合成的引物和探针进行最佳配对筛选实验后，初步确定候选引物 和探针，经过大量的反应条件优选，对比试验和验证试验，并经过大量样品的 检测应用评估，确定扩增效率和特异性最好的引物和探针是基于牛线粒体基因 中特异和保守的cytb基因的保守序列片段设计的，扩增目标片段长度大小为 92bp，选定引物和探针的合成委托invitrogen公司进行，使用全自动DNA 合成仪进行OligoDNA的合成。探针合成同时进行两端标记，探针5’端标记 的荧光报告基团是FAM，3’端标记的基团是TAMRA。

2、DNA提取

将新鲜牛肉研磨粉碎，DNA提取试剂盒提取总DNA。核酸蛋白分析仪测 量所提取DNA样品的OD260/OD280的值不小于1.5，并进行电泳检测后，根 据测得的浓度将DNA样品浓度稀释到100ng/ml，-20℃保存。进行引物扩增灵 敏度分析时将DNA10倍梯度稀释（10²～10^-3ng/ml），再以稀释的DNA为模板 进行PCR扩增。

3、粗品肝素前处理

（1）粗品肝素为细小颗粒状，将肝素粗品研磨成粉末状，称量0.03g粉末 样品至灭菌离心管中，向管中加入1ml无酶水，振荡混匀，离心机3500rpm， 30s，100℃水浴5min，放冷至室温；

（2）枪头反复吸取搅拌至样品溶解，从溶解的样品溶液中取10μl至一新的 灭菌离心管中，再加入990μl无酶水，振荡混匀，用1ml注射器使溶液通过45μm 微孔滤膜过滤；

（3）从上一步中取45μl溶液，加入0.7μl试剂肝素酶，振荡混匀，28℃水 浴18h，得到待测肝素样品。

4、荧光定量PCR

（1）试剂盒组分：

无酶水 20ml

PCR试剂 1.27ml 牛DNA引物 30μl 牛DNA探针 350μl 牛DNA标准溶液 36μl

（2）PCR反应体系

荧光定量PCR采用25μl体积反应液，使用伯乐公司MyiQ2实时荧光定量 PCR仪。反应扩增体系与扩增条件按下述反应参数进行：

实时荧光定量PCR反应总体积为25μl，向反应管中加入下列组分，反应体系为：

MIX 12.5μl 上游引物F 0.5μl 下游引物R 0.5μl 探针 6.5μl 牛DNA标准溶液或待测肝素产品 5μl

利用

（3）PCR扩增条件

以优化好的反应体系摸索PCR的最佳反应条件，经过反复试验进行验证， 每次试验采用同管等量模板，每个反应条件重复试验3次，最终确定实时荧光定 量PCR的扩增条件为：

设立对照，阳性和阴性对照各设置两组。

4、荧光定量PCR稳定性和重复性实验

在评估牛源性成分实时定量荧光PCR的试验的重现性和稳定性时，每次使 用牛等比例混合的等量DNA样品，在同样反映条件下，反复进行实时定量荧光 PCR检测，设置6个平行反应管，每个试验重复12次。

5、标准曲线的绘制

将标准质粒模板的浓度稀释为1.0×10²～1.0×10^-3ng/ml共6个稀释度作为标 准模板，进行实时定量荧光PCR。以DNA浓度作为X轴，循环数Ct值为Y轴， 获得标准曲线，如图1所示。

6、结果分析和判定

（1）结果分析条件设定

根据扩增曲线的荧光素种类，FAM代表牛源性成分，直接读取检测结果。 基线和阈值设定原则根据仪器进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲 线的最高点为准。

（2）样本检测时均设立阴、阳性对照。检测中两种对照为有效扩增时，结 果判断标准如下：

Ct值大于40的样本为阴性结果：Ct值大于38或无扩增曲线，表示样品中 无牛源性成分；

Ct值小于等于35的样本为阳性结果：Ct值小于或等于35，且出现明显的 扩增曲线，表示样品中存在牛源性成分；

根据对大量样品的检测筛选，确定Ct值在35～40之间的为可疑样品，需重 新试验。

实施例3：

本实施例是实施例1的优选方案，是精品肝素中牛基因的检测。

1、设计引物和探针

本实施例选择牛线粒体基因中特异和保守的Bov-A2基因的保守序列片段为 靶目标，通过收集大量GenBank中报道的牛线粒体基因序列以及其他多种反刍 动物、非反刍动物的线粒体基因序列，进行序列分析和比较，应用Primer Express 3.0软件和DNAStar中的PrimerSelect软件，设计合成待测引物和探针。将设 计合成的引物和探针进行最佳配对筛选实验后，初步确定候选引物和探针，经过 大量的反应条件优选，对比试验和验证试验，并经过大量样品的检测应用评估， 确定扩增效率和特异性最好的引物和探针是基于牛线粒体基因中特异和保守的 cytb基因的保守序列片段设计的，扩增目标片段长度大小为92bp，选定引物和 探针的合成采用委托invitrogen公司进行，使用全自动DNA合成仪进行 OligoDNA的合成。探针合成同时进行两端标记，探针5’端标记的荧光报告基 团是FAM（6-羧基荧光素），3’端标记的基团是TAMRA（6-羧基四甲基诺丹明）；

2、DNA提取

将新鲜牛肉研磨粉碎，DNA提取试剂盒提取总DNA。核酸蛋白分析仪测 量所提取DNA样品的OD260/OD280的值不小于1.5，并进行电泳检测后，根 据测得的浓度将DNA样品浓度稀释到100ng/ml，-20℃保存。进行引物扩增灵 敏度分析时将DNA10倍梯度稀释（10²～10^-3ng/ml），再以稀释的DNA为模板 进行PCR扩增。

3、精品肝素前处理

（1）精品肝素为精细粉末状，故直接称量精品肝素样品0.03g至灭菌离心 管中，向管中加入1ml无酶水，振荡混匀，离心机3500rpm，30s，100℃水浴 5min，放冷至室温；

（2）枪头反复吸取搅拌至样品溶解，从溶解的样品溶液中取10μl至一新的 灭菌离心管中，再加入990μl无酶水，振荡混匀，用1ml注射器使溶液通过45um 微孔滤膜过滤；

（3）从上一步中取45μl溶液，加入0.7μl试剂肝素酶，振荡混匀，28℃水 浴18h。

4、荧光定量PCR

（1）试剂盒组分：

无酶水 20ml PCR试剂 1.27ml 牛DNA引物 30μl 牛DNA探针 350μl 牛DNA标准溶液 36μl

（2）PCR反应体系

荧光定量PCR采用25μl体积反应液，使用伯乐公司MyiQ2实时荧光定量 PCR仪。反应扩增体系与扩增条件按下述反应参数进行：

实时荧光定量PCR反应总体积为25μl，向反应管中加入下列组分，反应体系为：

MIX 12.5μl 上游引物F 0.5μl 下游引物R 0.5μl 探针 6.5μl 牛DNA标准溶液或待测肝素产品 5μl

（3）PCR扩增条件

以优化好的反应体系摸索PCR的最佳反应条件，经过反复试验进行验证， 每次试验采用同管等量模板，每个反应条件重复试验3次，最终确定实时荧光定 量PCR的扩增条件为：

设立对照，阳性和阴性对照各设置两组。

4、荧光定量PCR稳定性和重复性实验

在评估牛源性成分实时定量荧光PCR的试验的重现性和稳定性时，每次使 用牛等比例混合的等量DNA样品，在同样反映条件下，反复进行实时定量荧光 PCR检测，设置6个平行反应管，每个试验重复12次。

5、标准曲线的绘制

将标准质粒模板的浓度稀释为1.0×10²～1.0×10^-3ng/ml共6个稀释度作为标 准模板，进行实时定量荧光PCR。以DNA浓度作为X轴，循环数Ct值为Y轴， 获得标准曲线，如图1所示。

6、结果分析和判定

（1）结果分析条件设定

根据扩增曲线的荧光素种类，FAM代表牛源性成分，直接读取检测结果。 基线和阈值设定原则根据仪器进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲 线的最高点为准。

（2）样本检测时均设立阴、阳性对照。检测中两种对照为有效扩增时，结 果判断标准如下：

Ct值大于40的样本为阴性结果：Ct值大于38或无扩增曲线，表示样品中 无牛源性成分；

Ct值小于等于35的样本为阳性结果：Ct值小于或等于35，且出现明显的 扩增曲线，表示样品中存在牛源性成分；

根据对大量样品的检测筛选，确定Ct值在35～40之间的为可疑样品，需重 新试验。

因此，荧光定量PCR检测牛源性成分的灵敏度高、特异性强、重复性好。