一种含有双报告基因的双T-DNA载体及其构建方法和应用

摘要

本发明提供了一种含有双报告基因的双T-DNA载体及其构建方法与应用。本发明对传统的双T-DNA载体进行改进，将利用生物安全标记基因和剔除转基因植株选择标记基因这两种方法相结合，将报告基因GUS基因和选择标记基因连入同一个T-DNA区域，将GFP基因和目的基因连入另一个T-DNA区域，得到含有双报告基因的双T-DNA载体，通过后代自交分离检测两个报告基因，剔除目的基因与选择标记基因发生共整合的转基因植株，最终得到只有目的基因而无选择标记的转基因安全植株，快速筛选得到含有目的基因和生物安全标记GFP的转基因安全植株，这样大大节省了人力物力财力，有效提高了基因整合的效率以及安全转基因植株的产生。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的说，涉及一种含有双报告基因的双 T-DNA载体及其构建方法和应用。

背景技术

粮食问题是各个国家的核心问题，由于环境的恶化，耕地面积的大量 减少，人口的不断增长，我国的粮食问题面临着越来越大的挑战，解决好 粮食安全问题是保证经济高效和可持续发展的重要前提。实践表明，科学 技术的发展与突破是解决粮食问题最重要的途径之一，利用基因工程技术 改良农作物品种，提高农作物的品质和产量具有越来越重要的现实意义。

转基因技术始于上世纪八十年代，该技术从出现即得到广泛的关注与 应用，到现在植物转基因技术已成为提高作物产量、品质，农业资源利用 率，改善农业生态环境等的有效手段之一。目前，转基因植物主要包括经 济作物、粮食作物、蔬菜、花卉、药用植物、果树以及牧草等。从1996年 第一批转基因作物商业化应用以来，转基因作物的种植面积逐年增加，到 2012年其种植面积增长了100倍(ISAAA,2012)，转基因技术亦成为近代农 业史上发展利用最快的新技术之一。但是，随着该技术的迅猛发展，人们 在关注转基因植物带来巨大经济和社会效益的同时，其安全问题也引起了 人们普遍的关注。在植物转基因过程中，外源基因在植物受体细胞中的转 化频率相当低，为了快速方便的从庞大的受体细胞群中得到真正的转化细 胞，特异性的选择标记基因被广泛的应用于转基因过程中。然而，选择标 记基因的安全性却受到人们的质疑，主要表现在：目前被广泛应用的选择 标记基因主要是抗生素抗性基因和除草剂抗性基因，这些基因可能会转移 到微生物中，使得病原菌获得抗性，从而导致临床使用的抗生素失效；此 外，可能发生基因漂流，经自然杂交传递到野生杂草中，产生抗药性超级 杂草，对农业生产和生态环境带来极大的危害；最后，这些基因及其产物 可能会对动物和人类健康安全产生负面影响。因此，提高转基因植物标记 基因的安全性是现今植物转基因技术的重要目标和迫切任务。

目前，提高转基因植物中选择标记基因安全性的策略主要有：使用无 选择标记基因的转化系统；利用无争议的生物安全标记基因；剔除已获得 转基因植株的选择标记基因。使用无选择标记基因的转化系统，转基因阳 性植株筛选的工作量巨大，费时费力；利用无争议的生物安全标记基因操 作简单，是目前最为常用的方法；而剔除标记基因则可以完全避免选择标 记基因所带来的安全隐患，并有利于多基因转化。因此，利用无争议的生 物安全标记基因和剔除转基因植株选择标记基因成为当前转基因研究的主 要手段。

报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，即一种表达产物 非常容易被鉴定的基因。GUS基因(β-D-葡萄糖苷酸酶基因)是目前常用 的一种报告基因，其表达产物β-葡萄糖苷酸酶(GUS)能催化裂解一系列 的β-葡萄糖苷酸，将5-溴-4氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸脂(X-Gluc)分解为蓝 色物质，其检测方法简单、快速、灵敏、稳定，且背景活性低。另一种常 用的报告基因是绿色荧光蛋白(GFP)基因，GFP是一类存在于水母、水 螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白，在受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光，其检测方便，只需激发光源，不需任何底物或辅助因子， 且材料可活体观测，同时，GFP生色基团的形成无种属特异性，在原核真 核细胞中都能表达，其表达产物对细胞基本没有毒害作用，并且不影响细 胞的正常生长和功能。GFP基因是近年来发现的生物安全标记基因之一。

剔除转基因植株选择标记基因的方法主要有位点特异性重组、转座子 系统以及共转化系统。其中，共转化法是研究比较多，应用比较成熟的方 法，它具有操作简便，适用范围广，基因转化效率较高等优点，因而被广 泛应用于水稻、烟草、油菜、大豆、玉米等植物中。共转化法是将选择标 记基因和目的基因分别构建在2个不同的载体上，共同转化植物受体细胞， 获得转基因共整合的植株，再经过转化植株有性阶段的遗传重组，使选择 标记基因与目的基因分离，得到剔除了选择标记基因的阳性转化植株。但 是，由于不同植物转基因载体的基因共整合效率有差异，而且易整合在受 体基因组的同一位置，使其应用受到了限制。为了解决这个问题，研究者 又构建了含有两个T-DNA的超级双元载体，即选择标记基因和目的基因分 别插入到同一质粒而又相互独立的T-DNA区内，这有效提高了共整合效率， 但是在得到的共整合转化细胞中，有大部分双T-DNA整合在了基因组的同 一位点，使得在后代遗传中，双T-DNA载体上的基因不能分离，无法得到 无选择标记基因的转基因阳性植株，如何在转基因后代中简单快速剔除含 选择标记基因的共整合植株是提高共转化效率和培育无选择标记基因安全 转基因植株的关键所在。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种简单快速构建双T-DNA载体的方 法，通过简单的PCR扩增引入酶切位点后只需要一次连接转化就能得到双 T-DNA载体。利用该载体可以通过转基因阳性后代植株自交分离得到无选 择标记的转基因安全植株。

本发明的第二个目的在于提供一种含有双报告基因的双T-DNA载体及 其应用。

本发明的第三个目的在于提供构建含有双报告基因的双T-DNA载体的 方法。

首先，本发明提供了一种构建双T-DNA载体pTRIDT313的方法，包括 以下步骤：

(1)以pCMBIA1302载体为模板，以SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2与 SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示核苷酸序列为引物，分别进行PCR扩增 得到T-DNA左右边界LB和RB，LB引入酶切位点SphI和BglII，RB引入 酶切位点SacI和SphI；

(2)将左右边界LB和RB分别连到pMD19-T载体，与骨架载体 pCAMBIA1302分别进行酶切，再用T4连接酶进行三片段连接，得到含两 套T-DNA边界的双T-DNA载体pTRIDT313。

其中，步骤(1)中获得的左右边界LB和RB的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示。

进一步，本发明提供了一种含有双报告基因的双T-DNA载体，该载体 具有两个T-DNA区域，一个T-DNA区域含有报告基因GUS和选择基因， 另一个T-DNA区域含有报告基因GFP和目的基因。

本发明提供的一种含有双报告基因的双T-DNA载体中，潮霉素磷酸转 移酶基因(hpt)、氯霉素磷酸转移酶基因(cat)、新霉素磷酸转移酶基因(nptⅡ)、 除草剂抗性Bar基因。

在本发明的一个实施例中，所用的选择基因为潮霉素磷酸转移酶基因。

更进一步地，本发明提供的含有双报告基因的双T-DNA载体为 pTRIDT314。其结构图谱见图8。

本发明还提供了含有双报告基因的双T-DNA载体的构建方法，包括以 下步骤：

(1)双T-DNA载体的构建，包括：

1)以pCMBIA1302载体为模板，以SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2与SEQ  ID NO.3、SEQ ID NO.4所示核苷酸序列为引物，分别进行PCR扩增得到 T-DNA左右边界LB和RB，LB引入酶切位点SphI和BglII，RB引入酶切 位点SacI和SphI；

2)将左右边界LB和RB分别连到pMD19-T载体，与骨架载体 pCAMBIA1302分别进行酶切，再用T4连接酶进行三片段连接，得到含两 套T-DNA边界的双T-DNA载体pTRIDT313；

(2)含GUS基因的中间载体的构建，包括PCR扩增得到GUS基因， 将其连接到pMD19-T载体，通过限制性酶切位点将pTRIDT313载体潮霉 素磷酸转移酶基因替换成GUS基因，得到含GUS基因的中间载体 pTRIDT313-GUS；

(3)将中间载体pTRIDT313-GUS和连接选择标记基因的T载体经SacI 和EcoRI酶切后连接，选择标记基因插入中间载体pTRIDT313-GUS后，即 得到含有双报告基因的双T-DNA载体。

上述构建方法中，步骤(2)中PCR扩增得到GUS基因使用的引物序 列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。

其中，步骤(2)中所述限制性酶切位点为XhoI。

优选地，步骤(3)中选择标记基因为潮霉素磷酸转移酶基因。

在本发明的一个实施例中，步骤(3)中选择标记基因为包含启动子和 终止子的潮霉素磷酸转移酶基因，其以pCMBIA1302载体为模板，通过PCR 扩增获得，所用引物如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示，其中引物中 分别引入SacI和EcoRI酶切位点。

本发明提供了含有双T-DNA载体pTRIDT314的宿主细胞。

本发明提供了上述含有双报告基因的双T-DNA载体在基因转化中的应 用。

本发明提供了上述含有双报告基因的双T-DNA载体在筛选无选择标记 的转基因植物中的应用。

本发明提供了上述含有双报告基因的双T-DNA载体在检测转基因植物 中的应用。

目前，检测转基因植株的方法主要是PCR扩增和Southern杂交，PCR 扩增的优点是快速，能够大量检测，但结果往往存在假阳性，而Southern 杂交结果准确可靠，但方法复杂，成本高，效率低。本发明构建的含双报 告基因GUS和GFP的转基因载体，可通过直接检测报告基因，能快速、准 确又简单的检测转基因后代植株。

本发明改进了传统的双T-DNA载体，将利用生物安全标记基因和剔除 转基因植株选择标记基因这两种方法相结合，将报告基因GUS基因和筛选 基因抗潮霉素磷酸转移酶基因连入同一个T-DNA区域，将GFP基因和目的 基因连入另一个T-DNA区域，得到含有双报告基因的双T-DNA载体，由 于GUS和GFP基因分别存在于两个T-DNA中，同时检测两种报告基因， 就可从转基因后代植株中准确快速的筛选出目的基因与选择标记基因发生 分离的植株，从而得到只有目的基因而无选择标记的转基因安全植株，即 通过检测两个报告基因快速筛选得到含有目的基因和生物安全标记GFP的 转基因安全植株，这样大大节省了人力物力财力，有效提高了基因整合的 效率以及安全转基因植株的产生。

附图说明

图1为片段LB和RB的PCR扩增图，其中泳道1.Marker I；泳道2-5为目的 片段LB；泳道6-9为目的片段RB。

图2为片段GUS和Hygromycin的PCR扩增图，其中泳道1.Marker III；2-5. 目的片段GUS；6-9.目的片段Hygromycin。

图3为载体pTIRDT313的酶切验证图，其中泳道1.Marker III；2.酶切样 品；3.质粒pTIRDT313。

图4为中间载体pTIRDT313-GUS的酶切验证图，其中泳道1.Marker III； 2.质粒pTIRDT313-GUS；3.酶切样品。

图5为载体pTIRDT314的酶切验证图，其中泳道1.Marker D15000；2.酶 切样品；3.质粒pTIRDT314。

图6为植物表达双T-DNA载体pTIRDT313图谱。

图7为中间载体pTIRDT313-GUS图谱。

图8为植物表达双报告基因双T-DNA载体pTIRDT314图谱。

图9为转烟草T1代GUS基因检测图，其中A图为PCR检测电泳图，泳道 1.Marker II，泳道2-8为转基因再生植株，9为野生型烟草阴性对照，10为质 粒阳性对照，11为H₂O阴性对照；B图为GUS染色为阳性植株图。

图10为转烟草T1代GFP基因PCR检测图，泳道1为Marker II，泳道2-15 为实施例3获得的转基因再生植株，其中4、5、6、10、11、12、13、15检 测为阳性的植株，16为H₂O阴性对照，17为野生型烟草阴性对照，18为质 粒阳性对照。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替 换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的引物由上海立菲生物技术有限公司合 成，测序工作由上海立菲生物技术有限公司完成，pMD19-T载体购自宝生 物工程(大连)有限公司，感受态DH5α购自天根生化科技有限公司，限制性 内切酶购自NEB(北京)有限公司。其他生化试剂非特别注明外均为常规 市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明试剂配方：

X-GLUC染色液:50mmol/L磷酸钠缓冲液(pH＝7.0)；10mmol/L Na₂EDTA(pH＝8.0)；0.5mmol/L K₃[Fe(CN)₆]；0.5mmol/L K₄[Fe(CN)₆]；0.1％ Triton-X100；0.8g/L X-Gluc。

实施例1双T-DNA载体pTRIDT313的构建

步骤1：设计引物扩增T-DNA左右边界

根据已公布的pCMBIA1302载体的序列(GenBank：AF234298.1)，设 计扩增T-DNA左边界(LB)的引物，引物中包括限制性酶切位点SphI和 BglII，序列见SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2；设计扩增T-DNA右边界(RB) 的引物，引物中包括限制性酶切位点SacI和SphI，序列见SEQ ID NO.3， SEQ ID NO.4。引物由上海立菲生物技术有限公司合成，所述引物序列如下：

SEQ ID NO.1:GGTGCATGCGGACTGATGGGCTGCCTG

SEQ ID NO.2:TAAAGATCTCAGTACATTAAAAACGTC

SEQ ID NO.3:GAGCTCCACGAGGTGCCACCATGTTGGTTAAA

CTATCAGTGTTTG

SEQ ID NO.4:TTGGCATGCACATACAAATGGACG

以pCAMBIA1302为模板，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为引物进 行PCR扩增LB，即SEQ ID NO.5，目的片段约为168bp(图1)。以SEQ ID  NO.3和SEQ ID NO.4为引物进行PCR扩增RB，即SEQ ID NO6，目的片 段约为156bp(图1)。对扩增产物进行胶回收，连接pMD19-T载体，16℃ 连接过夜，然后将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，筛选阳性克隆。 测序并命名为T-LB和T-RB。

步骤2：含两对边界的双T-DNA载体pTRIDT313的构建

将经过测序验证的含有目的片段SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6的质粒 T-LB和T-RB分别在37℃下经SphI，BglII和SacI，SphI双酶切4h，然后 将酶切产物跑胶分别回收168bp和156bp的片段；同时，将骨架载体 pCMBIA1302在37℃下经SacI和BglII双酶切4h后跑胶回收10kb左右的 载体片段。两条目的片段和一条载体片段在T4连接酶的作用下22℃连接过 夜。将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，以SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3 为引物进行PCR鉴定，若LB和RB连入载体，则扩增出309bp的片段， 然后将阳性克隆摇菌提取质粒，用BglII和SacI双酶切得到一条与预期大小 一致的片段。最后进行测序验证，将测序正确的载体命名pTRIDT313(见 图6)，此即为含有两个T-DNA边界区适合农杆菌共转化的植物转基因载 体。由于RB的右端和LB的左端分别设计了相同酶切位点SphI,这样可以 同时将两个片段连入载体，减少了载体构建的步骤和时间。虽然载体也含 有SphI酶切位点，但通过此方法载体不需要进行SphI酶切，这样在载体构 建中增加了限制性酶切位点的选择空间。

实施例2含有两个报告基因双T-DNA载体的构建

步骤1：含β-葡萄糖醛酸糖苷酶基因(GUS)的中间载体构建

1)GUS基因的克隆:根据已知GUS基因序列(GenBank：AF527487.1)， 设计引物扩增GUS基因全长，且在两条引物中都引入酶切位点XhoI。所述 引物SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8序列如下，下划线部分为酶切位点序列：

SEQ ID NO.7:TGACTCGAGATGGTCCGTCCTGTAGAA

SEQ ID NO.8:CAACTCGAGTTCATTGTTTGCCTCCCT

以PAL156载体为模板，SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8为引物PCR扩 增GUS基因，即SEQ ID NO.9，目的片段约为2048+6+6bp(图3)。对扩 增产物进行胶回收、连接pMD19-T，转化鉴定阳性克隆后测序，测序正确 的质粒命名为T-GUS。

2)GUS基因的插入

将载体pTRIDT313进行XhoI单酶切4h后，用去磷酸化酶37℃去磷酸 化15min，80℃水浴20min；与同样经过XhoI酶切的质粒T-GUS跑胶，分 别回收10kb左右的载体和2000bb左右的GUS基因片段，然后在T4连接 酶作用下22℃连接过夜。以SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8为引物进行PCR 鉴定，若GUS基因连入载体，则扩增出2054bp的片段，通过XhoI酶切出 一条2000bp左右的片段(图4)。由于本发明采用的是单酶切，因而需要 通过测序确定连入GUS基因的方向，将测序方向正确的质粒命名为 pTRIDT313-GUS(图谱见图7)。

步骤2：含有两个报告基因的双T-DNA载体的构建

1)包含启动子和终止子的潮霉素磷酸转移酶基因克隆：根据已公布的 pCAMBIA1302载体序列设计扩增包含启动子、潮霉素磷酸转移酶基因和终 止子的引物，且在引物中分别引入SacI和EcoRI酶切位点，引物序列如下：

SEQ ID NO10:TACGAGCTCATGGTGGAGCACGACA

SEQ ID NO11:CTCGAATTCTAATTCGGGG GATCTG

以pCAMBIA1302为模板，以SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11为引物 PCR扩增，即SEQ ID NO.12,目的片段约为2066+6+6bp(图3)。对产物进 行胶回收，连接pMD19-T，转化鉴定，测序正确的质粒命名为T-Hygromycin。

2)潮霉素磷酸转移酶基因的插入

将中间载体pTRIDT313-GUS和T-Hygromycin经SacI和EcoRI酶切胶 回收后，在T4连接酶作用下22℃连接过夜。以SEQ ID NO.10和SEQ ID  NO.11为引物进行PCR鉴定，若潮霉素磷酸转移酶基因连入载体，则扩增 出2072bp的片段，经酶切和测序验证正确的质粒为含有两个报告基因的双 T-DNA载体，且两个T-DNA区域分别包括一个报告基因，命名pTRIDT314 (图8)。

实施例3pTRIDT314载体的遗传转化及后代植株阳性筛选

含有双报告基因的双T-DNA载体pTRIDT314载体叶盘法转化烟草

1)本发明采用热击转化法(方法参考分子克隆：实验手册)，将重组 质粒pTRIDT314导入根癌农杆菌LBA4404的感受态细胞，经筛选鉴定为 阳性的重组子命名为LBA4404-pTRIDT314。

2)采用叶盘法将重组子转化烟草，具体操作步骤如下：

a.取幼嫩健康的叶片，用蒸馏水冲洗一遍，70％乙醇洗45s，10％次 氯酸钠消毒6－8min，无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干水分。

b.挑取一个单菌落根癌农杆菌，接种到20ml含利福平和卡那霉素抗 生素的YEB培养液中，在28℃、180rpm恒温摇床上培养到OD值为 0.6-0.8。取以上培养物按1％的比例，转入新鲜的无抗菌素的YEB培 养液中，继续培养8-12小时，当OD值为0.4-0.6时即可用于转化。

c.在超净工作台上，将菌液倒入无菌小培养皿，添加终浓度为 120μm/L的乙酰丁香酮，将无菌叶片剪成0.5cm×0.5cm的小块，放入 菌液中泡6-8分钟。取出外植体在无菌滤纸上吸去附着的菌液。然后 接种在MS培养基上，28℃暗培养2天。

d.将经过共培养的外植体转移到含1.0mg/L6-BA,0.1mg/LNAA, 40mg/L潮霉素和150mg/L Timentin的MS培养基上。在光照的条件 下，25℃进行选择培养。

e.选择培养2-3周后，待不定芽长到1cm左右时，切下不定芽并转 移到含有40mg/L潮霉素和150mg/L Timentin的MS培养基上进行生 根培养。

f.两周左右长出不定根，然后移栽到土壤中。

3)转基因烟草阳性植株的检测

以上得到的具有潮霉素抗性的转基因烟草植株有三种情况，一种为只 有选择标记基因转入植株；第二种为选择标记基因和GFP基因共整合到染 色体同一位置；第三种为选择标记基因和GFP基因共整合到染色体的的不 同位置，这种是可以通过后代自交分离得到无选择标记的转基因植株。通 过GUS染色和GFP检测可以筛选到第二种和第三种情况的转基因植株。具 体方法如下：

a.GUS染色

取再生植株的叶片进行GUS染色，将准备好的叶片放入EP管中，加 入X-GLUC染色液浸没叶片，封好盖子；放入37℃培养箱温浴1-12h； 倒掉侵染液加入70％乙醇脱色2-3次，去除叶绿素至阴性对照为白色 为止，观察叶片颜色。阳性植株叶片被染成蓝色，非阳性植株叶片褪 色后为白色或淡黄色。

b.GFP检测

取再生植株的叶片或根尖制作切片；使用荧光显微镜或激光共聚焦显 微镜在488nm波长的蓝光激发下，观察GFP的表达。在荧光显微镜 或激光共聚焦显微镜下，阳性植株叶片被激发出绿色荧光，非阳性植 株叶片无荧光。

本发明通过叶盘法将质粒pTRIDT314转化烟草，得到转基因植株，取 再生植株的叶片分别进行GUS染色和GFP检测。阳性植株包括三种情况， 一种是植株叶片只能被GUS染液染成蓝色，观察不到绿色荧光；另一种是 植株叶片不能被GUS染液染成蓝色，但能观察到绿色荧光；最后一种是植 株叶片既能被GUS染液染成蓝色，又能观察到绿色荧光。

4)无选择标记基因植株的获得

采用GUS染色、GFP观察以及PCR扩增的方法，对经潮霉素筛选存 活的70株烟草再生植株进行检测，结果如下：通过PCR扩增GUS基因和 叶片GUS染色，得到17株阳性再生烟草苗(图9)；通过PCR扩增GFP 基因和荧光显微镜GFP观察，得到13株阳性再生烟草苗(图10)；其中， 能检测到GFP基因的13株再生烟草苗都能检测到GUS基因，而有5株再 生烟草苗只能检测到GUS基因。得到的这13株同时有GUS基因和GFP 基因的再生烟草苗可以通过T2-Tn代用上述方法筛选剔除含选择标记基因 的共整合植株，得到只有GFP基因而不携带选择标记基因的安全植株。如 果将目的基因连入GFP报告基因所在的T‐DNA区域，通过此方法筛选得到 只观察到绿色荧光而不能被GUS染液染成蓝色的植株为不带选择标记基因 的安全植株。此结果说明本发明所构建的双报告基因双T-DNA载体可用于 获得无标记基因的安全植株。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的 描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术 人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些 修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。