枯草芽孢杆菌腺苷琥珀酸合成酶突变基因purA及应用

摘要

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌腺苷琥珀酸合成酶突变基因purA及应用，枯草芽孢杆菌腺苷琥珀酸合成酶突变基因purA序列如SEQ ID No.1所示。本发明所构建的包含有枯草芽孢杆菌腺苷琥珀酸合成酶突变基因purA（C725T）的工程菌生物安全，遗传背景清晰、包含的突变基因purA（C725T）可以大幅提高枯草芽孢杆菌合成核黄素的能力，在摇瓶发酵条件下，提高核黄素积累水平40%以上。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术与分子生物学领域，具体地涉及到枯草芽孢杆菌腺苷琥珀酸合成酶 突变基因purA（C725T）及该基因编码的氨基酸序列及应用。

背景技术

以细菌为宿主菌的基因工程菌具有发酵周期短、原料要求简单、成熟的基因工程技术等 优点。在芽孢杆菌属中，包括枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）在内的许多菌株具有可靠的安 全性。传统菌株选育发现，枯草芽孢杆菌的突变株能够过量合成叶酸、腺苷、肌苷、鸟苷、 核黄素等一系列嘌呤途径代谢中间产物或该途径的衍生代谢产物，目前成为选育高产嘌呤类 代谢产物重要出发菌株。作为模式菌株，目前对其生理生化特性及遗传背景已经有了比较深 入的了解，相关的分子生物学方法和基因操作技术都比较成熟，也有利于通过理性代谢工程 及系统生物学手段来选育嘌呤类代谢产物高产菌种。

腺苷琥珀酸合成酶是微生物嘌呤生物合成途径中重要的酶，在枯草芽孢杆菌中，该酶催 化GTP（鸟苷三磷酸）依赖的IMP（次黄嘌呤核苷酸）和天冬氨酸转化生成中间产物腺苷 酸代琥珀酸(adenylosuccinate)，后者在腺苷酸代琥珀酸裂解酶的作用下，脱去延胡索酸， 生成AMP（腺嘌呤核苷酸）。目前是许多核苷类代谢产物高产菌株的重要基因工程操作 靶点，比如用于高产核黄素、肌苷、鸟苷、鸟嘌呤等工程菌株的遗传改造。核黄素（分 子式C₁₇H₂₀O₆N₄，IUPAC中文名：7,8-二甲基-10-（1'-D-核糖基）-异咯嗪）是人体必需的13 种维生素之一，为黄素酶类的辅酶组成部分，在生物体内主要以黄素单核苷酸（FMN）和黄 素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的形式存在。它作为黄素蛋白的辅酶参与机体组织呼吸链电子传 递及氧化还原反应，在呼吸和生物氧化中起着重要的作用。核黄素生物合成来自于嘌呤途径 的代谢产物GTP，通过核黄素操纵子表达的一系列酶催化，最终合成核黄素。

目前，对于采用枯草芽孢杆菌为宿主构建核黄素合成工程菌，尚未有枯草芽孢杆菌腺苷 琥珀酸合成酶突变基因purA（C725T）用于核黄素高产菌种的选育的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够提高枯草芽孢杆菌核黄素合成能力的枯草芽孢杆菌腺苷琥 珀酸合成酶突变基因purA。

本发明的第二个目的是提供一种枯草芽孢杆菌腺苷琥珀酸合成酶突变基因purA编码的 氨基酸序列。

本发明的第三个目的是提供一种包含有枯草芽孢杆菌腺苷琥珀酸合成酶突变基因purA 的工程菌。

本发明的第四个目的是提供包含有枯草芽孢杆菌腺苷琥珀酸合成酶突变基因purA的工 程菌的应用。

本发明的技术方案概述如下：

枯草芽孢杆菌腺苷琥珀酸合成酶突变基因purA（C725T），其特征是所述突变基因purA （C725T）序列如SEQ ID No.1所示。

枯草芽孢杆菌腺苷琥珀酸合成酶突变基因purA（C725T）编码的氨基酸序列，所述氨基 酸序列如SEQ ID No.2所示。

包含有枯草芽孢杆菌腺苷琥珀酸合成酶突变基因purA（C725T）的工程菌。

包含有枯草芽孢杆菌腺苷琥珀酸合成酶突变基因purA（C725T）的工程菌产核黄素的应 用。

本发明所构建的包含有枯草芽孢杆菌腺苷琥珀酸合成酶突变基因purA（C725T）的工程 菌生物安全，遗传背景清晰、包含的突变基因purA（C725T）可以大幅提高枯草芽孢杆菌合 成核黄素的能力，在摇瓶发酵条件下，提高核黄素积累水平40%以上。

附图说明

图1为工程菌株B.subtilis RC1和B.subtilis RC4核黄素合成水平发酵验证。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实施例是为了使本领域的技术人员能够更 好地理解本发明，但对本发明不作任何限制。

本发明所用到的原始菌株B.subtilis168来源为BGSC（Bacillus Genetic Stock Center， http://www.bgsc.org/）。本发明所用到的原始质粒pUC18购买于生工生物工程（上海）股份有 限公司（http://www.sangon.com/）。

本发明所用到的核黄素标准品从Sigma公司（http://www.sigmaaldrich.com/sigma-aldrich） 购买，所用限制性内切酶、去磷酸化酶、DNA连接酶等分子生物学试剂从Thermo公司购买 （http://www.thermoscientificbio.com/fermentas）。所用其他生化试剂从生工生物工程（上海） 股份有限公司购买（http://www.sangon.com/）。

实施例1：无抗生素标记筛选枯草芽孢杆菌系统出发菌株B.subtilis BUK和基础操作质粒 pSS的构建

本发明中所用到的枯草芽孢杆菌出发菌株B.subtilis BUK来源于B.subtilis168，基础操 作质粒pSS来源于pUC18，二者详细构建过程可参考公开发表文献1。

本发明对该基础操作质粒pSS的构建方法以及抗性基因的选择不做限定。

实施例2：工程菌株B.subtilis RC1构建过程

（1）向菌株B.subtilis BUK基因组上无痕引入基因突变ribC*（G596A）操作流程如下：

利用ribC*-F-U、ribC*-F-L和ribC*-B-U、ribC*-B-L两对引物，以B.subtilis168基因组 为模版，使用KOD-plus高保真DNA聚合酶扩增分别得到大小为894bp和928bp的上下游 同源臂ribC*-F和ribC*-B。ribC*-F的PCR片段经切胶回收后，使用Thermo Fast digest AatII 和XhoI双酶切，连接、转化质粒pSS后得到质粒pSS-ribC*-F。ribC*-B的PCR片段经切胶 回收后，使用Thermo Fast digest SalI和ScaI双酶切，连接、转化质粒pSS-ribC*-F后得到这 质粒pSS-ribC*-FB。将测序结果正确的质粒通过Spizizen转化导入枯草芽孢杆B.subtilis BUK 中，用含氯霉素LB固体培养基中筛选重组成功的阳性克隆，并用菌落PCR验证。挑出的转 化子接种于5ml LB液体培养基中，200rpm震荡培养6h（OD约为2），并在五氟尿嘧啶基本 培养基（添加终浓度为5μmol/L FMN）上挑出菌落，使用引物ribC*-F-U、ribC*-B-L进行PCR 和测序验证，得到ribC*（G596A）正确引入的阳性菌株B.subtilis RC1。

实施例3：工程菌株B.subtilis RC4构建（引入腺苷琥珀酸合成酶突变基因purA（C725T））

利用purA*-F-U、purA*-F-L和purA*-B-U、purA*-B-L两对引物，以B.subtilis168基因 组为模版，使用KOD-plus高保真DNA聚合酶扩增分别得到大小为933bp和922bp的上下 游同源臂purA*-F和purA*-B。purA*-F的PCR片段经切胶回收后，使用Thermo Fast digest NdeI 和NcoI双酶切，连接、转化质粒pSS后得到质粒pSS-purA*-F。purA*-B的PCR片段经切胶 回收后，使用Thermo Fast digest SalI和KpnI双酶切，连接、转化质粒pSS-purA*-F后得到这 质粒pSS-purA*-FB。将测序结果正确的质粒通过Spizizen转化导入枯草芽孢杆B.subtilis RC1 中，用含氯霉素LB固体培养基中筛选重组成功的阳性克隆。将正确的阳性克隆接种于5ml LB 液体培养基中，200rpm震荡培养6h，并在五氟尿嘧啶基本培养基上（添加终浓度为45μmol/L 腺嘌呤）挑出菌落，使用引物purA*-F-U、purA*-B-L进行PCR和测序验证，得到腺苷琥珀 酸合成酶突变基因purA（C725T）正确引入的菌株，命名为B.subtilis RC4，其中枯草芽孢杆 菌腺苷琥珀酸合成酶突变基因purA（C725T）序列如SEQ ID No.1所示，腺苷琥珀酸合成酶 突变基因purA（C725T）所编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

LB液体培养基配方为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，调节pH至7.5。 0.1Mpa压力下灭菌20min。LB固体培养基配方为：在LB液体培养基中加入琼脂粉（终浓 度15g/L），0.1Mpa压力下灭菌20min。五氟尿嘧啶基本培养基配方见表1：

表1五氟尿嘧啶基本培养基配方

母液 添加量 葡萄糖（40%） 2ml 1000×微量元素 100μL Trp（0.5%） 1ml 谷氨酰胺（4%） 5ml 10×Spizizen基本盐 10ml VB₁（0.1%） 100μL 5FU（20mM） 50μL 琼脂 1.5g 加水至 100ml

表1中成分的百分比浓度均为质量体积百分比。

表1中的10×Spizizen基本盐：2g/L（NH₄）₂SO₄，18.3g/L K₂HPO₄，6g/L KH₂PO₄， 12g/L C₆H₅Na₃O₇.2H₂O，pH7.2，0.1Mpa压力下灭菌20min。

表1中的1000×微量元素：27g/L FeCl₃·6H₂O，2g/L ZnCl₂·4H₂O，2g/L CaCl₂·2H₂O，2g/L Na₂MoO₄·2H₂O，1.9g/L CuSO₄·5H₂O，0.5g/L H₃BO₃pH7.2，0.1Mpa压力下灭菌20min。

实施例4：工程菌株B.subtilis RC4和B.subtilis RC1生长能力对比

1)采用LB培养基，41℃，240rpm条件下，将菌体培养至对数生长期中期。

2)取适量的菌体培养液，6000rpm，4℃离心1min。弃上清后，采用0.9%NaCl溶液洗 涤菌体，重复一次。

3)按初始OD=0.02接种量转洗涤后的菌液至50ml基本盐M培养基，41℃，240rpm进 行菌体培养30h。

其中基本盐M培养基的成分为：20g/L葡萄糖，2g/L(NH₄)₂SO₄，13.1g/L KH₂PO₄，6g/L K₂HPO₄，1.2g/L NaC₆H₅O₇·2H₂O，0.05g/L MgSO₄·7H₂O，25mg/L色氨酸。

从菌体培养结果来看，B.subtilis RC4在基本盐M培养基中培养30h时依然检测不到菌 体密度增加，说明该菌株不能在基本盐M培养基中生长，而B.subtilis RC1生长良好。说明 purA（C725T）基因突变导致菌体产生了营养缺陷型，推测B.subtilis RC4中腺苷琥珀酸合成 酶失活。

实施例5：工程菌株B.subtilis RC4和B.subtilis RC1核黄素合成能力对比

1)分别划线菌株B.subtilis RC4和B.subtilis RC1于LB平板，37℃过夜培养。

2)挑单菌落接种5mL LB液体培养基的摇管，培养至对数生长期中期。

3)按初始OD=0.02接种量转接培养菌液至50ml YE培养基。摇床转速240rpm，41℃ 培养60h。

其中，YE培养基配方：100g/L葡萄糖，20g/L酵母粉，0.5g/L MgSO₄，0.5g/L KH₂PO₄， 0.5g/L K₂HPO₄，调节pH至7.0，0.1Mpa压力下灭菌20min。

发酵结果见图1。从发酵结果可以看出，相对于出发菌株B.subtilis RC1，腺苷琥珀酸合 成酶突变基因purA（C725T）提高了核黄素产量高达40%以上。说明该突变基因具有较好的 应用前景。

本发明的菌株的构建，其步骤的前后顺序不限定，本领域的技术人员按本发明公开的内 容达到本发明的目的均属于本发明的保护范围。

本发明中的菌株代号如B.subtilis RC1和B.subtilis RC4等是为了方便描述，但不应理解 为对本发明的限定。上述方法构建的包含有枯草芽孢杆菌腺苷琥珀酸合成酶突变基因purA （C725T）的工程菌的用途，包括但是不局限于核黄素。

参考文献1：Shi,T.,Wang,G.,Wang,Z.,Fu,J.,Chen,T.,Zhao,X.,2013.Establishment of a  Markerless Mutation Delivery System in Bacillus subtilis Stimulated by a Double-Strand Break in  the Chromosome.PLoS one.8,e81370.

表3菌株构建所用引物序列