扁竹根抗糖尿病多肽的制备方法

摘要

本发明提供扁竹根抗糖尿病多肽的制备方法，首先采用磷酸缓冲液浸提,硫酸铵沉淀,离心透析,再使用凝胶色谱葡聚糖凝胶SephadexG-25柱分离纯化,得到扁竹根抗糖尿病多肽。本发明得到的扁竹根抗糖尿病多肽主要为短肽,分子量范围在265—700Da，具有较强的α‐葡萄糖苷酶抑制活性,IC

说明书

技术领域

本发明涉及一种扁竹根抗糖尿病多肽的制备方法,属于植物深加工及生物技术领域。

背景技术

糖尿病是目前仅次于肿瘤和心脑血管病的常见病，其中约95％以上是２型糖尿病。在２型糖尿病早期治疗中，控制餐后血糖水平是治疗的关键；而葡萄糖苷酶抑制剂具有延缓单糖吸收、降低餐后高血糖和防止多糖症之功效，因此研究开发葡萄糖苷酶抑制剂已成为近年来糖尿病药物研究的热点。已用于临床的α-葡萄糖苷酶抑制剂有拜糖平、伏格列波糖和米格列醇等, 并均取得了较好的疗效。

生物活性肽是一类由两个或两个以上的氨基酸连接而成，具有生理作用的肽类化合物，具有多种生理活性，如免疫调节、抗高血压、降低胆固醇、抗癌、抗氧化作用、促生长等。与蛋白质相比，生物活性肽具有结构简单、稳定性高、无免疫反应的优点，是药物研发的重点。近年来，国内外学者不断地从天然动植物以及人体中分离出具降血糖功能的多肽类物质，为糖尿病的预防和治疗开辟了一条新路。

扁竹根 ( Iris japonica Thunb.) 为鸢尾属草本植物蝴蝶花的根状茎, 主要分布于华东、华南、西南及河北、陕西、甘肃等地，又名土知母、鸭儿参,是一种观赏植物, 也是我国传统的中药材，传统医学上用于消食杀虫，清热通便，治食腹胀等. 目前关于扁竹根活性成分的研究不多，且主要集中在抗癌活性研究方面，对其降糖活性的研究甚少,特别是生物活性多肽的研究尚未有报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种扁竹根抗糖尿病多肽的制备方法。

为实现本发明目的，采用如下技术方案：

一种扁竹根抗糖尿病多肽的制备方法，包括如下步骤：

（1）称取100~500 g扁竹根粉末，用液氮研磨后加入1~4 L的缓冲液浸泡24 h，再用纱布过滤得到扁竹根的提取液，离心除去沉淀；在上清液中加入硫酸铵至质量百分比浓度为10%~80%，过夜，再离心，除去上清液，得到蛋白浸膏；用缓冲液溶解蛋白浸膏后装入截留分子量范围3000-10000的透析袋，透析三天，然后冻干得到蛋白质粉末；

（2）称取步骤（1）得到的蛋白粉末0.1~2g, 配成质量百分比浓度为0.3%~3%的扁竹根蛋白液，加入蛋白酶水解, 8~15 h后在95 ℃的水浴中灭酶10 min，冷却到室温后在8000 r/min下离心10 min, 取上清液得到酶解产物；

 (3) 将步骤（2）得到的酶解产物再进行凝胶色谱葡聚糖凝胶Sephadex G-25柱层析分离纯化，得到三个洗脱峰，收集具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的第二个蛋白峰冻干保存，得到扁竹根抗糖尿病多肽。

上述方法中，步骤（1）所述缓冲液为磷酸缓冲液, pH=6~9；离心温度为4~8℃，转速为3000~10000 r/min, 离心时间5~50 min。

上述方法中，步骤（2）所述蛋白酶为碱性蛋白酶Alcalase 2.4L，水解温度35~65℃， pH=5~10水解时间4~15 h。

上述方法中，步骤（3）所述柱层析条件为：柱体积为150 mL，上样量为1~5mL，流动相为水，流速为0.1~0.8 mL/min，每6 min收集一管，检测波长为220nm。

上述方法中，所述扁竹根抗糖尿病多肽具有α-葡萄糖苷酶抑制活性。

与现有技术相比，本发明具有如下技术效果和优点：

本发明得到的扁竹根抗糖尿病多肽主要为短肽, 分子量范围在265—700Da，具有较强的α‐葡萄糖苷酶抑制活性, IC50达37.3±3.2μg/ml。因而本发明得到的扁竹根抗糖尿病多肽具有作为原料开发降糖药物的潜力，可应用于医药和其它产品。

 

附图说明

图1为实施例1中扁竹根酶解产物的凝胶色谱葡聚糖凝胶SephadexG-25柱层析洗脱曲线。

图2为实施例1所制备的扁竹根抗糖尿病多肽的MALDI-TOF-MS分析图。

图3为实施例1所制备的扁竹根抗糖尿病多肽的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

 

具体实施方式

以下结合附图和实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护范围不限于此。

实施例1 

扁竹根抗糖尿病多肽的制备方法，步骤如下：

（1）准确称取300 g扁竹根粉末，用液氮研磨后加入3 L的磷酸缓冲液浸泡24 h，再用纱布过滤掉残渣得到扁竹根的提取液,离心除去沉淀。在上清液中加入硫酸铵至质量百分比浓度为40%，过夜，再离心,除去上清液，得到蛋白浸膏。用缓冲液溶解蛋白浸膏（其中缓冲液的量只需要满足能完全溶解蛋白浸膏即可）后装入截留分子量范围6000的透析袋，透析三天，然后冻干得到蛋白质粉末。

（2）称取步骤（1）得到的蛋白粉末0.5g, 配成浓度为1%的扁竹根蛋白液，加入碱性蛋白酶（购买于 Sigma公司(P4860)）Alcalase 2.4L水解, 水解温度40℃, pH=6, 4h以后在95 ℃的水浴中灭酶10 min，冷却到室温后在8000 r/min下离心10 min, 取上清液得到酶解产物。

(3) 将步骤（2）得到的酶解产物再进行凝胶色谱葡聚糖凝胶Sephadex G-25柱层析分离纯化，所述柱层析中柱体积为150mL，上样量为4 mL，流动相为水，流速为0.6 mL/min，每6 min收集一管，检测波长为220nm. 图1中, 酶解产物在洗脱后得到三个洗脱峰, 收集具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的第二个蛋白峰冻干保存, 得到扁竹根抗糖尿病多肽。

使用基质辅助激光解析飞行时间质谱测定扁竹根抗糖尿病多肽的分子量，如图2所示，分子量主要集中在265—700Da，主要为短肽。对扁竹根抗糖尿病多肽进行α-葡萄糖苷酶抑制活性检测，每个浓度测定3次，抑制效果如图3所示, 扁竹根抗糖尿病多肽具有较强的α‐葡萄糖苷酶抑制活性, IC₅₀达37.3±3.2μg/ml。

实施例2

扁竹根抗糖尿病多肽的制备方法，步骤如下：

（1）准确称取400 g扁竹根粉末，用液氮研磨后加入1 L的磷酸缓冲液浸泡24 h，再用纱布过滤掉残渣得到扁竹根的提取液,离心除去沉淀。在上清液中加入硫酸铵至质量百分比浓度为60%，过夜，再离心,除去上清液，得到蛋白浸膏。用缓冲液溶解蛋白浸膏（其中缓冲液的量只需要满足能完全溶解蛋白浸膏即可）后装入截留分子量范围8000的透析袋，透析三天，然后冻干得到蛋白质粉末。

（2）称取步骤（1）得到的蛋白粉末1.5g, 配成浓度为2%的扁竹根蛋白液，加入碱性蛋白酶（购买于Sigma公司(P4860)）Alcalase 2.4L水解, 水解温度50℃, pH=8, 8h以后在95 ℃的水浴中灭酶10 min，冷却到室温后在8000 r/min下离心10 min, 取上清液得到酶解产物。

(3) 将步骤（2）得到的酶解产物再进行凝胶色谱葡聚糖凝胶Sephadex G-25柱层析分离纯化，所述柱层析中柱体积为150mL，上样量为2 mL，流动相为水，流速为0.8 mL/min，每6 min收集一管，检测波长为220nm，得到三个洗脱峰, 收集具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的第二个蛋白峰冻干保存, 得到扁竹根抗糖尿病多肽。检测方法与结果同实施例1。

实施例3

扁竹根抗糖尿病多肽的制备方法，步骤如下：

（1）称取200 g扁竹根粉末，用液氮研磨后加入5 L的缓冲液浸泡24 h，再用纱布过滤掉残渣得到扁竹根的提取液,离心除去沉淀。在上清液中加入硫酸铵至质量百分比浓度为50%，过夜，再离心,除去上清液，得到蛋白浸膏。用缓冲液溶解蛋白浸膏（其中缓冲液的量只需要满足能完全溶解蛋白浸膏即可）后装入截留分子量范围4000的透析袋，透析三天，然后冻干得到蛋白质粉末。

（2）称取步骤（1）得到的蛋白粉末2g, 配成浓度为0.8%的扁竹根蛋白液，加入碱性蛋白酶（购买于Sigma公司(P4860)）Alcalase 2.4L水解, 水解温度60℃, pH=5, 12h以后在95 ℃的水浴中灭酶10 min，冷却到室温后在8000 r/min下离心10 min, 取上清液得到酶解产物。

(3) 将步骤（2）得到的酶解产物再进行凝胶色谱葡聚糖凝胶Sephadex G-25柱层析分离纯化，所述柱层析中柱体积为150mL，上样量为5 mL，流动相为水，流速为0.6 mL/min，每6 min收集一管，检测波长为220nm,得到三个洗脱峰, 收集具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的第二个蛋白峰冻干保存, 得到扁竹根抗糖尿病多肽。检测方法与结果同实施例1。

实施例4

扁竹根抗糖尿病多肽的制备方法，步骤如下：

（1）准确称取200 g扁竹根粉末，用液氮研磨后加入3 L的缓冲液浸泡24 h，再用纱布过滤掉残渣得到扁竹根的提取液,离心除去沉淀。在上清液中加入硫酸铵至质量百分比浓度为70%，过夜，再离心,除去上清液，得到蛋白浸膏。用缓冲液溶解蛋白浸膏（其中缓冲液的量只需要满足能完全溶解蛋白浸膏即可）后装入截留分子量范围5000的透析袋，透析三天，然后冻干得到蛋白质粉末。

（2）称取步骤（1）得到的蛋白粉末0.8g, 配成浓度为0.5%的扁竹根蛋白液，加入碱性蛋白酶（购买于 Sigma公司(P4860)）Alcalase 2.4L水解, 水解温度45℃, pH=10, 6h以后在95 ℃的水浴中灭酶10 min，冷却到室温后在8000 r/min下离心10 min, 取上清液得到酶解产物。

(3) 将步骤（2）得到的酶解产物再进行凝胶色谱葡聚糖凝胶Sephadex G-25柱层析分离纯化，所述柱层析中柱体积为150mL，上样量为3 mL，流动相为水，流速为0.7 mL/min，每6 min收集一管，检测波长为220nm,得到三个洗脱峰, 收集具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的第二个蛋白峰冻干保存, 得到扁竹根抗糖尿病多肽。检测方法与结果同实施例1。