小分子多肽TAT-p53DM及其在制备治疗或预防缺血性卒中药物中的应用

摘要

本发明公开了小分子多肽TAT-p53DM及其在制备治疗或预防缺血性卒中药物中的应用，利用人工合成TAT蛋白转导结构域和p53DM的融合蛋白多肽TAT-p53DM，TAT可以携带p53DM蛋白多肽经血液穿过血脑屏障被神经元摄取，将其运用到离体和在体的缺血性卒中模型上，可有效发挥其阻断神经元死亡相关蛋白激酶1死亡结构域（DAPK1DD）与肿瘤抑制蛋白p53DNA结合基序（p53DM）结合的生物学作用，抑制DAPK1下游引起神经元凋亡与坏死的信号，降低缺血性卒中后脑损伤，为进一步开发临床治疗缺血性卒中的药物提供了分子靶点。

说明书

技术领域

本发明涉及医学疾病治疗药物研发领域，具体涉及一种小分子多肽TAT-p53DM，还涉 及小分子多肽TAT-p53DM在制备治疗或预防缺血性卒中药物中的应用。

技术背景

脑卒中以高发病率、高死亡率、高致残率等特点，被公认为目前严重危害人类健康和生 命安全的常见难治性疾病，缺血性脑卒中是由于脑血流中断（缺血）引起的血栓形成或栓塞 的一类严重神经疾病，患者会突然出现瘫痪，语言功能损伤或视力丧失甚至死亡。在美国， 通常每40秒就有一例脑卒中发生，每4分钟就有一例死亡，据2007年的数据统计，脑卒中 的死亡率高达41.6%。伴随着人口老龄化，这个绝对数量还在逐渐上升。在幸存者当中，7 0%的人工作能力受到损害，30%生活不能自理。因此，给家庭和社会都造成了严重的经济 和精神负担。在美国，2010年脑卒中的估计花费在73.7亿美元，而到2050年，会达到1.5 2万亿美元。在俄罗斯和中国，每十万人口死亡率比美国高5-10倍。然而，针对脑缺血损 害所采取的治疗手段非常有限，目前唯一有效的治疗是运用组织纤溶酶原激活物(tPA)的溶 栓疗法。出于安全考虑和溶栓治疗的时间窗较窄（<4.5小时），多数患者只能得到对症支持 治疗。迄今为止，实验室针对脑缺血治疗所开发的小分子化合物已超过1000种，并开展了 约200项临床试验，但所有这些方法运用到临床都面临失败，因此，针对缺血性卒中脑损伤， 探讨新的治疗方法对抗脑损伤减少神经细胞死亡极其重要。

在局部缺血的情况下，缺氧缺糖会耗尽细胞能量，从而导致广泛的有害细胞反应。这些 反应包括离子稳态的失衡，活性氧（ROS）和活性氮(RNS)的产生，以及线粒体功能障碍。 结果，细胞通过坏死和凋亡两种途径走向死亡。已知坏死和凋亡是通过多种信号通路如Ca²⁺超载和ROS/RNS产生所激活，并和谷氨酸递质（NMDA）受体的过度兴奋有关。然而， 谷氨酸受体也参与正常基因表达，神经可塑性和神经元存活等重要生理功能，因此直接拮抗 谷氨酸受体并不是治疗缺血性卒中的理想靶点。

TAT称细胞穿膜肽(cell penetrating peptides)，是近年来发现的一种新型的高效运输载 体。TAT能穿透细胞膜、细胞核膜，携带肽、蛋白质和DNA分子等通过受体转运进入胞质 和胞核发挥生物效应。为提高靶细胞在体内外的基因转移效率和蛋白质表达提供了一个高效、 简便的方法。目前的体内及体外试验显示HIV-TAT，可以穿过包括神经元细胞在内的所有组 织细胞，且未观察到明显的毒副作用。TAT可以将与之相连的多肽或全长蛋白质在数分钟内 转导进入细胞，而且在体内可以通过血液循环运输至脑组织，跨越血脑屏障进入神经元或胶 质细胞内，被带入细胞的多肽或蛋白质则保留了它们各自原有的生物活性，从而发挥其生物 学作用。

基于申请人最近的研究与TAT技术，申请人合成了一个由p53DM的氨基酸271-282序列 （270RVCACPGRDRRT281）组成的膜渗透性小分子多肽TAT-p53DM，通过运用到离体和在 体的缺血性卒中模型上，有效发挥其阻断神经元DAPK1DD与p53DM结合的生物学作用，抑 制DAPK1下游引起神经元凋亡与坏死的信号，降低缺血性卒中后脑损伤，为进一步开发临 床治疗缺血性卒中的药物提供了分子靶点。

发明内容

本发明目的在于提供了一种小分子多肽TAT-p53DM，其序列为SEQ ID NO.1所示。本 发明将TAT穿膜肽(Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg,YGRKKRRQRRR)与p5 3蛋白的DNA结合基序（p53DM）的一段氨基酸序列（氨基酸270-281，Arg-Val-Cys-Ala-Cy  s-Pro-Gly-Arg-Asp-Arg-Arg-Thr,RVCACPGRDRRT）连接，得到具有生物活性的TAT-p53D  M小分子多肽，利用TAT的穿膜功能将p53DM多肽输送进入血液穿过血脑屏障，并被大脑神 经细胞摄取从而发挥其生物学功能。

本发明的目的还在于提供了小分子多肽TAT-p53DM对应的核苷酸序列，具体为SEQ  ID NO.2所示（tatggccgcaaaaaacgccgccagcgccgccgc-cgcgtgtgcgcgtgcccgggccgcgatcgccgcacc）， 但不局限于该序列，所有编码TAT-p53DM多肽的核苷酸序列都为本发明的保护范围。

本发明的另一个目的在于提供了一种小分子多肽TAT-p53DM在制备治疗或预防缺血 性卒中药物中的应用，将其与神经元细胞共同孵育或是静脉注射，发现其可有效降低缺血性 卒中后神经元死亡(坏死与凋亡)，并明显改善缺血后神经系统症状与行为学的效应。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：

本发明的思路如下：

申请人发现，缺血性卒中后，死亡相关蛋白激酶1（Death Associated Protein Kinase1, DAPK1）的死亡功能域（Death Domain,DD）和肿瘤抑制蛋白p53的DNA结合基序（D  NA binding Motif,DM）相互作用，并介导下游神经元坏死与凋亡。阻断DAPK1DD与p5 3DM的相互作用，能有效降低缺血性卒中后神经元死亡(坏死与凋亡)。针对这一发现，申请 人将TAT穿膜肽(Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg,YGRKKRRQRRR)与p53 蛋白DNA结合基序（p53DM）的一段氨基酸序列（氨基酸270-281，Arg-Val-Cys-Ala-Cys- Pro-Gly-Arg-Asp-Arg-Arg-Thr,RVCACPGRDRRT）连接，获得具有生物活性的TAT-p53DM 多肽，通过对离体培养的神经元进行孵育，TAT-p53DM多肽直接被神经元摄取；也可通过 在体静脉注射方式，使TAT-p53DM多肽进入血液穿过血脑屏障并被大脑神经细胞摄取发挥 其生物学功能。

一种小分子多肽TAT-p53DM，其序列如下：

Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Arg-Val-Cys-Ala-Cys-Pro-Gly-Arg-Asp-A  rg-Arg-Thr（YGRKKRRQRRR-RVCACPGRDRRT）。

TAT-p53DM的对照为TAT-scramble-p53DM（TAT-s-p53DM），其序列为：

Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Cys-Cys-Pro-Gly-Glu-Cys-Val-Arg-Thr-Ar  g-Arg-Arg(YGRKKRRQRRR-CCPGECVRTRRR)。

TAT-p53DM多肽及其对照TAT-s-p53DM为商业化公司合成。

小分子多肽TAT-p53DM在制备治疗或预防缺血性卒中药物的应用，其应用过程如下：

（1）TAT-p53DM在缺血性卒中细胞模型的应用

氧糖剥夺（Oxygen Glucose Deprivation,OGD）被广泛认为是缺血性中风的体外细胞 模型。我们对体外培养10天的原代神经细胞进行OGD处理60分钟和90分钟，在60分钟 OGD处理的情况下，PI标记出46%细胞坏死，TUNEL标记出21%的细胞凋亡。当培养物 经过90分钟OGD处理后，PI标记出89%细胞，18%细胞对TUNEL出现阳性反应，可见 大部分细胞在OGD处理下死亡。用5μM的TAT-p53DM对培养的原代神经元进行孵育处 理，OGD处理后的原代培养神经元，被PI和TUNEL标记的细胞数目显著减少，说明TAT -p53DM处理可以在细胞水平降低缺血后神经元死亡。

（2）TAT-p53DM在缺血性卒中动物模型的应用

大脑中动脉栓塞（Middle Cerebral Artery Occlusion,MCAO）是公认的脑缺血动物模 型，通过向小鼠颈动脉中插入线拴堵塞大脑中动脉能引起大脑中动脉支配的皮层纹状体缺血， 拔出线拴，则引起血流再灌注，从而引起缺血再灌注损伤，以模拟临床脑梗塞或脑栓塞的症 状。通过TTC染色反映缺血梗死体积，TUNEL及FJ染色反映缺血后神经元的死亡，转棒 实验Rotarod反映动物协调平衡能力，神经系统功能评分（Neurological Score,N.S.）反映 缺血后神经系统症状，水迷宫实验反映动物运动与学习记忆能力。对动物缺血再灌注后3 小时和6小时的小鼠股静脉注射1mg/ml的TAT-p53DM溶液，动物缺血再灌注第7天处死， 取出脑组织，TTC染色显示给予TAT-p53DM的小鼠脑缺血梗死体积显著低于对照组TAT-s- p53DM或生理盐水Vehicle组。TUNEL及FJ染色显示，给予TAT-p53DM的小鼠缺血后神 经细胞死亡数量显著低于对照组TAT-s-p53DM或生理盐水Vehicle组。此外，TAT-p53DM 注射的小鼠转棒行为学与水迷宫行为学结果均较TAT-s-p53DM或Vehicle组得到显著改善。 进一步证明，TAT-p53DM对缺血性卒中模型具有确切的治疗作用。

与现有技术相比，本发明具有以下特点：

（1）本发明所涉及的小分子多肽TAT-p53DM合成纯度高，完全可溶，适合静脉注射， 无毒副作用，便于转化生产；

（2）本发明利用人工合成TAT蛋白转导结构域和p53DM的融合蛋白多肽，意在采用静 脉注射的方式达到改善缺血性卒中后神经系统症状，减少缺血性卒中神经细胞死亡和脑损伤 的目的。本发明公开的人工合成的TAT-p53DM重组蛋白多肽，TAT可以携带p53DM蛋白多 肽经血液穿过血脑屏障被神经元摄取，可以转化应用于神经系统疾病如缺血性卒中，使其具 有实际操作的可行性。

附图说明

图1为一种小分子多肽TAT-p53DM的人工合成色谱图。

图2为TAT-p53DM阻断神经元DAPK1DD与p53DM结合的结果示意图。

图3为离体细胞水平TAT-p53DM对缺血性卒中治疗作用的流程图。

图4为TAT-p53DM减少OGD处理后神经元坏死及凋亡的结果统计图。

图5为在体动物水平TAT-p53DM对缺血性卒中治疗作用的实施方案图。

图6为TAT-p53DM减少缺血性卒中后缺血梗死体积与神经元死亡的结果统计图。

图7为TAT-p53DM改善缺血性卒中后运动功能及神经系统症状的结果统计图。

图8为TAT-p53DM改善缺血性卒中后学习与记忆功能的结果统计图。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步说明。在实施例中涉及的所有细胞培养， 凋亡与坏死染色，缺血动物模型，静脉注射以及组织学与行为学的所有操作方法为本领域技 术人员所熟知。本发明中未详细阐述的请参见文献（①Tu W,Xu X,Peng L,Zhong X,Zh  ang W,Soundarapandian MM,Balel C,Wang M,Jia N,Zhang W,Lew F,Chan SL,Che  n Y,Lu Y(2010)DAPK1interaction with NMDA receptor NR2B subunits mediates brain  damage in stroke.Cell140:222-234；②Yang Y,Shu X,Liu D,Shang Y,Wu Y,Pei L,X  u X,Tian Q,Zhang J,Qian K,Wang YX,Petralia RS,Tu W,Zhu LQ,Wang JZ,Lu Y (2012)EPAC null muTATion impairs learning and social interactions via aberrant regulati  on of miR-124and Zif268translation.Neuron73:774-788.）的材料与方法部分说明。

实施例1：

TAT-p53DM的人工合成

TAT-p53DM的序列为SEQ ID NO.1所示，由武汉百意欣生物技术有限公司人工合成，合成 报告如下所示，色谱如图1所示。

TAT-p53DM人工合成HPLC报告

表1

合成后TAT-p53DM多肽纯度为99%，每只5mg，为白色粉末状，避光保存于-20度，完全 可溶于水。使用前，用无菌生理盐水按指定浓度进行稀释配制。用于细胞或用于动物前，置 于37度温箱预热。

TAT-p53DM的对照为TAT-scramble-p53DM（TAT-s-p53DM），其序列为：Tyr-Gly-Ar  g-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Cys-Cys-Pro-Gly-Glu-Cys-Val-Arg-Thr-Arg-Arg-Arg(YG RKKRRQRRR-CCPGECVRTRRR)，也为该公司合成。

实施例2：

TAT-p53DM阻断神经元DAPK1DD与p53DM的结合的生物学作用，抑制DAPK1下游引 起神经元凋亡与坏死的信号

分别用慢病毒包装Flag标记的DAPK1DD质粒（Flag-DAPK1DD）和GST标记的p53DM 质粒（GST-p53DM）后，共转染体外培养第10天的原代神经元，转然后第3天（原代培养第 13天），给予浓度为5μM的TAT-p53DM合成肽或对照TAT-s-p53DM或Vehicle孵育，2小时后 提取细胞蛋白。先用抗Flag的抗体沉淀细胞蛋白，再用抗GST的抗体去检测沉淀下来的蛋白， 检测到NC膜上黑色印迹表明DAPK1DD与p53DM相互作用。结果显示：给予TAT-p53DM后， 抗GST的抗体无法检测到NC膜上的GST-p53DM蛋白，提示DAPK1DD与p53DM的相互作用 被TAT-p53DM所阻断，而在给予TAT-s-p53DM的对照组NC膜上，有明显检测到的黑色印迹， 则说明DAPK1DD与p53DM的相互作用不能被对照多肽TAT-s-p53DM所阻断（图2A）。同时 我们对感染了含有Flag-DAPK1DD与GST-p53DM病毒的神经元进行了MTT检测，该检测能 反映神经元生存活力（Viability）。给予5μM的TAT-p53DM合成肽或对照TAT-s-p53DM或Ve  hicle孵育，结果显示，与TAT-s-p53DM（9%±4%）或Vehicle（6%±2%）比较，TAT-p53 DM能显著增加神经细胞的活力（58%±7%）(图2B)，说明TAT-p53DM阻断了神经元DAP  K1DD与p53DM结合的生物学作用，抑制DAPK1下游引起神经元凋亡与坏死的信号。

实施例3：

TAT-p53DM在缺血性卒中细胞模型中的应用

（1）原代神经元培养与缺血性卒中OGD细胞模型的构建

从母鼠子宫取出胚胎期第20天的小鼠，迅速浸入75%乙醇，断头后，于解剖液（D-Han  k’s Solution）中取出大脑皮层组织，用木瓜消化酶试剂盒（papain dissociation kit,Worthi  ngton Biochemical Corporation）消化分离皮层细胞，细胞种植于包被有30微克/毫升的多聚 赖氨酸和层粘连蛋白的19平方毫米盖玻片，细胞种植密度约为100–150个细胞/平方毫米， 盖玻片置于含新鲜无血清Neurobasal培养基(21103,GIBCO)与2%B27的12孔板中，每隔4 天更换新鲜相同培养基。通过对培养的神经元进行神经元标记物β-tubulin III(Tuj1)的免疫 细胞染色证明所培养细胞85%以上为神经元。

为模拟缺血性卒中的细胞模型，12孔板中的神经元在培养第10天（Days in vitro10,D  IV10）给予氧糖剥夺（OGD）处理，即将培养神经元的12孔板放入含5%CO₂，10%H₂和85% N₂的厌氧培养箱中。用500μl的去氧无糖碳酸氢盐溶液置换此前的培养液，并润洗三次， 然后将细胞置于37℃厌氧培养箱分别维持60分钟和90分钟。随后，再用含氧含糖(葡萄糖，2 0mM)的碳酸氢盐置换去氧无糖培养液，并在37℃含5%CO₂/10%H₂/85%O₂的潮湿培养箱 中维持培养72小时。至此，缺血性卒中的细胞模型建立完成，随即可对培养的神经元进行T AT-p53DM治疗(图3)。

（2）TAT-p53DM在缺血性卒中OGD细胞中的应用

为了明确TAT-p53DM的最佳应用浓度，上述原代培养的神经元在OGD处理后，恢复到 常规培养箱和培养基条件2小时，12孔板每孔500μl的培养基给予10μl37度预热的不同浓 度TAT-p53DM（1μM，3μM和5μM）进行孵育，观察其抑制DAPK1与p53相互作用的 效果。因为DAPK1与p53的相互作用是引起下游细胞死亡信号的触发因素。因此抑制DAPK 1与p53相互作用的TAT-p53DM的最佳浓度被选择用于后续OGD处理后细胞凋亡与坏死的 应用效果评价。

原代培养的神经元在OGD处理后，恢复到常规培养箱和培养基条件下培养2小时，12孔 板每孔500μl的培养基给予37度预热的10μl上述最佳治疗浓度的TAT-p53DM生理盐水溶 液孵育，继续在37℃含5%CO₂/10%H₂/85%O₂的潮湿培养箱中继续维持培养70小时后进行P I与TUNEL染色观察坏死与凋亡的细胞数量(图3)。

（3）TAT-p53DM应用效果评估

碘化丙啶(propidine iodide,PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在坏死 的细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此PI染色可大致反映细胞的坏死程度。具体 步骤为：先用PBS稀释10μM PI溶液，将PI溶液用微量加样枪按1/10体积加入细胞培养液中 （50μl/500μl）。随后在37oC条件下孵育15分钟，用PBS润洗两次后，加入细胞核染液D API1μl孵育10分钟后，直接在荧光显微镜下以535nm的激发光照射下观察拍照。红色标记 细胞为阳性坏死细胞。

细胞发生凋亡时，细胞内源性核酸内切酶激活导致核染色质DNA双链的断裂，大量DN A片段暴露出的3’羟基末断在末断转移酶(terminaldeoxynucleotidyltransferase,TdT)和DNA多 聚酶的作用下，与FITC荧光素标记的核苷酸结合，使凋亡细胞被特异性地标记和显示出来。 因此用凋亡细胞的原位末断转移酶标记法（TUNEL）所标记的细胞多少反映细胞凋亡程度。 具体步骤为：贴壁细胞先用PBS润洗，随后用含0.1%Trition-X-100的0.1%柠檬酸钠溶液在冰 上孵育细胞2分钟，新鲜配制TUNEL反应液（酶溶液/标记溶液，1:9混合）后，按12孔板每 孔加入50μl反应液于贴壁细胞中，37℃条件下孵育1小时，最后直接在荧光显微镜下以488 nm激发光照射下观察拍照。绿色标记细胞为阳性凋亡细胞。

TAT-p53DM的最佳应用浓度：通过提取不同浓度TAT-p53DM孵育的细胞蛋白，进行免 疫共沉淀实验，先用抗DAPK1的抗体去沉淀细胞蛋白，再用抗p53的抗体对沉淀在NC膜上 的蛋白进行免疫印迹染色，通过化学发光对免疫印迹膜进行曝光成像，黑色条带显示DAPK 1所沉淀的p53蛋白，提示DAPK1与p53的相互作用。当给予5μM TAT-p53DM时，NC膜上 的黑色条带消失，说明该浓度完全抑制DAPK1与p53的相互作用，也说明5μM TAT-p53D  M是最佳的治疗给药浓度（图4A）。

接下来，我们对体外培养10天的原代神经细胞进行OGD处理60分钟和90分钟，在60分 钟OGD处理的情况下，PI标记出46%细胞坏死，TUNEL标记出21%的细胞凋亡。当培养物 经过90分钟OGD处理后，18%细胞对TUNEL出现阳性反应，PI标记出89%细胞，可见大部 分细胞在OGD处理下死亡。用5μM的TAT-p53DM对培养的原代神经元进行孵育处理，OG  D处理90分钟后的原代培养神经元，被PI和TUNEL标记的细胞数目显著减少(图4B)，其细胞 凋亡和坏死率分别是3%和12%，说明TAT-p53DM处理可以在细胞水平降低缺血后神经元死 亡，表明TAT-p53DM具有治疗缺血性卒中的作用。

实施例4：

TAT-p53DM在缺血性卒中小鼠模型中的应用

（1）缺血性卒中小鼠模型的建立

运用大脑中动脉栓塞MCAO小鼠模型模拟缺血性脑卒中，具体方法为：术前麻醉小鼠， 颈部做1-2cm长正中切口后，分离右侧颈总动脉，暴露颈外与颈内动脉分叉，从颈外动脉 向颈内插入直径约0.1mm尖端包被0.2mm直径硅胶的尼龙线栓(Doccol Co.,Redlands, CA,USA)，插入深度约0.8-1.0cm，至大脑中动脉前段起始部。1小时后，小心移除线栓， 恢复颈总动脉灌注，缝合伤口。假手术组动物(Sham)除了不插入线栓外，其余步骤均与MC AO模型动物相同。整个手术过程中，尽量减少污染，施行无菌操作，并用加热毯(Harvard  Apparatus,Holliston,MA,USA)维持动物体温于37℃±0.5℃。

（2）TAT-p53DM静脉注射

在小鼠脑缺血再灌注后3小时以及6小时，用注射器经股静脉缓慢单次注射1mg/kg TAT-p53DM(TAT-RVCACPGRDRRT)或对照TAT-s-p53DM(TAT-CCPGECVRTRRR)或无 菌生理盐水(Vehicle)。多肽浓度为1mg/ml,用无菌生理盐水溶解。TAT-p53DM静脉注射后， 在缺血再灌注7天后的小鼠脑组织切片进行TTC染色观察梗死病灶，FJ染色观察细胞死亡 情况，第7天至第14天进行水迷宫行为检测，评估TAT-p53DM的治疗效果，缺血再灌注 小鼠28天内指定时间点连续观测转棒行为，并在第28天进行神经系统症状评分（N.S.）进 一步明确TAT-p53DM对缺血性卒中的治疗作用(图5)。

（3）TAT-p53DM治疗效果评估

TTC染色检测缺血梗死体积：TTC（2，3，5—氯化三苯基四氮唑）是脂溶性光敏感复 合物，1894年首次合成用来检测种子的生存能力，1958年开始用来染色检测哺乳动物组织的 缺血梗塞。它是呼吸链中吡啶—核苷结构酶系统的质子受体，与正常组织中的脱氢酶反应而 呈红色，而缺血组织内脱氢酶活性下降，不能反应，故不会产生变化呈苍白。具体操作步骤 如下：MCAO模型动物于缺血再灌注7天后麻醉处死，迅速取出完整脑组织，-20℃速冻20 分钟，新鲜配置2%TTC PBS溶液，避光于37℃保存备用。-20℃取出脑组织后，迅速从前向 后作连续冠状切片，切片厚度约1毫米。然后将切片置于2%TTC PBS溶液中，37℃避光孵 育30分钟。染色结果可见，正常脑组织区域为红色，而缺血区不被着色。染色后，切片置于 4%多聚甲醛PBS溶液中固定，最后对固定的脑切片缺血面积进行统计分析。选取前囟点前 后各0.3厘米区域的连续6张切片，运用图像分析软件(Image J1.37v,Wayne Rasband,avail  able through National Institutes of Health)计算分析缺血体积（Infarction,mm³）。

Fluoro-Jade C（FJ-C）与TUNEL染色：缺血再灌注第7天，麻醉小鼠后经心脏主动脉灌 流，分别用0.9%生理盐水和冰冷的4%多聚甲醛PBS溶液灌流固定脑组织。取出脑组织后， 在相同多聚甲醛液中后固定6-8小时后，置于30%蔗糖溶液，脑组织沉底后进行冰冻切片， 片厚30μm，切片保存于PBS溶液中，进行随后的FJ-C与TUNEL染色。①FJ-C染色：切片贴 于明胶载玻片后晾干，先置于100%乙醇1分钟，70%乙醇1分钟以及双蒸水中1分钟，随后在 含0.01%Fluoro-Jade(Millipore)和0.1%醋酸(1:10)的混合液中避光室温下孵育30分钟。随后 用水进行润洗，二甲苯快速透明后用DPX封片剂（Sigma）封片，显微镜用488nm激发光观 察绿色标记的阳性细胞，即为变性死亡的细胞。②TUNEL染色原理如上述，具体操作方法 如下：冰冻切片贴于明胶载玻片后晾干，先用PBS润洗，随后用含0.1%Trition-X-100的0.1% 的柠檬酸钠溶液在冰上孵育细胞2分钟，新鲜配制TUNEL反应液（酶溶液/标记溶液，1:9混 合）后，按每张脑切片加入50μl反应液在37℃条件下避光孵育1小时，最后直接在荧光显微 镜下以532nm激发光照射下观察拍照。红色标记细胞核为阳性凋亡细胞。

分别运用Longa行为障碍评分和转棒仪实验对MCAO模型小鼠运动功能进行检测。具体 为：①Longa行为障碍评分：0分，无神经功能缺失症状；1分，不能完全伸展对侧前爪；2 分，爬行时出现对侧转圈；3分，行走时身体向对侧倾倒；4分，不能自行行走，意识丧失。 得分越高表明动物行为障碍越严重。②转棒仪试验：MCAO手术前(第0天),手术后第7天,1 4天，21天和28天运用大鼠转棒仪(Ugo Basile,Italy)测试手术前后动物的运动功能。转棒仪 工作模式如下：在4转/分(rpm)的匀速模式下，从放置动物到动物落下的时间被记录下来作 为滞留时间，反映动物的四肢肌力及运动协调能力。实验前，动物训练两天，每天训练3次， 记录并计算平均滞留时间以获得稳定的基础值。转棒仪正式实验每天进行3次，间隔检测28 天。滞留时间RT值越低，表明动物运动功能越差。

Morris水迷宫实验是1981年由Morris建立，通过让实验动物游泳并学习寻找隐藏在水中 平台的方法来测试实验动物对空间位置觉和空间定位的学习记忆能力。具体操作如下：①空 间记忆实验：实验历时6天。实验开始前半小时将小鼠置于水迷宫房间适应环境，每天每只 小鼠训练4次。实验者将小鼠以手托起令其面向池壁，轻轻放入水中。小鼠在60秒内能寻找 到平台，则记录其搜寻并登上平台所需要的时间，即潜伏期（Latency）。若小鼠在60秒内 未能找到平台，潜伏期记为60秒，并由实验者引导至平台上停留30秒，以让其根据4个象限 的参照物来进行空间学习和记忆。每只小鼠总计训练24次，计算每天各组小鼠潜伏期，游泳 距离(Length)。②空间探索实验用于测量动物对平台空间位置的记忆能力。在第7天撤除平台， 随机选择入水点，将小鼠按上述方法置于水中，游泳60秒，测量小鼠在目标象限（target qu  adrant）的滞留时间(Time)反映动物的空间位置记忆能力。

对动物缺血再灌注后3小时，6小时的小鼠股静脉注射1mg/ml TAT-p53DM溶液，动 物缺血再灌注第7天处死，取出脑组织，TTC染色显示小鼠脑缺血梗死体积（infarction,m  m³），给予TAT-p53DM后脑缺血梗死体积为12.3±2.4mm³，虽然高于Sham组的1.6±0. 3mm³，但显著低于对照组TAT-s-p53DM的16.5±2.1mm³或生理盐水Vehicle组的17.2 ±2.3mm³(图6A)。FJ-C与TUNEL染色显示，给予TAT-p53DM的小鼠神经细胞坏死与凋 亡数量分别为：28±2和7±1个，显著低于对照组TAT-s-p53DM的133±24和32±1 2个或生理盐水vehicle组136±21和48±12个，且接近于Sham组水平(15±2和5± 1个)（图6B）。此外，小鼠转棒行为学结果显示，缺血后第7天，TAT-p53DM注射的小鼠 停留在转轮上的时间（Stay on rotarod）为64±4秒，虽然低于Sham组102±15秒，但 较TAT-s-p53DM注射小鼠的38±3秒与Vehicle注射小鼠的40±4秒显著延长，且一直持 续到第28天（图7A）。缺血后第28天的神经功能评分（N.S）的结果显示，TAT-p53DM注 射小鼠的评分为1.5±0.4，尽管高于Sham组的0.1，但显著低于TAT-s-p53DM注射组小鼠 的3.5±0.5与Vehicle注射组小鼠的3.5±0.7（图7B），证明TAT-p53DM具有显著的改善 神经系统症状的效果。缺血后第7天的水迷宫行为学检测结果表明，TAT-p53DM注射小鼠 在第6天找到平台的潜伏期为16±5秒，较TAT-s-p53DM的26±4秒或Vehicle组的25 ±5秒显著减少，且接近于Sham组15±4秒（图8A）；TAT-p53DM注射小鼠在第7天的 probe测试中在目标象限停留的时间为42±3秒，较TAT-s-p53DM的18±3秒或Vehicl  e组的20±2秒显著延长，且接近于Sham组水平的51±5秒（图8C）。图8B显示水迷宫 训练第6天，TAT-p53DM注射小鼠的游泳距离为287±12厘米，接近于Sham组的293± 16厘米，但显著低于注射TAT-s-p53DM的游泳距离356±21厘米和Vehicle组的游泳距 离378±36厘米。上述结果表明：TAT-p53DM注射后，显著改善缺血性卒中小鼠的学习与 记忆能力。

上述组织学与行为学的实验研究统计结果一致表明，在缺血性卒中动物模型，小分子多 肽TAT-p53DM静脉注射，具有确切的缓解缺血后神经系统症状，降低缺血梗死体积，减少 缺血后神经细胞死亡以及改善缺血后运动与学习记忆功能的作用，是潜在的开发缺血性卒中 治疗药物的靶点。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  武汉启瑞科技发展有限公司

       华中科技大学

     

 

<120>  小分子多肽TAT-p53DM及其在制备治疗或预防缺血性卒中药物的应用

 

<130>  小分子多肽TAT-p53DM及其在制备治疗或预防缺血性卒中药物的应用

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.1

 

<210>  1

<211>  23

<212>  PRT

<213>  人工合成

 

<400>  1

 

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Val Cys Ala Cys

1               5                   10                  15     

 

 

Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr

            20             

 

 

<210>  2

<211>  69

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  2

tatggccgca aaaaacgccg ccagcgccgc cgccgcgtgt gcgcgtgccc gggccgcgat     60

 

cgccgcacc                                                             69