一株哈茨木霉及其在防控草坪褐斑病中的应用

摘要

本发明公开了一株哈茨木霉及其在防控草坪褐斑病中的应用。本发明提供的哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JTM53，其保藏编号为CGMCC No.8914。本发明还保护所述JTM53菌株的发酵物。JTM53菌株具有生存能力强、适应性广、不污染环境等属性，作为生防菌具有广阔的应用前景。室内对峙拮抗试验表明，JTM53菌株对立枯丝核菌具有良好的抑菌效果。进一步用JTM53菌株制备固体发酵物，然后用固体发酵物进行盆栽防治实验和大田防治试验，对立枯丝核菌防治效果良好且稳定。本发明对于草坪褐斑病的防控具有重大的应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及一株哈茨木霉及其在防控草坪褐斑病中的应用。

背景技术

草坪褐斑病是由立枯丝核菌引起的、发生在草坪上的一类重要的土传真菌病害。 该病害在国内外冷暖季型草坪上普遍发生，对草坪的生长和发育危害严重，甚至有的 年份对草坪造成毁灭性危害。该病害也可以导致不同地区的多种作物发病，引起大量 的经济损失。

草坪禾草植物大多为多年生，这为立枯丝核菌的积累、草坪褐斑病的发生提供了 适宜条件。草坪褐斑病典型的症状特征是草坪禾草被侵染后短期内就可以导致根茎叶 部组织腐烂或大量植株的死亡，到目前为止在生产中还未出现效果较好的抗病品种。

目前在对草坪褐斑病的防治中，化学防治占据重要的地位。化学防治不但成本高， 且易污染环境，在防控病原菌的同时病原菌也易对化学药剂产生耐药性甚至抗药性。

发明内容

本发明的目的是提供一株哈茨木霉及其在防控草坪褐斑病中的应用。

本发明提供的哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JTM53，简称JTM53菌株，已 于2014年03月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称 CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.8914。

本发明还保护所述JTM53菌株的发酵物。

所述发酵物的制备方法具体如下：

(1)将JTM53菌株的孢子接种至种子培养基(初始浓度具体可为106CFU/mL)，进 行培养，得到种子液；

(2)将步骤(1)得到的种子液与发酵培养基混合，进行发酵，得到发酵物。

步骤(1)中，所述培养的条件具体可为：溶解氧浓度20％、温度28-30℃、搅拌 速度200-250rpm(具体可为200rpm)、通气量10-15L/min(具体可为15L/min)，3天。 所述种子培养基的具体如下：种子培养基(pH6.0-6.5)：溶剂为水，含小麦麦麸2％(质 量比)、葡萄糖1.0％(质量比)、硫酸镁0.5％(质量比)、磷酸二氢钾0.3％(质量比)、 氯化钙0.3％(质量比)。

步骤(2)中，所述发酵的条件具体可为：温度28-30℃、空气相对湿度95-100％、 培养基厚度5-7cm，培养5-7天(具体可为7天)，然后将培养物自然风干至含水量为 7％-10％(具体可为10％)。所述发酵培养基具体如下：发酵培养基(pH6.5)：将7质量 份小麦麦麸与3质量份小麦麦秸粉末混合，加入水，使得培养基的含水量为70％(体 积比)。

步骤(2)中，具体可将1体积份步骤(1)得到的培养物与9体积份发酵培养基 混合。

本发明还保护JTM53菌株或所述JTM53菌株的发酵物在抑制立枯丝核菌中的应用。

本发明还保护JTM53菌株或所述JTM53菌株的发酵物在防控草坪褐斑病中的应用。

本发明还保护JTM53菌株或所述JTM53菌株的发酵物在防控早熟禾发生草坪褐斑 病中的应用。

本发明还保护一种用于抑制立枯丝核菌的制剂，包括JTM53菌株或所述JTM53菌 株的发酵物。

本发明还保护一种防控草坪褐斑病的制剂，包括JTM53菌株或所述JTM53菌株的 发酵物。

本发明还保护一种防控早熟禾发生草坪褐斑病的制剂，，包括JTM53菌株或所述 JTM53菌株的发酵物。

作为木霉菌，JTM53菌株具有生存能力强、适应性广、不污染环境等属性，作为生 防菌具有广阔的应用前景。室内对峙拮抗试验表明，JTM53菌株对立枯丝核菌具有良好 的抑菌效果。进一步用JTM53菌株制备固体发酵物，然后用固体发酵物进行盆栽防治实 验和大田防治试验，对立枯丝核菌防治效果良好且稳定。本发明对于草坪褐斑病的防 控具有重大的应用价值。

附图说明

图1为JTM53菌株在PDA培养基上20℃培养5d的菌落照片。

图2为JTM53菌株的分生孢子梗及分生孢子的照片。

图3为实施例2中的结果照片。

图4为实施例3中的结果照片。

图5为实施例5的步骤一中的结果照片。

图6为实施例5的步骤二中的结果照片。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实 验，结果取平均值。70％甲基托布津可湿性粉剂：西安市临潼区农药厂。早熟禾：北京 国泰盛华科技发展有限公司。

立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)：参考文献：晁龙军，单学敏，车少臣等.2000. 草坪褐斑病病原菌鉴定、流行规律及其综合控制技术的研究.中国草地，(4)：4247。

实施例1、菌株的获得、鉴定和保藏

PDA培养基：马铃薯200g、葡萄糖15g、琼脂20g、蒸馏水1000ml，121℃灭菌20min。

TSM培养基：MgSO₄·7H₂00.2g、K₂HPO₄0.9g、KCl0.15g、NH₄NO₃1.0g、葡萄糖 3.0g、玫瑰红0.15g、60％敌克松可湿性粉剂0.3g、PCNB0.2g、琼脂20g、蒸馏水950ml， 121℃灭菌20min。

一、JTM53菌株的获得

采样时间：2008年2月。

采样地点：北京高尔夫球场。

拨开3-5cm的表层土，然后将植物的根系挖出，连同根围的土壤一起，装到聚乙 烯塑料袋里，带回实验室。将粘附有土壤的根系稍风干，轻拍根系，使粘附在上面的 土壤脱落，用无菌水梯度稀释，分别吸取0.1mL稀释液滴入TSM培养基平板上，用灭 菌的L形涂布棒涂布均匀，置于25-28℃的恒温培养箱中培养3-4天。挑取形态似木 霉菌的单菌落转接到PDA培养基平板上进行纯化培养，镜鉴初步认定为木霉菌后编号， 并保存到PDA培养基斜面上。

通过上述步骤，获得若干纯培养的菌株，将其中一株命名为JTM53菌株。

二、JTM53菌株的形态特征

在PDA培养基上20℃培养5d的菌落照片见图1。直径约9.0cm，生长速度很快， 蛛丝状至羊毛状，白色，散生光下由于产孢表面呈绿色，背面无色，后期由于产孢量 大使菌落呈稍绿色。

分生孢子梗及分生孢子的照片见图2。多分枝的树状分生孢子梗形成相当疏松的 菌丛。主枝宽4-5μm，侧枝多，形成金字塔形。侧生瓶梗可达5个，成拟轮状排列或 单个沿小侧枝不规则排列。侧生瓶梗基部略缢缩，中部膨大，向上渐狭成瓶梗，5-7 ×3-3.5μm。顶生的和不典型的瓶梗相对长且纤细，13-18×2.5-3.5μm。瓶梗大多以 大角度在其载体上着生，有时略弯向顶端。瓶梗孢子呈球状分生孢子头，分生孢子近 球形或倒卵形，壁光滑，淡绿色，2.8-3.2×2.5-2.8μm。

三、JTM53菌株的分子鉴定

JTM53菌株的ITS区如序列表的序列1所示。

四、JTM53菌株的保藏

基于形态特征和分子鉴定结果，JTM53菌株属于哈茨木霉(Trichoderma  harzianum)。哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JTM53，简称JTM53菌株，已于2014 年03月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC， 地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.8914。

实施例2、JTM53菌株对病原菌的抑制作用

1、将JTM53菌株单菌落接种至PDA培养基平板，20℃培养5d。

2、取完成步骤1的PDA培养基平板，在菌落前沿用打孔器打取直径为5mm的菌饼 (生防菌饼)。

3、将立枯丝核菌单菌落接种至PDA培养基平板，20℃培养5d。

4、取完成步骤3的PDA培养基平板，在菌落前沿用打孔器打取直径为5mm的菌饼 (致病菌饼)。

5、取新的PDA培养基平板，用打孔器打取直径为5mm，作为对照物。

6、分组处理

试验组：取新的PDA培养基平板，在上面放置1个生防菌饼和1个致病菌饼，两 个菌饼中心的直线距离为3cm，25℃培养(12h光照/12h黑暗)；

对照组：取新的PDA培养基平板，在上面放置1个对照物和1个致病菌饼，两者 中心的直线距离为3cm，25℃培养(12h光照/12h黑暗)。

培养3天后测量致病菌的菌落直径，计算抑制率。抑制率＝(对照组致病菌的菌落 直径-试验组致病菌的菌落直径)÷对照组致病菌的菌落直径×100％。JTM53菌株对立 枯丝核菌的抑制率为68.7％(三次重复的平均值)。

培养6天后的照片见图3(左边的为生防菌饼，右边的为致病菌饼)，可以观察到， 立枯丝核菌已经完全被JTM53菌株覆盖。

实施例3、JTM53菌株对病原菌的重寄生能力

1、将JTM53菌株单菌落接种至PDA培养基平板，20℃培养5d。

2、取完成步骤1的PDA培养基平板，在菌落前沿用打孔器打取直径为5mm的菌饼 (生防菌饼)。

3、将立枯丝核菌单菌落接种至PDA培养基平板，20℃培养5d。

4、取完成步骤3的PDA培养基平板，在菌落前沿用打孔器打取直径为5mm的菌饼 (致病菌饼)。

5、取新的PDA培养基平板，在上面放置一个lcm×3cm的玻璃纸条，然后在玻璃 纸条长度的一端放置1个生防菌饼、另一端放置1个致病菌饼，25℃培养(12h光照 /12h黑暗)。当观察致病菌和生防菌的菌丝接触后(约培养2天)，在电镜下观察生防 菌对致病菌菌丝的重寄生作用，结果见图4，可以观察到JTM53菌株以缠绕或平行生 长等方式寄生于立枯丝核菌菌丝上，立枯丝核菌菌丝生长受到限制，菌丝变形和扭曲。 培养1周后，JTM53菌株的菌落能完全覆盖立枯丝核菌菌落，并大量产生绿色孢子。

实施例4、JTM53菌株的固体发酵物的制备和应用

一、JTM53菌株的固体发酵物的制备

种子培养基(pH6.0-6.5)：溶剂为水，含小麦麦麸2％(质量比)、葡萄糖1.0％(质 量比)、硫酸镁0.5％(质量比)、磷酸二氢钾0.3％(质量比)、氯化钙0.3％(质量比)； 121℃灭菌30min。

发酵培养基(pH6.5)：将7质量份小麦麦麸与3质量份小麦秸秆粉末混合，加入 水，使得培养基的含水量为70％(体积比)；121℃灭菌30min。

1、将JTM53菌株的孢子接种至种子培养基(初始浓度为106CFU/mL)，保持溶解氧 浓度20％、温度28-30℃、搅拌速度200rpm(实际应用中，200-250rpm均可)、通气量 15L/min(实际应用中，10-15L/min均可)，培养3天。

2、将1体积份步骤1得到的培养物与9体积份固体培养基混合均匀，保持温度 28-30℃、空气相对湿度95-100％、培养基厚度5-7cm，培养7天(实际应用中，5-7 天均可)，然后将培养物自然风干至含水量为10％(实际应用中，7％-10％均可)，即为 JTM53菌株的固体发酵物(又称生防菌固体发酵物)。

二、立枯丝核菌的固体发酵物的制备

用立枯丝核菌代替JTM53菌株，其它同步骤一，得到立枯丝核菌的固体发酵物(又 称致病菌固体发酵物)。

三、生防菌固体发酵物的温室生防效果(接种致病菌)

1、实验第1天，将带有4片真叶的早熟禾幼苗移栽到营养钵(每个营养钵装有250g 由7质量份草炭和3质量份蛭石混合得到的培养基质)，每个营养钵移栽10株幼苗。

2、分组处理

试验组：实验第8天，在营养钵中加入小麦麦麸粉末(小麦麦麸粉末的加入量为培 养基质质量的1％；目的是富集真菌群落及增加草坪褐斑病的发生压力)，然后在营养 钵中幼苗根部加入步骤一得到的生防菌固体发酵物(生防菌固体发酵物的加入量为培 养基质质量的1％)和步骤二得到的致病菌固体发酵物(致病菌固体发酵物的加入量为 培养基质质量的1％)，然后在表面覆盖一层灭菌细土，浇水；

对照组：不加入生防菌固体发酵物，其它同试验组。

3、实验第33天，按如下方法调查草坪褐斑病的发病情况：把附着在幼苗根部的基 质冲洗干净，然后调查根部的损害程度。

根部的损害程度的分级标准：

0：根部腐烂程度<1％；        1：根部腐烂程度1％–25％；

2：根部腐烂程度26％–50％；  3：根部腐烂程度51％–75％；

4：根部腐烂程度76％–89％；  5：根部腐烂程度>90％。

统计病情指数时进行三次重复实验，每次重复实验中每组处理随机取10株植株。

对照组的发病率为100％。实验组的发病率为18.0％，病情指数为3.5。

四、田间生防效果(自然发病)

田间试验分两年进行，随机设计，每组5个重复处理，每个重复处理为15m×3m的 草坪(草坪种植的植物品种为早熟禾)。

实验组：将步骤一得到的生防菌固体发酵物与适量细土混均，于植物3叶期均匀施 入草坪的2～5cm土层，生防菌固体发酵物的施加量为8g/m2；

阳性对照组：将70％甲基托布津可湿性粉剂与适量细土混均，于植物3叶期均匀施 入草坪的2～5cm土层，70％甲基托布津可湿性粉剂的施加量为10g/m2；

阴性对照组：不进行任何处理。

每隔7天调查发病率(DI)，每次调查时，每个重复随机调查4个点，每点的直径 为0.15m。按照步骤三的公式统计病情指数(DS)。结果见表1。

表1发病率和病情指数结果

实施例5、JTM53菌株的代谢产物的抑菌活性

一、挥发性化合物

试验组：将JTM53菌株的菌丝块(活化3d直径5mm)接种于直径为9cm的PDA培养基 平板中央，25℃培养至菌落直径达5cm，在其上方蒙上双层直径略大于10cm的圆形无菌 玻璃纸膜片，无菌玻璃纸膜片上方对扣一个立枯丝核菌的菌丝块(活化3d直径5mm)， 用透明胶带密封后，25℃培养。

对照组：取直径为9cm的PDA培养基平板，在其上方蒙上双层直径略大于10cm的圆 形无菌玻璃纸膜片，无菌玻璃纸膜片对应PDA培养基平板中央扣一个立枯丝核菌的菌丝 块(活化3d直径5mm)，用透明胶带密封后，25℃培养。

每组设置5个重复处理。从放置立枯丝核菌的菌丝块开始计时，分别于培养24h、 48h和72h后检测抑制率，结果见表2。

培养72h后的照片见图5。

结果表明，JTM53菌株产生的挥发性化合物对立枯丝核菌具有抑制作用。

二、非挥发性化合物

试验组：取直径为9cm的PDA培养基平板，铺上双层直径略大于10cm的圆形无菌玻 璃纸膜片；然后在玻璃纸膜片上(对应PDA培养基平板中央)放置一个直径为5mm的JTM53 菌株的菌丝块，25℃培养至菌落直径达到5cm；然后揭去玻璃纸膜片，在PDA培养基平 板中央放置一个直径为5mm的立枯丝核菌的菌丝块，25℃培养；

对照组：取直径为9cm的PDA培养基平板，在平板中央放置一个直径为5mm的立枯丝 核菌的菌丝块，25℃培养。

每组设置5个重复处理，结果取平均值。

从放置立枯丝核菌的菌丝块开始计时，分别于培养24h、48h和72h后检测抑制率， 结果见表2。

培养72h后的照片见图6。

结果表明，JTM53菌株产生的非挥发性化合物对立枯丝核菌具有抑制作用。

表2抑制率结果