一种多光谱激发荧光成像中去除自体荧光干扰的方法

摘要

本发明公开了一种多光谱激发荧光成像中去除自体荧光干扰的方法，其特征在于，包括以下步骤：采集多幅生物体表的多光谱原始荧光图像；根据生物体的尺寸，从图像中选取矩形感兴趣区域；构建组合图像并计算其相关矩阵，对相关矩阵进行特征值分解；计算迭代初值；迭代求解自体荧光图像；去除自体荧光图像。本发明的有益之处在于：仅需一个波长的激发光源，并且对荧光探针在不同波长下的激发效率无要求；对采集到的多光谱原始荧光图像进行裁剪，在不损失荧光图像信息的同时减少了参与处理的像素个数，减少了运算量；通过特征值分解获取迭代初值，无需预先进行体外实验来测定荧光信号的光谱曲线，在保证计算精度的同时降低了实现复杂度。

说明书

技术领域

本发明涉及一种激发荧光成像图像预处理方法，具体涉及一种多 光谱激发荧光成像中去除自体荧光干扰的方法，属于图像预处理技术 领域。

背景技术

多光谱激发荧光成像中，通过外部光源激发生物体内的荧光探针， 荧光探针的发射荧光信号经过生物体内的散射与吸收，到达生物体 表。多光谱激发荧光成像利用光纤或相机等装置采集经过带通滤光片 组滤波的生物体表的荧光信号，能够对活体状态下的生物过程进行细 胞和分子水平的定性和定量研究，在肿瘤早期诊断、探针的生物分布 研究、靶向药物的体内代谢跟踪等领域被广泛应用。

自体荧光主要来自生物活体自身肠、脂肪、皮肤等组织受外部光 源激发后产生的荧光，在可见光波段（400nm-700nm）比较强，严重 时淹没有用的目标荧光信号，对目标荧光信号的检测产生干扰。

现有技术中，通过采集两个不同激发波长或者多个不同发射波长 的荧光图像，采用图像处理方法，对自体荧光干扰进行去除。

中国发明专利申请，公开号：CN102096914A，公开了一种生物荧 光图像中自体荧光干扰的去除方法。该方法采集两幅不同波段的激发 荧光图像，利用聚类分析和种子漫水等方法去除自体荧光干扰。该方 法要求激发荧光图像1中染料的激发效率高于激发荧光图像2中荧光 染料的激发效率，且激发荧光图像1的激发光波长大于激发荧光图像 2的激发波长。

文献Anne-sophie Montcuquet，Lionel Hervé,Fabrice Navarro, Jean-Marc Dinten,I.Mars“Nonnegative matrix  factorization:a blind spectra separation method for in vivo  fluorescent optical imaging”,Journal of Biomedical  Optics,15(5),056009,2010公开了一种多光谱激发荧光成像中的自 体荧光去除方法。该方法通过采集多幅不同发射波长的荧光图像，以 体外实验得到的荧光探针的光谱曲线作为迭代初值，采用加入正则化 约束项的非负矩阵分解方法，去除自体荧光。

上述两类方法在实施过程中存在的缺陷为：第一类方法需要两个 不同波长的激发光源，且要求使用的荧光探针在长波长下的激发效率 高于短波长下的激发效率；第二类方法采用体外实验得到的荧光探针 的光谱曲线作为迭代初值，用户需要进行体外测量实验，操作不方便； 同时，由于感兴趣区域通常只占图像中的部分像素，而该类方法直接 对采集到的多光谱图像进行处理，没有选取感兴趣区域并进行裁剪， 运算量大。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种对激发光源 和荧光探针无特殊要求、无需体外测量荧光信号光谱曲线的去除自体 荧光干扰的方法。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

一种多光谱激发荧光成像中去除自体荧光干扰的方法，其特征在 于，包括以下步骤：

（1）、采集多光谱原始荧光图像：利用多光谱激发荧光成像设备 采集同一激发波长下的J幅生物体表的多光谱原始荧光图像，记为 A_j，j=1,2,...,J；

（2）、图像裁剪：根据生物体的尺寸，从步骤（1）采集的J幅多 光谱原始荧光图像中选取矩形感兴趣区域，对多光谱原始荧光图像进 行裁剪，裁剪后的荧光图像长和宽与图像中生物体的长和宽相同，记 为B_j，B_j包括P行Q列像素，j=1,2,...,J；

（3）、特征值分解：构建组合图像C，组合图像C的第j行由图像 Bj排列成的行向量构成，组合图像C包括J行L列像素，L=P×Q，计 算组合图像C的相关矩阵D，对相关矩阵D进行特征值分解，取最大 特征值对应的特征列向量u，并将u中小于0的元素设置为0，其余 元素不变，得到v；

（4）、计算迭代初值：根据步骤（3）得到的向量v，由下式计算 迭代初值a₀和s₀：

a₀=1        （1）

s₀=v^T       （2）

式（1）中，1表示包含L个元素的全1列向量；

式（2）中，T表示转置运算；

（5）、迭代求解自体荧光图像：以步骤（4）中的a₀和s₀作为初值， 利用下式进行K次迭代：

$a_{k,i}=\frac{a_{k-1,i}{\left({\mathrm{Bs}}_{k-1}^T\right)}_i}{a_{k-1,i}{s}_{k-1}{s}_{k-1}^T}---\left(3\right)$

$s_{k,i}=\frac{a_{k,i}{\left(a_k^{T}B\right)}_i}{a_k^T{a}_k{a}_{k-1,i}}---\left(4\right)$

式（3）和式（4）中，k=1,2,...,K；a_k,i表示第k次迭代得到的列 向量a_k的第i个元素；表示列向量的第i个元素；表示行向量的第i个元素；

根据第K次迭代得到的结果计算E=a_Ks_K，并将前述E的每一行重 构成一幅包括P行Q列像素的图像，得到J幅自体荧光图像，记为F_j， j=1,2,...,J；

（6）、去除自体荧光图像：从裁剪得到的J幅荧光图像B_j中减去 由步骤（5）得到的自体荧光图像F_j，得到J幅仅包括目标信息的荧 光图像G_j：

G_j=B_j-F_j        （5）

式中，j=1,2,...,J。

前述的多光谱激发荧光成像中去除自体荧光干扰的方法，其特征 在于，在步骤（1）中，采用J个发射滤光片采集前述多光谱原始荧 光图像。

前述的多光谱激发荧光成像中去除自体荧光干扰的方法，其特征 在于，前述J个发射滤光片带宽相同、相邻滤光片的中心波长间隔与 滤光片带宽相等。

前述的多光谱激发荧光成像中去除自体荧光干扰的方法，其特征 在于，在步骤（1）中，采集前述J幅多光谱原始荧光图像时，采集 设备积分时间与成像生物体姿态均保持不变。

前述的多光谱激发荧光成像中去除自体荧光干扰的方法，其特征 在于，在步骤（3）中，前述相关矩阵D根据下式计算得到：

$D=\frac{1}{L}{\mathrm{CC}}^T---\left(6\right).$

本发明的有益之处在于：

1、仅需一个波长的激发光源，并且对荧光探针在不同波长下的 激发效率无要求；

2、本发明对采集到的多光谱原始荧光图像进行裁剪，在不损失 荧光图像信息的同时减少了参与处理的像素个数，减少了运算量；

3、本发明通过特征值分解获取迭代初值，无需预先进行体外实验 来测定荧光信号的光谱曲线，在保证计算精度的同时降低了实现复杂 度。

附图说明

图1是本发明的方法的主要流程示意图；

图2是利用本发明的方法获得的仿真实验结果图。

具体实施方式

本发明提供的方法采集同一激发波长下的多幅发射荧光图像并对 图像进行裁剪，利用多光谱激发荧光成像过程中有用荧光信号与自体 荧光信号光谱曲线不同的特点，通过特征值分解提供迭代初值，采用 非负矩阵分解方法去除自体荧光。

以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。

参照图1，本发明的多光谱激发荧光成像中去除自体荧光的方法， 包括以下步骤：

1、采集多光谱原始荧光图像

以体内有荧光探针的生物体为成像对象，利用多光谱激发荧光成 像设备采集图像，具体的，通过切换多光谱激发荧光成像设备的发射 滤光片，采集同一激发波长、不同发射波长下的J幅生物体表的多光 谱原始荧光图像，记为A_j，j=1,2,...,J。

发射滤光片数量为J个，并且J个发射滤光片带宽相同、相邻滤光 片的中心波长间隔与滤光片带宽相等。

在采集J幅多光谱原始荧光图像时，采集设备积分时间与成像生 物体姿态均保持不变。

2、图像裁剪

通常情况下，多光谱激发荧光成像设备的成像视野大于成像对象， 采集到的多光谱原始荧光图像只有部分像素包含有效信息，为了在保 留有效信息的同时减少像素个数从而减少后续运算量，根据生物体的 尺寸，从步骤1采集的J幅多光谱原始荧光图像中选取矩形感兴趣区 域，对多光谱原始荧光图像进行裁剪，裁剪后的荧光图像长和宽与图 像中生物体的长和宽相同，记为B_j，B_j包括P行Q列像素，j=1,2,...,J。

3、特征值分解

（1）构建组合图像C，组合图像C的第j行由图像B_j排列成的行 向量构成，组合图像C包括J行L列像素，L=P×Q。

组合图像C的具体构造步骤如下：

将裁剪后的荧光图像B_j的第1行像素到第J行像素拼成一行像素， 像素个数L为：L=P×Q，由J幅图像得到J行像素，该J行像素自上 而下排列，构成一幅包含J行L列像素的组合图像。

（2）计算组合图像C的相关矩阵D，相关矩阵D根据下式计算得 到：

$D=\frac{1}{L}{\mathrm{CC}}^T---\left(6\right).$

（3）对相关矩阵D进行特征值分解，取最大特征值对应的特征列 向量u，并将u，并将u中小于0的元素设置为0，其余元素不变，得 到v。

4、计算迭代初值

根据步骤3得到的向量v，由下式计算迭代初值a₀和s₀：

a₀=1       （1）

s₀=v^T      （2）

式（1）中，1表示包含L个元素的全1列向量；

式（2）中，T表示转置运算。

5、迭代求解自体荧光图像

以步骤4中的a₀和s₀作为初值，利用下式进行K次迭代：

$a_{k,i}=\frac{a_{k-1,i}{\left({\mathrm{Bs}}_{k-1}^T\right)}_i}{a_{k-1,i}{s}_{k-1}{s}_{k-1}^T}---\left(3\right)$

$s_{k,i}=\frac{a_{k,i}{\left(a_k^{T}B\right)}_i}{a_k^T{a}_k{a}_{k-1,i}}---\left(4\right)$

式（3）和式（4）中，k=1,2,...,K；a_k,i表示第k次迭代得到的列 向量a_k的第i个元素；表示列向量的第i个元素；表示行向量的第i个元素。

根据第K次迭代得到的结果计算E=a_Ks_K，并将E的每一行重构成 一幅包括P行Q列像素的图像，得到J幅自体荧光图像，记为F_j， j=1,2,...,J。

具体的，J幅自体荧光图像F_j的构造步骤如下：

将所述E的每一行像素等分成P份Q个像素，并将此P份Q个像素 自上而下排列，得到一幅P×Q的二维图像，E包括J行，共得到J幅 自体荧光图像。

6、去除自体荧光图像

从裁剪得到的J幅荧光图像B_j中减去由步骤5得到的自体荧光图 像F_j，得到J幅仅包括目标信息的荧光图像G_j：

G_j=B_j-F_j        （5）

式中，j=1,2,...,J。

为了更好的理解本发明，下面结合仿真实验对本发明的效果进一 步的描述，仿真实验以体内有荧光探针的裸鼠作为成像对象。

1、采集多光谱原始荧光图像。

采用与荧光探针吸收峰波长匹配的激发光源照射体内有该荧光探 针标记的裸鼠，利用多光谱激发荧光设备采集裸鼠体表的荧光探针发 射峰附近6个中心波长的原始荧光图像，记为A_j，j=1,2,…,6。

需要说明的是，多光谱激发荧光设备利用高灵敏度CCD相机进行 图像采集，其像素个数为1024×1024，因此，采集到的每幅原始荧 光图像均由1024×1024个像素构成。

2、图像裁剪。

根据裸鼠的尺寸，从步骤1采集的6幅原始荧光图像中选取725 ×270的矩形感兴趣区域，对原始荧光图像进行裁剪，裁剪后的荧光 图像记为B_j，B_j包括725行270列像素，j=1,2,…,6。

3、特征值分解。

将裁减后的荧光图像B_j的第1行像素到第725行像素拼成一行像 素，像素个数为725×270=195750，由6幅图像得到6行像素，该6 行像素自上而下排列，构成一幅包含6行195750列像素的组合图像， 记为C，根据下式计算组合图像C的相关矩阵D：

$D=\frac{1}{195750}{\mathrm{CC}}^T$

其中，T表示转置运算，对相关矩阵D进行特征值分解，取最大 特征值对应的特征列向量u，并将u中小于0的元素设置为0，其余 元素不变，得到v。

4、计算迭代初值。

由下式计算迭代初值a₀和s₀：

a₀=1，s₀=v^T

其中，1表示包含195750个元素的全1列向量，T表示转置运算。

5、迭代求解自体荧光图像。

以步骤4中的a₀和s₀作为初值，利用下式进行20次迭代：

$a_{k,i}=\frac{a_{k-1,i}{\left({\mathrm{Bs}}_{k-1}^T\right)}_i}{a_{k-1,i}{s}_{k-1}{s}_{k-1}^T}$

$s_{k,i}=\frac{a_{k,i}{\left(a_k^{T}B\right)}_i}{a_k^T{a}_k{a}_{k-1,i}}$

式中，k=1,2,...,20；a_k,i表示第k次迭代得到的列向量a_k的第i个元 素；表示列向量的第i个元素；表示行向量的 第i个元素。

根据第K次迭代得到的结果计算E=a_Ks_K，并将所述E的每一行重 构成一幅包括725行270列像素的图像，得到6幅自体荧光图像，记 为F₁，F₂，......，F₆。

6、去除自体荧光图像，根据下式从6幅裁剪后的荧光图像中减 去由步骤5得到的自体荧光图像，得到6幅仅包括目标信息的荧光图 像：

G_j=B_j-F_j，j=1,2,...,6。

图2所示为2组仿真实验结果。图中，a1,a2,......,a6所示为裁剪后 的6幅多光谱激发荧光图像，每幅荧光图像包括725×270个像素， 图中包括目标荧光信号和自体荧光信号，可以看到，自体荧光信号对 目标荧光信号形成一定干扰。图b1,b2,......,b6所示为采用本发明方法去 除自体荧光后的荧光图像，可以看到，自体荧光被有效去除。

由此可见，本发明的方法具有如下优势：

1、仅需一个波长的激发光源，并且对荧光探针在不同波长下的激 发效率无要求；

2、对采集到的多光谱原始荧光图像进行裁剪，在不损失荧光图像 信息的同时减少了参与处理的像素个数，减少了运算量；

3、通过特征值分解获取迭代初值，无需预先进行体外实验来测定 荧光信号的光谱曲线，在保证计算精度的同时降低了实现复杂度。

需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等 同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范 围内。