一种重组猪防御素及其制备方法和用途

摘要

本发明公开了一种重组猪防御素，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，本发明还公开了表达重组猪防御素的工程菌及其发酵方法和发酵产物。本发明重组猪防御素的抗菌活性高，可以用于制备抗菌药物，本发明工程菌的发酵产物抗菌活性高，安全，营养价值高，可用于制备抗菌饲料添加剂，工艺步骤简单，成本低廉，具有良好的工业应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种重组猪防御素及其制备方法和 用途。

背景技术

抗菌肽（Antibacterial Peptides，ABPs），又称抗微生物肽(Antimicrobial Peptides,AMPs)，广义上是指广泛存在于生物体内具有抵御外界微生物侵害， 清除体内突变细胞的一类小分子多肽，是生物先天免疫防御系统的一个重要 组成部分，在黏膜免疫系统中起重要作用，称之为“第一道防御体系”或“第一 道免疫体系”。抗菌肽广泛存在于细菌、植物、无脊椎动物及脊椎动物体内， 不仅具有广谱抗细菌能力，而且对真菌、病毒及癌细胞也有一定杀抑作用。 此外，还具有稳定、水溶性好、抗菌机理独特、无耐药性、对高等动物正常 细胞无害等特点，从而显示了其在医学和农业上潜在的研究和应用价值。

猪防御素属于抗菌肽家族的一员，其抗菌活性好，但是猪体内天然防御 素表达量低、分子小，分离困难，化学合成防御素成本高，所以利用分子生 物学技术重组表达外源基因是获取目标蛋白的有效途径。

彭章华等，“猪防御素PBD-1基因的克隆及其表达载体构建”，遗传繁育， 中国畜牧兽医，2005年第32卷第11期以及罗刚等，“猪防御素基因PBD-I 在大肠杆菌中的重组和融合表达”，遗传2003年第2卷第25期中，均公开了 构建猪防御素基因PBD-1重组表达载体的方法，但是均未表达得到有活性的 重组猪防御素。

发明内容

本发明的目的是提供了一种有抑菌活性的重组猪防御素及其制备方法。

本发明重组猪防御素的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

编码如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2或者 SEQ ID NO.3所示。

本发明提供了SEQ ID NO.2或者SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

本发明提供了一种重组载体，它包括SEQ ID NO.2或者SEQ ID NO.3所 示的核苷酸序列。所述的重组载体优选为重组毕赤酵母表达载体pPIC9。

本发明提供了一种重组菌，它包括前述的重组载体。所述重组菌优选为 重组毕赤酵母。

本发明提供了前述重组菌的发酵方法，它是将前述重组菌在酵母菌培养 基中培养，甲醇诱导表达，即可。

其中，前述发酵方法包括如下步骤：

（1）菌体生长：将重组菌置于BMGY培养基中，于25～35℃培养36～60h， 离心收集菌体；

（2）诱导表达：再用BMMY诱导培养基悬浮菌体，在25～35℃下诱导 培养48～120h。

BMGY培养基，其配方如下：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100mM磷 酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34%YNB（无氨基酵母氮源），4×10^-5%生物素，1% 甘油；

BMMY诱导培养基，其配方如下：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100mM 磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34%YNB（无氨基酵母氮源），4×10^-5%生物素，0.5% 甲醇。

优选地，步骤（1）中，培养温度为25℃，培养时间为60h；步骤（2） 中，培养温度为30℃，诱导时间为96h。

其中，前述发酵方法包括如下步骤：它包括如下步骤：

Ⅰ、制备种子：将重组菌置于YPD培养基中，于25～35℃摇瓶培养 24～48h，收集菌液；

Ⅱ、接种：以4～6％的接种量接种到BMGY培养基中，在25～35℃条件 下振荡培养；

Ⅲ、补料：待碳源耗尽后，加入浓度为25%（w/v）葡萄糖溶液3.2～3.6L；

Ⅳ、诱导表达：补料结束后，流加甲醇诱导表达，甲醇的浓度维持在0.5%， 诱导表达的时间为48～120h。

YPD培养基，其配方如下：1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖。

优选地，步骤Ⅰ中，培养温度为30℃，培养时间为24h；

步骤Ⅱ中，接种量为5%；培养温度为30℃；

步骤Ⅲ中，葡萄糖溶液的加入量为3.4L；

步骤Ⅳ中，诱导表达的时间为120h。

本发明还提供了前述任意一项方法制得的发酵产物。

本发明还提供了前述蛋白的制备方法，它是取前述发酵产物，静置，得 上清，分离纯化，即得。

所述分离纯化的方法包括如下步骤：

a、将上清液用浓度为20～90%（w/v）硫酸铵溶液盐析两次，脱盐；

b、加入磷酸缓冲液，采用阴离子交换柱纯化，得流穿液；

c、调流穿液的pH为5.0～5.4，采用阳离子交换柱纯化，以浓度为 0.8～1.2mol/L的氯化钠溶液洗脱，收集洗脱液；

d、在洗脱液中加入4～8的%硫酸铵，采用疏水层析纯化，脱盐，干燥， 用pH为6.7～7.1的磷酸钠和氯化钠的混合溶液重溶，混合溶液中，磷酸钠的 浓度为15～25mmol/L，氯化钠的浓度为0.05～0.15mmol/L；

e、分子筛纯化；

f、高效液相色谱纯化，即可。

优选地，步骤a中，两次盐析采用的硫酸铵浓度依次为70%（w/v）和 65%（w/v）；

步骤b中，所述阴离子交换柱为Q-Sepharose阴离子交换柱；

步骤c中，所述pH为5.2，所述阳离子交换柱为S-Sepharose阳离子交 换柱，所述氯化钠溶液的浓度为1mol/L；

步骤d中，所述硫酸铵的浓度为6%，疏水层析的介质为Phenyl Sepharose CL-4B；混合溶液的pH为6.9，磷酸钠的浓度为20mmol/L，氯化钠的浓度为 0.01mmol/L

步骤e中，所述分子筛为Sephacryl S-100HR分子筛；

步骤f中，高效液相色谱的条件如下：固定相：十八烷基硅烷键合硅胶； 流动相A：乙腈和三氟乙酸的混合溶液，乙腈的浓度为10%，三氟乙酸的浓 度为0.1%；流动相B：乙腈和三氟乙酸的混合溶液，乙腈的浓度为90%，三 氟乙酸的浓度为0.07%；洗脱条件：0-8min,流动相B的用量为15%；8-35 min，流动相B用量为40%；35-55min，流动相B的用量为85%;55min后， 流动相B的用量为15%；检测波长：220nm。

本发明还提供了前述蛋白或者发酵产物在制备抗菌药物或者抗菌饲料 添加剂中的应用。

本发明从猪防御素基因出发，用基因工程的方法制备得到具有抑菌活性 的重组猪防御素，其抗菌活性高，可用于制备抗菌药物；采用本发明工程菌 （含有SEQ ID NO.2所述基因片段的重组菌）表达得到的发酵产物抗菌活性 高，发酵罐（5L）发酵得到的产物效价高达2000IU/ml，安全，营养价值高， 可用于制备抗菌饲料添加剂，工艺步骤简单，成本低廉，具有良好的工业应 用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段， 在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修 改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步 的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。 凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1阳性转化子的PCR检测结果。泳道1:DNA分子量，泳道2-7，10， 11为阳性克隆子，泳道8，9为阴性克隆子；

图2发酵产物活性随着诱导时间增加的变化情况；

图3发酵产物的抑菌圈实验结果，1为阴性对照（无菌水），2，3，4， 5，6，7，8为发酵产物上清液。

图4发酵产物的电泳结果；

图5分子筛纯化的色谱图，色谱图中加入maker，以标记本发明收集 产物的分子量；

图6高效液相色谱图；

图7琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中，泳道1：发酵产物上清；泳道2： 盐析沉淀；泳道3：纯品溶液；

图8纯品溶液的抑菌圈实验结果，1，3，9阴性对照（无菌水），样2， 5，7为发酵产物上清液，4，6，8为纯品溶液。

具体实施方式

本发明抑菌活性的测定均采用如下方法：

1.原理

本法基于待测物质的杀菌抑菌能力，利用在特定条件下一定浓度的待测 物质在含有微生物的培养基内扩散并形成固定大小的抑菌区域的原理进行 测定，同时通过微生物检定法二剂量法计算待测物质相当于标准抗菌物质的 效价单位。

2.参考文献及标准

《中华人民共和国兽药典》2010版——抗生素微生物鉴定法（QB 2394-2007食品添加剂乳酸链球菌素）

3.试剂

3.1底层琼脂1.5g琼脂，加水至100mL，115℃，灭菌20min。

3.2上层琼脂：蛋白胨1.0g，酵母浸粉0.5g，NaCl1.0g，加水至100mL， 琼脂糖1.5g，pH7.0，115℃，灭菌20min。

3.3LB固体培养基：蛋白胨1.0g，酵母浸粉0.5g，NaCl1.0g，加水至 100mL，琼脂1.5g，pH7.0，115℃，灭菌20min。

3.4LB液体培养基：蛋白胨1.0g，酵母浸粉0.5g，NaCl1.0g，加水至 100mL，115℃，pH7.0，灭菌20min。

3.5磷酸缓冲液：K2HPO42.0g，KH2PO48.0g，加蒸馏水定容至1000mL， 过滤，115℃，30min，备用。

3.6指示菌：购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心，大肠埃希氏菌 CICC编号10389。

4.分析步骤

4.1指示菌的活化

按照试剂3.4的配方，配置30mL的培养液，取出一支指示菌，吸取1mL 无菌水加入其中并充分混匀，最后转接1mL指示菌菌悬液于培养液中，放入 摇床，200rpm，37℃，培养18h。取出培养好的指示菌菌悬液，600nm下用 无菌蒸馏水调零，测定其OD值，如果OD值介于1.5—2.0，菌悬液的加入 量为40微升每10mL上层培养基，如果OD值在2.0—2.5之间，菌悬液加入 量为35微升每10mL上层培养基。

4.2标准品液的制备

4.2.1硫酸粘杆菌素标准液

准确称取硫酸粘杆菌素标准品(中国兽医药品监察所，含量22156U/ mg)0.0360g，用试剂3.5磷酸缓冲液定容至10mL，2000rpm，离心10min后 再稀释10倍后作为高剂量浓度，并将其稀释1倍，使之配成高低剂量两个 浓度梯度溶液。

4.2.2待测物质供试品

准确称取待测物质3.8000g，并溶于6.2mL的磷酸缓冲液当中，混匀， 2000rpm，离心10min，留上清液作为高剂量浓度，并将其稀释1倍，使之配 成高低剂量两个浓度梯度溶液。

4.3平板的制备

用无菌20mL移液管移取15mL的平板试剂3.1底层琼脂于平板上，将 平板放置于水平的操作台上至冷却，备用。

加热融化试剂3.2上层琼脂，呆冷却置50℃时（刚好不烫手的温度）， 按步骤4.1指定量加入大肠杆菌悬液，摇匀后置于50℃恒温水浴锅中，用无 菌10mL移液管每次精确移取10mL试剂3.2上层琼脂注入含底层琼脂的平 板上，迅速轻放于于水平操作台上至冷却，保证琼脂胶凝后效价测定培养基 平面的平整度。

4.4上样

用直尺将平板划分为均匀的四份，在每个制备好的平板中以等距离安置 牛津杯4个。样品和标准品的高低剂量分别以对角形式加入，加入量为160 微升。上样完成后，放入培养箱，用事先烘干（烘箱120℃，2h）的陶瓦盖 代替平板上盖盖好平板，37℃，培养6h。实验重复5组。

4.5测量及结果计算

将平板取出，倒出牛津杯，将平板放置在一个黑色背景的平台上，用游 标卡尺测量各抑菌圈的大小，取其平均值，按公式1计算效价，或使用二剂 量法生物效价测定软件计算。

$1g\frac{C_{\mathrm{SH}}}{C_{\mathrm{BH}}}=\frac{(X_{\mathrm{SH}}+X_{\mathrm{SL}})-(X_{\mathrm{BH}}+X_{\mathrm{BL}})}{(X_{\mathrm{SH}}+X_{\mathrm{BH}})-(X_{\mathrm{SL}}+X_{\mathrm{BL}})}\times 1\mathrm{gk}.............\left(1\right)$

式中：

CSH——样品溶液的效价，单位为U/mg；

CBH——标准溶液的效价，单位为U/mg；

XSH——高剂量样品溶液所致的抑菌圈直径，单位为毫米（mm）；

XSL——低剂量样品溶液所致的抑菌圈直径，单位为毫米（mm）；

XBH——高剂量标准溶液所致的抑菌圈直径，单位为毫米（mm）；

XBL——低剂量标准溶液所致的抑菌圈直径，单位为毫米（mm）；

k——高剂量倍数与低剂量倍数的比值。

产品含量按公式2计算：

产品含量=CSH/0.38……………………………………………………….(2)

0.38——产品浓度，单位为g/mL

若样品估计值不在测定值的90%-110%范围内，需要重新估计样品效价， 重测。

实施例1制备含有目标基因片段的工程菌

一、重组防御素多肽基因的获得

1、获得表达有抗菌活性的重组防御素多肽基因

从NCBI数据库中调取已知猪防御素序列PBD1，PBD2和PBD，对其进 行多序列比对和分析，调整的DNA序列，合成得到新的基因序列Consensus：

CCTACA CTGCGA AAAAAGGGGCA GTGTA T TT

GCATGCCCTCCAAAGAAGAAACAGATAGGTACCTGTTTTGCCAAG

CAAGTGCTGCA AAGG；

使用高保真PCR方法对合成的防御素基因（Consensus）进行扩增，使 用DNase I将扩增的DNA部分降解，将降解DNA进行反复变性复性，用高 保真无引物PCR方法扩增；再用设计好的基因引物（5’引物序列： atgc(a/g/c)ctaca(g/a/t)ctgc,3’引物序列ttacctt(c/t/a)tgcagca进行全长基因的扩 增，并建立克隆文库；

通过抑菌圈进行文库筛选，获得具有抑菌活性表达产物的克隆子 PBD-m，测序。

经过测序，PBD-m中表达目标产物的DNA序列为:

atgcactacagctgcaagagaaaaaggggcacgtgtattgttggcccatgccctccaaagaagaaacagataggta cctgttgtgtgcccaaagtcaagtgctgcagaaggtaa（SEQ ID NO.2）；

PBD-m DNA翻译的蛋白质序列为：

mhysckrkrgtcivgpcppkkkqigtccvpkvkccrr（SEQ ID NO.1）。

二、改造获得表达高抑菌活性重组防御素多肽基因

根据编码成熟多肽的基因序列,按照毕赤酵母密码子的偏爱性，在不改 变其氨基酸序列的前提下进行序列改造，改造后的序列为：

atgcattactcttgtaagagaaagagaggtacttgtattgttggtccatgtcctccaaagaagaaacaaattggtacttgt tgtgttccaaaggttaagtgttgtagaagataa（SEQ ID NO.3），命名为PBD-mI，人工合成 得到序列。

三、重组菌的构建

1、重组表达载体的构建

取合成的PBD-mI，通过EcoRI/NotI位点克隆到毕赤酵母表达载体 pPIC9上,得到重组载体pPIC9-PBD-mI。DNA的重组操作依据《分子克隆 实验手册》进行。

2、酵母的电击转化及筛选（见Invitrogen公司操作手册）

取步骤1重组载体pPIC9-PBD-m I，用BgⅢ酶切使之线性化，电击转化 毕赤酵母，挑取阳性转化子，即为本发明工程菌。

通过PCR的方法使用PBD-mI基因的特异引物（5’引物 atgcattactcttgtaagaga,3’引物ttatcttctacaacacttaac）对阳性转化子进行PCR检测。

如图1的PCR结果所示，阴性转化子中无目标基因片段，阳性转化子中 含有目标基因片段PBD-mI，说明本发明得到了含有目标片段段PBD-mI的 阳性转化子。

实施例2本发明重组猪防御素的表达纯化

1、表达方法

（1）表达

取实施例1得到的工程菌（阳性转化子），置于5ml BMGY培养基中， 于30℃摇床培养48h，离心收集菌体；再用BMMY诱导培养基悬浮菌体， 在30℃下诱导培养120h，期间间隔12h取样检测抑菌活性。

取诱导培养96h样品的上清液，再次检测抑菌活性，并用SDS-PAGE鉴 定。

BMGY培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100mM磷酸钾缓冲液 (pH6.0)，1.34%YNB，4×10^-5%生物素，1%甘油；

BMMY诱导培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100mM磷酸钾缓冲 液(pH6.0)，1.34%YNB，4×10^-5%生物素，0.5%甲醇。

（2）分离纯化

①硫酸铵沉淀

取步骤（1）的上清液，使用硫酸铵沉淀法沉淀。

分别采用20%，25%，30%，35%，40%，45%，50%，55%，60%，65%， 70%，75%，80%，85%，90%浓度的硫酸铵对上清液进行盐析，发现在70% 的盐析物的活性明显高，如下表所示。

硫酸铵浓度 沉淀抑菌圈(mm) 上清抑菌圈(mm) 20% 9.3 15.1 25% 10.2 14.9 30% 9.8 14.8 35% 10.5 15.2 40% 10.2 15.3 45% 10.4 14.7 50% 9.6 15.0 55% 10.2 14.8 60% 11.3 14.6 65% 11.6 14.5 70% 12.4 13.7 75% 13.1 13.3 80% 12.8 13.5 85% 12.6 13.2 90% 13.5 13.3

将上清液采用70%硫酸铵进行盐析，再选择采用20%，25%，30%，35%， 40%，45%，50%，55%，60%，65%，70%，75%，80%，85%，90%浓度的 硫酸铵进行第二次沉淀，发现在65%的盐析产物的活性明显高。

硫酸铵浓度 沉淀抑菌圈(mm) 上清抑菌圈(mm) 20% 8.3 15.9 25% 9.2 15.2 30% 9.8 15.8 35% 9.5 15.6 40% 10.2 15.5 45% 9.4 15.8 50% 10.6 15.3 55% 11.2 15.1 60% 13.3 14.8 65% 15.6 10.6 70% 18.4 9.4 75% 18.1 9.9 80% 17.8 9.6 85% 17.6 8.7 90% 17.5 9.3

将上清液采用70%硫酸铵进行盐析，再采用65%的硫酸铵进行第二次沉 淀，将获得的沉淀物经行第二次盐析（70%硫酸铵），获得粗品。

②粗品初步纯化

将步骤①的粗品，通过pH7.5、20mM磷酸钠平衡的Sephadex G-25PD-10 柱子脱盐，使用磷酸缓冲液平衡的Q-Sepharose阴离子交换柱纯化，得收集 液；

将收集液pH调整至5.2，使用pH5.2、20mM磷酸钠S-Sepharose阳离 子交换柱纯化，使用1.0M NaCl缓冲液洗脱，收集洗脱液。

③分子筛分离

在上一步的洗脱液中加入6%的硫酸铵，采用Phenyl Sepharose CL-4B柱 子纯化，硫酸铵浓度梯度洗脱，收集活性峰洗脱液，再在Sephadex G-25PD-10 柱子脱盐，然后使用冷冻真空干燥后，使用20mM磷酸钠，pH6.9-0.1mM NaCl 重溶，使用分子筛Sephacryl S-100HR柱分离，根据色谱图，收集Fraction 为60-61mm（分子量为4kd）的溶液（色谱图如图5所示）。

④高效液相色谱分离

将上一步所得溶液用高效液相色谱仪进一步纯化，配紫外检测器和色谱 工作站（CBM-102），谱条件：色谱柱：C18柱，4.6mm×250mm，流动相： A（10%乙腈，0.1%三氟乙酸）；B(90%乙腈，0.07%三氟乙酸)。洗脱条件： 0-8min,B15%;8-35min,B由15%升至40%；35-55min，B85%;55min后， B15%平衡，采集数据。流速：1mL/min。进样量：10μL。波长：220nm。 柱温：25℃。根据色谱图，收集保留时间为31.958的主峰，即得本发明重组 猪防御素纯品溶液。高效液相色谱图如图6所示，在本发明条件下，本发 明目标产物与其他杂质被有效分离，收集得到的主峰为目标产物的纯品溶 液。

取纯品溶液进行抑菌活性检测，用琼脂糖凝胶电泳鉴定分子量。

2、检测结果

如图2所示，随着诱导时间延长，发酵产物的抑菌活性逐渐增加，诱导 时间达48h时，抑菌圈直径大于10mm，诱导时间达到96h时，抑菌圈直径 大于15mm，此后，随着诱导时间的延长，抑菌活性增加幅度变小。综合考 虑成本，诱导时间优选为96h。

如图3所示，诱导时间为96h时，发酵产物上清液的抑菌圈平均直径为 15.12mm；上清液SDS-PAGE电泳结果如图4所示，可看到4kD有一条活性 条带，与从本发明重组猪防御素的理论分子量（4kD）一致。

纯品溶液的电泳结果显示，得到的目标蛋白的分子量为4KD，与本发 明重组猪防御素的理论分子量（4kD）一致（图7），同时，其有良好的抑 菌活性，抑菌圈平均直径大于15mm（图8）。

实验结果说明，本发明成功表达得到了重组猪防御素，其分子量为4 kD，氨基酸序列为：mhysckrkrgtcivgpcppkkkqigtccvpkvkccrr，抑菌活性高， 可以用于制备抗菌药物；采用本发明工程菌发酵得到的发酵产物的抑菌活性 高，安全，营养价值高，可用于制备抗菌饲料添加剂。

实施例3本发明工程菌的发酵罐发酵

1、发酵方法

（1）发酵种子液制备（摇瓶中进行）

取实施例1制备的工程菌，加入装有300mL种子培养基（YPD培养基） 的500mL摇瓶中，置于200r/min恒温摇瓶柜，30℃振荡培养24h，8层纱 布封口，作为发酵用的一级种子。

（2）发酵罐发酵（5L，BIOSTAT B5型，按照发酵罐操作手册进行）

以5％的接种量接种到BMGY培养基中，在30℃和300r/min的条件下 振荡培养；

待碳源耗尽后，补料，加入浓度为25%葡萄糖（850g）3.4L；

补料结束后，流加甲醇，甲醇的浓度维持为0.5%，每隔12h取样检测抑 菌活性。

2、检测

经甲醇诱导120h时，样品的抑菌活性高达2000IU/ml，抑菌圈直径达到 17mm。

实验结果说明，采用本发明工程菌发酵得到的发酵产物的抑菌活性高， 安全，营养价值高，可用于制备抗菌饲料添加剂。

本发明通过对天然猪防御素基因的改造，用基因工程的方法重组表达得 到了具有高抑菌活性的猪防御素，其可以用于制备抗菌药物；采用本发明工 程菌表达得到的发酵产物抗菌活性高，安全，营养价值高，可用于制备抗菌 饲料添加剂，工艺步骤简单，成本低廉，应用前景良好。