一种检测EGFR基因外显子20 T790M点突变的试剂盒和方法

摘要

本发明涉及分子生物学领域，具体为一种检测人表皮生长因子受体基因EGFR外显子20上T790M点突变的方法；以数字PCR为平台，在反应体系中加入PCR引物和TaqMan探针，利用两条标记不同类型荧光的TaqMan探针对野生和突变DNA模板进行检测；根据荧光类型判断样品中DNA模板的类型及其数量和比例。

说明书

技术领域

本发明涉及生物学领域和核酸检测领域，具体为检测表皮生长因子受体EGFR基因外显子20上T790M点突变的方法。 

背景技术

随着个体化医疗观念的不断深入，检测特定基因突变可以给医生的个体化诊疗提供靶向用药的参考。受体酪氨酸激酶抑制剂（TKI）是近年来肺部肿瘤治疗的热点靶向药物，与传统放化疗药物相比，可明显延长肿瘤患者生存期，改善生存质量。 

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)酪氨酸激酶区域发生突变，可使酪氨酸激酶抑制剂治疗晚期非小细胞肺癌的有效率达到80%以上。由于EGFR基因突变是一种体细胞遗传突变，迄今为止的资料证明此类突变仅发生在癌细胞中，正常组织细胞均属于无突变的野生型。 

EGFR蛋白酪氨酸激酶功能区由EGFR基因外显子18-24编码，其中外显子18-20编码N-Lobe，外显子21～24编码C-Lobe。迄今为止发现的EGFR突变主要位于外显子19至21。 

外显子20上的T790M突变是目前较为认可的耐药机制之一，通常是替代的点突变，2669位点上的C突变为T。 

目前基因变异的检测技术主要有直接测序法（亦称Sanger测序法）和ARMS法。现分别简介于下： 

Sanger测序法，即Sanger（桑格）双脱氧链终止法是Frederick Sanger于1975年发明的。测序过程需要先做一个聚合酶链式反应（PCR）。PCR过程中，双脱氧核糖核苷酸可能随机的被加入到正在合成中的DNA片段里。由于双脱氧核糖核苷酸多脱了一个氧原子，一旦它被加入到DNA链上，这个DNA 链就不能继续增加长度。最终的结果是获得所有可能获得的、不同长度的DNA片段。目前最普遍最先进的方法，是将双脱氧核糖核苷酸进行不同荧光标记。将PCR反应获得的总DNA通过毛细管电泳分离，跑到最末端的DNA就可以在激光的作用下发出荧光。由于ddATP,ddGTP,ddCTP,ddTTP（4种双脱氧核糖核苷酸）荧光标记不同，计算机可以自动根据颜色判断该位置上碱基究竟是A，T，G，C中的哪一个。直接测序法耗时长(一般需2－3天)且灵敏度低，仅能检出突变比例在10%～20%以上的突变。 

ARMS法也称扩增阻碍突变系统（Amplification Refractory Mutation System，ARMS）、等位基因特性PCR（Allele Specific PCR，ASPCR）等，即等位基因特异性扩增法（Allele Specific Amplification，ASA）建立于1989年，是PCR技术应用的发展。 

ARMS法主要用于对已知突变基因进行检测。利用PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，首先设计两个5’端引物，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补。对于纯合性突变，分别加入这两种引物及下游3’端引物进行两个平行PCR，只有与突变DNA完互补的引物才可延伸并得到PCR扩增产物。如果错配位于上游5’端引物的3’端，则引物与模板DNA不配对，导致PCR不能延伸，因此这种方法称为ARMS，可选择性地扩增突变型DNA模板。 

上述现有技术存在以下问题： 

1.均为定性检测，也就是说只能给出基因变异是否存在的结论。但无法测定携带基因变异的DNA量的比例，也就是说难以进行定量检测。 

2.均给出模拟图结果，需要人工进行判读，判读方面相对比较主观。无法直接得到数字化的客观结果。 

3.灵敏度比较差，目前方法的灵敏最好为1%，无法满足某些特定的临床检测需求。 

目前的检测一般需要通过有创性组织活检，且不易重复获取。研究表明，在血液、胸腔积液、唾液、粪便等样本中，会有少量混杂于大量野生型基因组DNA中的突变肿瘤细胞DNA。从这些低含量样本中检测突变的基因，需要找一种灵敏性高、特异性强、简便易行、结果判定简单的突变检测方法。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测EGFR基因外显子20T790M点突变的PCR扩增引物、TaqMan探针及试剂盒和检测方法。 

数字PCR是一种核酸分子绝对定量方法，基于单分子PCR方法来进行计数，主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。 

本发明以数字PCR为平台，在反应体系中加入PCR引物和TaqMan探针，利用两条不同的TaqMan探针（标记不同类型荧光）对野生和突变DNA模板进行检测；根据荧光类型判断样品中DNA模板的类型。 

一种基于数字PCR平台检测EGFR基因外显子20T790M点突变的PCR引物，其特征在于，为反向引物和正向引物； 

正向引物含有以下核苷酸序列（SEQ ID No.1～5）之一： 

F1:5’-TCTGCCTCACCTCCACCG-3’， 

F2:5’-TGCCTCACCTCCACCGTG-3’， 

F3:5’-CCTCACCTCCACCGTGCA-3’， 

F4:5’-TCACCTCCACCGTGCAGC-3’， 

F5:5’-ACCTCCACCGTGCAGCTC-3’； 

反向引物含有以下核苷酸序列（SEQ ID No.6～10）之一： 

R1:5’-AGGCAGCCGAAGGGCA-3’， 

R2:5’-GGAGGCAGCCGAAGGG-3’， 

R3:5’-CAGGAGGCAGCCGAAG-3’， 

R4:5’-TCCAGGAGGCAGCCGA-3’， 

R5:5’-AGTCCAGGAGGCAGCC-3’。 

优选的，正向引物为SEQ ID No.1～5之一的核苷酸序列；反向引物为SEQ ID No.6～10之一的核苷酸序列。 

更优选的，PCR引物选自以下各组序列之一： 

（1）正向F1:5’-TCTGCCTCACCTCCACCG-3’， 

反向R1:5’-AGGCAGCCGAAGGGCA-3’；或者， 

（2）正向F1:5’-TCTGCCTCACCTCCACCG-3’， 

反向R3:5’-CAGGAGGCAGCCGAAG-3’；或者， 

（3）正向F3:5’-CCTCACCTCCACCGTGCA-3’， 

反向R3:5’-CAGGAGGCAGCCGAAG-3’；或者， 

（4）正向F4:5’-TCACCTCCACCGTGCAGC-3’， 

反向R4:5’-TCCAGGAGGCAGCCGA-3’；或者， 

（5）正向F4:5’-TCACCTCCACCGTGCAGC-3’， 

反向R5:5’-AGTCCAGGAGGCAGCC-3’。 

一种基于数字PCR平台检测EGFR基因外显子20T790M点突变的TaqMan探针，包括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针（PM），或者包括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针（PM）以及与野生型DNA模板结合的TaqMan探针（PW）；两者均为为连接荧光基团和猝灭基团的核苷酸，且所含的荧光基团的种类不同。 

与突变型DNA模板结合的TaqMan探针的核苷酸部分含有以下核苷酸序列（SEQ ID No.11～15）中的一种： 

PM1:5’-AGCTGCATGATGA-3’， 

PM2:5’-GAGCTGCATGATG-3’， 

PM3:5’-TGAGCTGCATGAT-3’， 

PM4:5’-GCTGCATGATGAG-3’， 

PM5:5’-CTGCATGATGAGC-3’。 

优选的，所述与突变型DNA模板结合的TaqMan探针核苷酸部分选自SEQ ID No.11～15中的一种。 

所述与野生型DNA模板结合的TaqMan探针核苷酸部分含有以下核苷酸序列（SEQ ID No.16～20）中的一种： 

PW1:5’-AGCTGCGTGATGA-3’， 

PW2:5’-GAGCTGCGTGATG-3’， 

PW3:5’-TGAGCTGCGTGAT-3’， 

PW4:5’-GCTGCGTGATGAG-3’， 

PW5:5’-CTGCGTGATGAGC-3’。 

优选的，所述与野生型DNA模板结合的TaqMan探针核苷酸部分选自SEQ ID No.16～20中的一种。 

TaqMan探针的荧光基团选自FAM（6-羧基荧光素）、HEX（六氯-6-羧基荧光素）、Cy5（美国Life Technologies）、Cy3（美国Life Technologies）、VIC（美国Life Technologies），荧光猝灭基团选自TAMARA（6-羧基四甲基若丹明）、BHQ1（美国Life Technologies）、BHQ2（美国Life Technologies）或MGB（美国Life Technologies）。 

上述的TaqMan探针和PCR引物可以用于制备试剂盒，基于数字PCR平台用来检测EGFR外显子20上T790M点突变，为靶向治疗筛选患者提供参考，也可用于癌症患者，特别是肺癌患者的高灵敏度早期复发监测，以及用药期间耐药性突变监测。 

一种基于数字PCR平台检测EGFR基因外显子20T790M点突变的试剂盒，含有以下物质中的至少一种： 

（1）前述的PCR引物； 

（2）前述的TaqMan探针。 

上述引物和探针是针对EGFR外显子20上L58R点突变设计优化的，这种试剂盒可基于数字PCR平台来检测EGFR外显子20上T790M点突变。 

本发明检测EGFR外显子20上T790M点突变的方法，步骤包括： 

1.将待测样品DNA模板、PCR引物、TaqMan探针以及PCR预混液混合，制备得到数字PCR混合液；数字PCR混合液中所含的DNA模板、PCR引物及TaqMan探针含量如下： 

a.DNA模板，含量为0.25～1ng/μL，优选为0.5ng/μL； 

b.PCR引物，包括正向引物和反向引物，含量分别为500～700nM，优选为600nM； 

c.TaqMan探针，包括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针，含量为200～400nM，优选为300nM；或者，包括与突变型DNA模板结合的TaqMan 探针以及与野生型DNA模板结合的TaqMan探针，含量分别为200～400nM，优选为300nM。 

其中PCR引物包括正向引物和反向引物，正向引物含有以下核苷酸序列（SEQ ID No.1～5）之一： 

F1:5’-TCTGCCTCACCTCCACCG-3’， 

F2:5’-TGCCTCACCTCCACCGTG-3’， 

F3:5’-CCTCACCTCCACCGTGCA-3’， 

F4:5’-TCACCTCCACCGTGCAGC-3’， 

F5:5’-ACCTCCACCGTGCAGCTC-3’。 

反向PCR引物含有以下核苷酸序列（SEQ ID No.5～10）之一： 

R1:5’-AGGCAGCCGAAGGGCA-3’， 

R2:5’-GGAGGCAGCCGAAGGG-3’， 

R3:5’-CAGGAGGCAGCCGAAG-3’， 

R4:5’-TCCAGGAGGCAGCCGA-3’， 

R5:5’-AGTCCAGGAGGCAGCC-3’。 

优选的，正向引物选自SEQ ID No.1～5之一的核苷酸序列，反向引物选自SEQ ID No.5～10之一的核苷酸序列； 

更优选的，PCR引物选自以下各组序列之一： 

（1）正向F1:5’-TCTGCCTCACCTCCACCG-3’， 

反向R1:5’-AGGCAGCCGAAGGGCA-3’；或者， 

（2）正向F1:5’-TCTGCCTCACCTCCACCG-3’， 

反向R3:5’-CAGGAGGCAGCCGAAG-3’；或者， 

（3）正向F3:5’-CCTCACCTCCACCGTGCA-3’ 

反向R3:5’-CAGGAGGCAGCCGAAG-3’；或者， 

（4）正向F4:5’-TCACCTCCACCGTGCAGC-3’， 

反向R4:5’-TCCAGGAGGCAGCCGA-3’；或者， 

（5）正向F4:5’-TCACCTCCACCGTGCAGC-3’， 

反向R5:5’-AGTCCAGGAGGCAGCC-3’。 

Taqman探针包括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针（PM），或者包 括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针（PM）以及与野生型DNA模板结合的TaqMan探针（PW）；两者均为连接荧光基团和猝灭基团的核苷酸，而且所含荧光基团的类型不同。 

与突变型DNA模板结合的Taqman探针核苷酸部分含有以下核苷酸序列（SEQ ID No.11～15）之一： 

PM1:5’-AGCTGCATGATGA-3’， 

PM2:5’-GAGCTGCATGATG-3’， 

PM3:5’-TGAGCTGCATGAT-3’， 

PM4:5’-GCTGCATGATGAG-3’， 

PM5:5’-CTGCATGATGAGC-3’。 

其中与野生型DNA模板结合的Taqman探针的核苷酸部分含有以下核苷酸序列（SEQ ID No.16～20）之一： 

PW1:5’-AGCTGCGTGATGA-3’， 

PW2:5’-GAGCTGCGTGATG-3’， 

PW3:5’-TGAGCTGCGTGAT-3’， 

PW4:5’-GCTGCGTGATGAG-3’， 

PW5:5’-CTGCGTGATGAGC-3’。 

TaqMan探针上的荧光基团选自FAM（6-羧基荧光素）、HEX（六氯-6-羧基荧光素）、Cy5（美国Life Technologies）、Cy3（美国Life Technologies）、VIC（美国Life Technologies），荧光猝灭基团选自TAMARA（6-羧基四甲基若丹明）、BHQ1（美国Life Technologies）、BHQ2（美国Life Technologies）或MGB（美国Life Technologies）。 

优选的，与突变型DNA模板结合的TaqMan探针核苷酸部分选自SEQ ID No.11～15中的一种，与野生型DNA模板结合的TaqMan探针核苷酸部分选自SEQ ID No.16～20中的一种。 

2.数字PCR混合液制作PCR微反应液滴，再进行PCR扩增反应，条件为：93～97℃预变性3～15分钟；93～97℃变性5～50秒，65～75℃退火5～50秒，55～65℃延伸10～65秒，共进行20～60个循环，2～10℃终止反应； 

优选的PCR扩增条件为，93.5～95℃预变性3～6分钟；93.5～95℃变性8～15秒，64.5～66℃退火8～15秒，55～57℃延伸40～50秒，共进行30～35个循环，6～10℃终止反应。 

更优选的PCR扩增条件为，94℃预变性5分钟；94℃变性10秒，65℃退火10秒，56℃延伸45秒，共进行32个循环，10℃终止反应。 

优选的，数字PCR混合液制作PCR微反应液滴的方法为，将数字PCR混合液加入微滴发生器，生成10000～20000个微反应液滴。 

3.PCR扩增反应后的产物进行信号收集，根据荧光类型判断待测样品中是否含有EGFR基因外显子20T790M点突变的DNA模板，还可确定其中EGFR基因外显子20T790M点突变的DNA模板的数量和含量。 

可用QuantaSoft（Biorad）软件进行数据分析，计算样品中发生突变的拷贝数和含量，确定突变DNA样本的比例。 

通过上述方法，可以检测位于c.2573的EGFR外显子20上T790M点突变。 

与现有技术比较，本发明的优点在于： 

1.结果判读方式：以前的技术方法结果的判读需要人工参与，肉眼依据相关图形作出最后的判断，这种判读的方式严重依赖经验，速度慢且很容易产生假阳性和假阴性的判读结果。我们的技术方式给出的是数据信息，可以借助软件完全自动化的进行结果判读，从而加快了数据分析的速度，也减少了产生假阴性和假阳性判读的可能。 

2.结果描述的方式：以前的技术方式对基因变异的描述是定性的方式，也就是说，只是描述某个特异的基因变异是否存在于检测样本。本技术方法对基因变异的描述是绝对定量的方式，可以给出样本所携带某种特异基因变异DNA的绝对数量和比例。而且准确率高，即使在突变样本含量极低的情况下，定量分析的误差也很小。 

3.检测灵敏度（数值越小灵敏度越好）：以前技术方法的灵敏度一般在1％－50％之间，而我们提出的技术方法对基因变异的检测灵敏度提升非常明显，能达到1/2500。可以在非常高背景的野生DNA中检测出极其微量的携带基因变异的DNA。 

附图说明

图1为实施例1中，不同含量突变样本的荧光检测结果。 

具体实施方式

以下实施例是对本发明的更详细说明，而不是对本发明范围的限定。 

所用基因序列的来源为NCBI(美国国立生物技术信息中心)： 

（1）准备样品：含有野生型EGFR基因的DNA、EGFR外显子20上T790M点突变的突变阳性DNA以及野生型与突变DNA混合样本（其中突变体与野生型的含量比分别为1/100、1/1000、1/2500）。DNA来源可以是血清、血浆、外周血、口腔黏膜、胸腔积液、体液或者组织等。其中，突变DNA模板来源于携带EGFR外显子20上T790M点替换突变的细胞系（经PCR测序鉴定），其中突变的位点在EGFR外显子20上c.2369位（C变为T）。 

（2）室温融解PCR引物及对应TaqMan探针。 

正向和反向PCR引物的序列为： 

正向F1:5’-TCTGCCTCACCTCCACCG-3’ 

反向R1:5’-AGGCAGCCGAAGGGCA-3’ 

TaqMan探针的序列为： 

与野生型DNA结合的TaqMan探针PW1上连接的荧光基团和猝灭基团为VIC和MGB，其核苷酸部分序列为：PW3:5’-TGAGCTGCGTGAT-3’。 

与突变型DNA结合的TaqMan探针PM1上连接的荧光基团和猝灭基团为FAM和MGB，其核苷酸部分序列为：PM4:5’-GCTGCATGATGAG-3’。 

（3）按照以下配比制备PCR反应液：2×数字PCR预混液（Biorad，#186-3022）与正向及反向PCR引物、与野生型DNA模板结合的TaqMan探针、与突变型DNA模板结合的TaqMan探针及与待检测DNA（10ng）混合，用蒸馏水补足至终体积为20μL，配制成数字PCR混合液。其中正向及反向PCR引物含量分别为600nM，与野生型DNA模板结合的TaqMan探针以及与突变型DNA模板结合的TaqMan探针分别为300nM。 

（4）配制好的20μL数字PCR混合液加入到8-道的液滴制作板内，然后加入60μL液滴制作油到制作板用于制备PCR微反应液滴（QX200微滴发生器）。 

（5）将制备好的PCR微反应液滴转移至96孔反应板，并用封板膜进行热封，生成的微反应液滴数量为10000～20000个。 

（6）将96孔PCR板放入PCR仪按照下面条件进行扩增反应： 

94℃预变性5分钟；94℃变性10秒，65℃退火10秒，56℃延伸45秒，共进行32个循环，10℃终止反应。 

（7）PCR扩增反应后将PCR反应板放置于PCR微反应液滴信号读取仪（QX200微滴荧光信号收集系统）中进行信号收集，检测FAM和VIC的荧光信号，用QuantaSoft（Biorad）软件进行数据分析，结果如图1。可进行定量分析，得出样本中突变DNA的绝对含量以及相对总DNA的比例。 

突变体与野生型的含量不同的样品检测结果中，突变阳性信号数（FAM）与总信号数（FAM和VIC）如下： 

1/1样品5365/10756，计算值突变/野生=0.995/1，误差0.5% 

1/100样品105/10564，计算值突变/野生=0.010/1 

1/1000样品21/19691，计算值突变/野生=0.00107/1，误差7% 

1/2500样品7/17523，计算值突变/野生=0.000399/1 

以上述方法，可以检测位于c.2573的EGFR外显子20上T790M点突变，检出限达到1/2500。 

使用以下各组之一的PCR引物时，按照上述步骤检测，结果相同，在突变样本含量1/2500的情况下也能检出，并且突变型DNA模板与野生型DNA模板比例为1/1～1/100时，定量检测误差一般低于2%。 

（1）正向F1:5’-TCTGCCTCACCTCCACCG-3’ 

反向R3:5’-CAGGAGGCAGCCGAAG-3’ 

（2）正向F3:5’-CCTCACCTCCACCGTGCA-3’ 

反向R3:5’-CAGGAGGCAGCCGAAG-3’ 

（3）正向F4:5’-TCACCTCCACCGTGCAGC-3’ 

反向R4:5’-TCCAGGAGGCAGCCGA-3’ 

（4）正向F4:5’-TCACCTCCACCGTGCAGC-3’， 

反向R5:5’-AGTCCAGGAGGCAGCC-3’。 

使用的TaqMan探针的核苷酸部分改为以下各组序列之一时，按照上述步骤检测，结果相同，在突变样本含量1/2500的情况下也能检出，并且突变型DNA模板与野生型DNA模板比例为1/1～1/100时，定量检测误差一般低于2%。 

（1）PM5:5’-CTGCATGATGAGC-3’ 

PW5:5’-CTGCGTGATGAGC-3’； 

（2）PM2:5’-GAGCTGCATGATG-3’， 

PW2:5’-GAGCTGCGTGATG-3’。 

对照例 

一、使用不同的使用PCR引物、TaqMan探针序列 

1、按照实施例1的方法，区别在于使用不同的PCR引物。 

正向和反向PCR引物的序列为（按荧光定量PCR技术设计）： 

F2:5’-TGCCTCACCTCCACCGTG-3’ 

R5:5’-AGTCCAGGAGGCAGCC-3’ 

在突变样本含量为1/100时有检出结果，突变样本含量为1/1000时，约三分之一样本有检出结果；突变样本含量为1/2500时不能检出。 

2、使用不同的TaqMan探针。 

TaqMan探针的序列为（按荧光定量PCR技术设计）： 

PM1:5’-AGCTGCATGATGA-3’ 

PW1:5’-AGCTGCGTGATGA-3’ 

在突变样本含量为1/100时有检出结果，突变样本含量为1/1000时，约三分之一样本有检出结果；突变样本含量为1/2500时不能检出。突变样本含量为1/100的样品进行定量检测，误差为15%以上。 

二、使用不同浓度的PCR引物和探针 

1、按照实施例1的方法，区别在于，数字PCR混合液中PCR正向和反向引物的浓度分别为60nM。此时仅当突变含量为1/100时可检出突变，突变样本含量为1/1000和1/2500时均无法检出突变。 

2、按照实施例1的方法，区别在于，数字PCR混合液中PCR正向和反向引物的浓度分别为60nM，两种TaqMan探针的浓度分别为60nM，仅当突变 含量为1/100时可检出突变，突变样本含量为1/1000和1/2500时均无法检出突变。 

三、使用荧光定量PCR的方法检测，检出限为1/100，而且在突变样本含量大于1%的情况下，定量分析的误差大于10%。