重金属诱导启动子在培育土壤重金属污染预警转基因植物中的应用

摘要

本发明公开了重金属诱导启动子在培育土壤重金属污染预警转基因植物中的应用。该应用采用红色荧光蛋白基因表达盒培育土壤重金属污染预警转基因植物，所述红色荧光蛋白基因表达盒是在宿主细胞中表达红色荧光蛋白基因的DNA分子，所述红色荧光蛋白基因表达盒包括所述红色荧光蛋白基因、启动所述红色荧光蛋白基因转录的启动子和终止所述红色荧光蛋白基因转录的终止子；所述启动子是AtMT1a，所述AtMT1a是核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子。用该红色荧光蛋白基因表达盒培育的土壤重金属污染预警转基因拟南芥能够在环境存在10μmol/L以上镉离子的条件下，激发出红色荧光。

说明书

技术领域

本发明涉及重金属诱导启动子在培育土壤重金属污染预警转基因植物中的应用。

背景技术

在植物转基因技术中，要高效表达目的基因，离不开高效的启动子。启动子 (Promoter)是指DNA序列上被RNA聚合酶识别并形成转录起始复合物的区域。启动子 通常位于基因上游，是控制基因转录起始的序列，并决定着某一基因的表达强度。开 发强启动子对转基因作物的培育具有重要意义。在植物基因工程中，常用的启动子可 分为三类：组成型启动子、诱导型启动子和组织特异性启动子。组成型启动子在所有 组织中都启动基因表达，具有持续性，不表现时空特异性，RNA和蛋白质表达量也是 相对恒定的。此类代表性启动子有烟草花叶病毒CaMV35S启动子、玉米泛素基因 Ubiquitin启动子和水稻肌动蛋白基因Actin启动子等。诱导型启动子的特点是，在 正常情况下不能启动基因的表达，但受某些物理、化学、生物信号的刺激后，此类型 的启动子可以大幅度地提高基因的转录水平，如拟南芥低温诱导启动子rd29A。组织特 异性启动子的特点是，其下游调控基因的表达往往只发生在某些特定的器官和组织， 并往往表现发育调节的特性，如烟草花粉绒毡层细胞中特异表达基因启动子TA29。

然而组成型启动子在实际应用中存在诸多问题，其一，组成型启动子可来源于病 毒、微生物或动物(如CaMV35S启动子来源于病毒)，从生物安全角度考虑，其在一 定程度上影响了转基因作物的推广。其二，近来研究表明组成型启动子由于在植物体 内超量表达目的基因，消耗细胞内更多的物质与能量，在增强植物目标抗性的同时， 却严重影响植物正常生长发育(如转基因小麦、水稻、拟南芥表现出植株矮化、生长 延迟等症状)。其三，由于组成型启动子没有器官和组织表达的特异性，会造成基因 表达的有毒产物(如Bt毒蛋白)在作物籽粒(或可食用部位)中生成，这是组成型启 动子另一个生物安全隐患。随着转基因技术的发展，亟待开发更多高效的诱导型启动 子或组织特异性启动子启动子。因此直接从植物克隆高效表达的新启动子具有重要的 应用价值。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是提供能用于培育土壤重金属污染预警转基因植 物的红色荧光蛋白基因表达盒。

本发明所提供的红色荧光蛋白基因表达盒是在宿主细胞中表达红色荧光蛋白基因 的DNA分子，所述红色荧光蛋白基因表达盒包括所述红色荧光蛋白基因、启动所述红 色荧光蛋白基因转录的启动子和终止所述红色荧光蛋白基因转录的终止子；其中，所 述启动子是AtMT1a，所述AtMT1a是如下A1)、A2)或A3)的DNA分子：

A1)核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子；

A2)与A1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上一致性，且具有启动子功能的 DNA分子；

A3)在高严谨条件下与A1)或A2)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的 DNA分子。

上述红色荧光蛋白基因表达盒中，所述红色荧光蛋白基因编码B1)或B2)的红色 荧光蛋白：

B1)由SEQ ID No.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

B2)将SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺 失和/或添加且在紫外光激发下发射红色荧光的蛋白质。

其中，SEQ ID No.4由225个氨基酸残基组成。

上述红色荧光蛋白基因表达盒中，所述红色荧光蛋白基因可为如下C1)、C2)或 C3)的DNA分子：

C1)编码序列是SEQ ID No.2的第9-686位所示的DNA分子；

C2)在严格条件下与C1)限定的DNA分子杂交且编码所述红色荧光蛋白的DNA分 子；

C3)与C1)或C2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述红色荧光 蛋白的DNA分子。

上述红色荧光蛋白基因表达盒具体可为SEQ ID No.3所示的DNA分子。

AtMT1a启动子或所述红色荧光蛋白基因表达盒在培育土壤重金属污染预警转基 因植物中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供培育土壤重金属污染预警转基因植物的 方法。

本发明所提供的培育土壤重金属污染预警转基因植物的方法，包括将报告蛋白基 因表达盒导入受体植物，得到土壤重金属污染预警转基因植物；所述报告蛋白基因表 达盒包括所述报告蛋白基因、启动所述报告蛋白基因转录的启动子和终止所述报告蛋 白基因转录的终止子；其特征在于：所述启动子是AtMT1a，所述AtMT1a是如下A1)、 A2)或A3)的DNA分子：

A1)核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子；

A2)与A1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上一致性，且具有启动子功能的 DNA分子；

A3)在高严谨条件下与A1)或A2)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的 DNA分子。

上述方法中，所述报告蛋白基因表达盒具体可为所述红色荧光蛋白基因表达盒。

上文中，所述重金属可为二价重金属离子。所述二价重金属离子可为Cd²⁺、Cu²⁺和/或Zn²⁺。

上文中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物，所述双子叶植物可为十字花科 植物，如拟南芥。

所述转基因植物理解为不仅包含将AtMT1a启动子转化目的植物得到的第一代 转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也 可用常规育种技术将该AtMT1a启动子转移进入相同物种的其它品种，特别包括商 业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

实验证明，用含有由AtMT1a启动子驱动红色荧光蛋白基因表达的红色荧光蛋白 基因表达盒培育的土壤重金属污染预警转基因拟南芥能够在环境存在10μmol/L以上 镉离子的条件下，激发出红色荧光。当土壤受到重金属(如镉离子)污染时，本发明 培育的土壤重金属污染预警转基因植物中的AtMT1a启动子能够启动红色荧光蛋白基 因的表达，让植株立即发出红色荧光，可以根据植株发出的红色荧光，预警土壤已经 受到重金属(如镉离子)的污染。

附图说明

图1为AtMT1a启动子的PCR扩增产物电泳图谱。

图中，M,Marker III；1,AtMT1a启动子的PCR扩增产物。

图2为pCAMBIA1381-AtMT1a–GUS的构建流程示意图。

图3为拟南芥的遗传转化体系。

图3中，A,拟南芥的种植；B,开花的拟南芥；C,农杆菌侵染过的拟南芥。

图4为转pCAMBIA1381-AtMT1a–GUS T₃代拟南芥的GUS组织特异性分析。

图4中，a-j分别为生长1天、3天、5天、10天、10天、15天、15天、20天、 20天、20天的转pCAMBIA1381-AtMT1a–GUS T₃代拟南芥,k为对照—转pCAMBIA1381 T₃代拟南芥。

图5为pBI-AtMT1a-RFP的构建流程图。

图6为转pBI-AtMT1a-RFP T₁代拟南芥幼苗在含卡那霉素的筛选培养基中的生长 照片。

图7为卡那霉素阳性的转pBI-AtMT1a-RFP T₁代拟南芥植株的PCR检测结果。

图7中，CK为pBI-AtMT1a-RFP(阳性对照)，1-20为20株卡那霉素阳性的转 pBI-AtMT1a-RFP T₁代拟南芥的株系编号。

图8为转pBI-AtMT1a-RFP T₂代拟南芥的Northern检测。

图9为不同镉浓度下line-1株系转pBI-AtMT1a-RFP T₃代拟南芥叶片激光共聚焦 显微镜照片。图9中，a、b、c分别为10μmol/L Cd处理组、20μmol/L Cd处理组和 100μmol/L Cd处理组的拟南芥叶片，scale bars为30μm；d,e分别为10μmol/L Cd 处理组和20μmol/L Cd处理组的拟南芥叶片，scale bars为5μm；f为0μmol/L Cd 处理组的拟南芥叶片。

图10为0μmol/L Cd处理组的line-1株系转pBI-AtMT1a-RFP T₃代拟南芥根激光 共聚焦显微镜照片。scale bars为50μm。

图11为10μmol/L Cd处理组的line-1株系转pBI-AtMT1a-RFP T₃代拟南芥根激 光共聚焦显微镜照片。scale bars为50μm。

图12为10μmol/L Cd处理组的line-4株系转pBI-AtMT1a-RFP T₃代拟南芥根激 光共聚焦显微镜照片。scale bars为50μm。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。在不背离本发明 精神和实质的情况下，对本发明的方法、步骤或条件所作的修改或替换均属于本发明 的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

下述实施例中常用的分子生物学试剂为TAKARA公司产品。

下述实施例中的植物表达载体pBI-121(即Clontech公司的pBI121)(孙静文等. 苋菜AmPCS基因的克隆及表达载体构建.华北农学报.2012.27(2)：44-49)，公众可从 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关 实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的根癌农杆菌LBA4404(上海鼎国生物技术有限公司，产品编号： MCC027-1)。

下述实施例中的Ler生态型拟南芥(Arabidopsis thaliana.Landsberg erecta) (李延红.ABI1和GPA1在拟南芥生长发育中的作用.安徽农业科学.2006，34(18)： 4507-4512)公众可从中国农业科学院农业资源与农业区划研究所获得，该生物材料只 为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的pCAMBIA1381(上海浩然生物技术有限公司，产品编号： MGT-M1702-C020)。

下述实施例中的MS培养基的溶剂是水、溶质如表1所示。1/2MS培养基是将MS 培养基的大量元素、微量元素和蔗糖浓度均减半，其它组分不变的基本培养基。1/2MS 液体培养基是将1/2MS培养基中的琼脂去除，其它组分和浓度不变得到的培养基。下 述实施例中的MS培养基、1/2MS培养基、1/2MS液体培养基、1/2MS+10μmol/L Cd²⁺ 培养基、1/2MS+20μmol/L Cd²⁺培养基和1/2MS+100μmol/L Cd²⁺培养基的pH均为5.8。

表1.MS培养基的溶质

实施例1、重金属诱导型启动子AtMT1a启动子的克隆及其功能验证

1、AtMT1a启动子的克隆

以Ler生态型拟南芥叶片的基因组DNA为模板，用P1：5′-ATGGATCCCATAGTTACG TAATCTTAAC-3′和P2：5′-GCACTAGTCCGCAAGTTTTAGTTACGTA-3′作为引物进行PCR 扩增，电泳检测PCR扩增产物，结果表明该PCR扩增产物大小为1200bp左右(图1)。 将该PCR扩增产物与pMD19-T克隆载体(TAKARA公司)连接后测序。将测序结果表明 含有SEQ ID No.1的第1-1140位所示的DNA分子的重组载体命名为pMD19-AtMT1a。 其中，SEQ ID No.1由1140个核苷酸组成，为AtMT1a启动子的核苷酸序列。

2、AtMT1a启动子的功能验证

2.1含有AtMT1a启动子GUS基因重组表达载体pCAMBIA1381-AtMT1a–GUS的构建

用BamHI和SpeI两个限制性内切酶同时酶切植物表达载体pCAMBIA1381和 pMD19-AtMT1a，回收AtMT1a启动子片段和载体大片段用T₄DNA连接酶连接，将AtMT1a 启动子连入pCAMBIA1381载体的酶切位点，得到由AtMT1a启动子启动GUS基因转录的 重组表达载体pCAMBIA1381-AtMT1a–GUS。经测序证实，pCAMBIA1381-AtMT1a–GUS 为用SEQ ID No.1的第1-1140位所示的AtMT1a启动子替换pCAMBIA1381的BamHI和 SpeI位点之间片段，保持pCAMBIA1381其它序列不变得到的GUS基因重组表达载体。 pCAMBIA1381-AtMT1a–GUS携带潮酶素抗性，其构建流程示意图如图2所示。

2.2pCAMBIA1381-AtMT1a–GUS转化拟南芥

取1μg重组质粒pCAMBIA1381-AtMT1a–GUS加到根癌农杆菌LBA4404感受态细胞 中，冰浴30分钟，液氮中冻8分钟(5-8分钟)，37℃热激5分钟；加1ml YEP(含50mg/L rif，28℃，200rpm振荡培养约4小时，5000rpm，2分钟；弃上清900μl，剩余的菌液 用吸头悬浮，移到YEP平板(含50mg/L rif，100mg/L Km)上涂菌。28℃，培养2-3天， 挑选阳性克隆鉴定，获得含有pCAMBIA1381-AtMT1a–GUS表达载体的重组农杆菌，命名 为LBA4404/pCAMBIA1381-AtMT1a–GUS，用作遗传转化拟南芥的侵染细菌。

采用经典的沾花方法(Clough和Bent，1998)对Ler生态型拟南芥进行遗传转 化。根据转化植株数量在一定体积LB(50μg/μl卡那霉素、50μg/μl庆大霉素) 培养液中加入LBA4404/pCAMBIA1381-AtMT1a–GUS菌液(100ml/6株)，28℃摇菌24hr 至OD600约为0.5。离心、收集LBA4404/pCAMBIA1381-AtMT1a–GUS，并在MS(3％蔗 糖)中重新悬浮至OD600约为0.8。在转化前，在LBA4404/pCAMBIA1381-AtMT1a–GUS 菌液中加入0.005％的Silwet L-77，并去掉植物上已经开放的花朵和果荚。将整个植 株浸入菌液15min，并在黑暗、潮湿的环境中放置16～24小时，然后继续正常培养， 并在一周后再次转化。种子成熟后停止浇水，大约一个月以后收获种子。收集 pCAMBIA1381-AtMT1a–GUS转化当代(T₀代)拟南芥植株所结的T₁代的种子(图3)，得 到转pCAMBIA1381-AtMT1a–GUS T₁代拟南芥种子。

取转pCAMBIA1381-AtMT1a–GUS T₁代拟南芥种子铺在筛选培养基(1/2MS+50μ g/ml潮霉素)上中培养1周左右，选择根部可正常生长的植株移栽于花盆中，22℃ 温室中培养，去除顶芽以促进侧芽生长。培养一段时间后取叶片小量提取基因组DNA， 用PCR方法鉴定阳性植株。收取阳性小苗(用引物对P1和P2可得到1200bp左右的PCR 扩增产物)的种子，并编号。继续对收获的转pCAMBIA1381-AtMT1a–GUS T₂代拟南芥 种子进行筛选，获得转pCAMBIA1381-AtMT1a–GUS T₃代拟南芥种子，用于下一步启动 子功能鉴定。按照上述相同方法，用pCAMBIA1381转化Ler生态型拟南芥，得到转 pCAMBIA1381T₃代拟南芥种子，作为空载体对照。

2.3pCAMBIA1381-AtMT1a–GUS转化拟南芥的组织化学定位

实验重复三次，每次重复将转pCAMBIA1381-AtMT1a–GUS T₃代拟南芥种子、转 pCAMBIA1381T₃代拟南芥种子和Ler生态型拟南芥种子这三个株系分别种于筛选培养 基(1/2MS+50μg/ml潮霉素)上，每个株系分别设置如下10种处理：分别培养1天 (图4中a)、3天(图4中b)、5天(图4中c)、10天(图4中d)、10天(图4中e)、 15天(图4中f)、15天(图4中g)、20天(图4中h)、20天(图4中i)和20天(图4 中j)。将每个株系每种处理的植株均分为两组-Cd²⁺诱导组和水处理组，每组5株。将 Cd²⁺诱导组和水处理组的植株分别取出，将Cd²⁺诱导组植株的根系均置于100μM CdCl₂水溶液中24小时进行Cd²⁺诱导，将水处理组植株的根系均置于水中24小时作为没有经过 Cd²⁺诱导的对照，然后取出Cd²⁺诱导组和水处理组的植株均分别转入GUS染色液，使材 料和GUS染色液的体积比为1:5。放入37℃恒温箱中温育过夜。待GUS渗入材料中后， 材料转入透明液中透明，以脱去叶绿素，放置于室温下3-5小时，直到绿色完全去除。 经透明处理后的植物材料在解剖镜下观察，有GUS表达的部位显现稳定、不溶于透明 液的蓝色，解剖镜上接数码相机照相，用来采集相片。以不同发育时期植株的各种器 官为材料，进行GUS组织化学染色分析AtMT1a启动子组织表达特异性如下：结果表明 经过Cd²⁺诱导和没有经过Cd²⁺诱导的各个生长期的所有转pCAMBIA1381空载体T₃代拟南 芥和Ler生态型拟南芥植株的所有器官中均没有检测到GUS基因表达(图4中k)。经过 Cd²⁺诱导的所有转pCAMBIA1381-AtMT1a–GUS T₃代拟南芥在萌发1-5天大小幼苗的地下 部分呈优势表达，而在子叶中表达较弱，GUS基因在根尖部位几乎不表达(图4中a-c)； 然而，随着转pCAMBIA1381-AtMT1a–GUS T₃代拟南芥幼苗的进一步发育，生长10-20天 的转pCAMBIA1381-AtMT1a–GUS T₃代拟南芥植株中，GUS基因在子叶及莲座叶的维管 束中呈优势表达(图4中e、f、h、i)。没有经过Cd²⁺诱导的生长10天的所有转 pCAMBIA1381-AtMT1a–GUS T₃代拟南芥植株的子叶及莲座叶的维管束中检测到GUS基因 微弱表达(图4中g、j)，但蓝色明显浅于经过Cd²⁺诱导的生长10天的转 pCAMBIA1381-AtMT1a–GUS T₃代拟南芥的子叶及莲座叶的维管束(图4中e、f、h、i)。

其中，GUS染色液配制：(1)100ml A液：称取19.907克Na₂HPO₄·12H₂O用无菌 蒸馏水溶解后定容到100ml；(2)100ml B液：称取7.80克NaH₂PO₄·2H₂O用无菌蒸 馏水溶解后定容到100ml；(3)10ml磷酸缓冲液配置：将5.77ml A液和4.23ml B 液混匀(PH＝7.0)；(4)100ml5mM K₄(Fe(CN)₆)：称0.211克K₄(Fe(CN)₆)·3H₂O用无 菌蒸馏水溶解后定容到100ml；(5)100ml5mM K₃(Fe(CN)₆)：称取0.165克K₃(Fe(CN)₆) 用无菌蒸馏水溶解后定容到100ml；(6)10mg/ml X-Glue母液配置：称取10mgX-Glue， 用1ml二甲基亚砜溶解，－20℃保存；(7)GUS染色液的配置：4.0ml磷酸缓冲液， 10μl Triton-100，20μl Na₂EDTA，1.0ml5mM K₄(Fe(CN)₆)，1.0ml5mM K₃(Fe(CN)₆)， 1.0ml X-Glue母液，3.0ml H₂O。

透明液组成：90％的乙醇+10％的乙酸。

2.4pCAMBIA1381-AtMT1a–GUS转化拟南芥的GUS活性分析

实验重复三次，每次重复将转pCAMBIA1381-AtMT1a–GUS T₃代拟南芥种子种于1/2 MS培养基上，取生长10天的幼苗分为五组：CK处理组、H₂O处理组、Cd处理组、Cu处 理组和Zn处理组，每个处理组5株幼苗。CK处理组的幼苗在1/2MS液体培养基中放置24 小时作为质控，H₂O处理组的幼苗根系置于无菌蒸馏水中24小时作为没有经过重金属诱 导的对照，Cd处理组的幼苗根系置于100μM CdCl₂溶液中24小时进行Cd²⁺诱导，Cu处理 组的幼苗根系置于150μM CuSO₄溶液中24小时进行Cu²⁺诱导，Zn处理组的幼苗根系置于 2mM ZnSO₄溶液中24小时进行Zn²⁺诱导。上述处理中除将根系置于不同液体中外，其它 环境条件均相同。取经过上述相应处理的幼苗叶片进行分析GUS活性。具体方法如下：

A、GUS提取

(1)100mg叶片置液氮中研磨成粉；

(2)加入5倍体积的提取缓冲液(50mM磷酸钠缓冲溶液(pH7.0)，10mMβ- 巯基乙醇，10mM Na₂EDTA(pH8.0)，0.1％SDS，0.1％Triton X-100)，制成匀浆；

(3)10000r/min4℃离心10min，收集上清液，得到叶片GUS提取液。

B、GUS提取液蛋白含量测定

(1)制作标准曲线：配制0.2mg/ml BSA母液：称取20mg BSA，加入0.5ml提 取缓冲液，用H₂O定容100ml。按表2制作BSA梯度液：

表2

BSA母液(ml) H₂O(ml) BSA浓度(μg/ml) 0.0 5.0 0 0.25 4.75 10 0.5 4.5 20 1.0 4.0 40 1.5 3.5 60 2.0 3.0 80 2.5 2.5 100

(2)提取液蛋白含量测定：取叶片GUS提取液20μl，加H₂O至4ml，加入1ml 考马斯亮蓝溶液，混匀，室温下放置2min。测定595nm光吸收值，根据标准曲线计 算样品蛋白含量。

C、GUS酶反应

(1)取叶片的GUS提取液20μl，加入H₂O至4ml，再加入1ml考马斯亮蓝溶液， 充分混匀，置于37℃预热；

(2)取5支Eppendorf离心管，各加入900μl反应终止液(0.2M Na₂CO₃)， 编号，得到1-5号管；

(3)取1支Eppendorf离心管加入500μl预热的反应缓冲液，再加入100 μl提取缓冲液，混匀，立即取出100μl加入到1号管中，此为反应0时的样品 (荧光测定时以此为空白)，并开始严格计时；

(4)将反应管放入37℃水浴中进行酶反应，分别于20、40、60、80min时各 取100μl反应液，依次加入到2-5号管中，混匀，分别为酶反应20、40、60、80min 时的样品，供荧光测定用；

(5)在激发光365nm，发射光455nm，狭缝10nm条件下测各样品的荧光强度。

以每分钟每毫克蛋白水解4-MUG产生4-MU的量表示GUS活性。结果如表3所示， CK处理组、H₂O处理组、Cd处理组、Cu处理组和Zn处理组这五个处理组中，Zn处理组的 活性最高，是H₂O处理组的3.41倍，其次是Cd处理组和Cu处理组，分别是H₂O处理组的 3.36倍和2.82倍；CK处理组和H₂O处理组活性相当。说明AtMT1a启动子经过Cd²⁺、Cu²⁺和/或Zn²⁺的诱导可以显著提高目的基因的表达量，从而证明AtMT1a启动子是重金属诱 导型启动子。

表3.各处理组植株的GUS活性

处理组 GUS活性(nmol4-MU min^-1mg^-1蛋白) CK处理组 9.37±0.98 H₂O处理组 11.18±1.09 Cd处理组 37.54±1.13 Cu处理组 31.56±1.57 Zn处理组 38.13±2.58

注：表中数值为平均值±标准差。

上述实验证明AtMT1a启动子具有组织表达特异性并且受镉、铜、锌等二价金属离 子的胁迫诱导。这对进一步利用该启动子对农作物进行基因工程改良打下了良好的基 础。

实施例2、培育土壤重金属污染预警转基因植物

1、AtMT1a启动子驱动RFP基因的植物表达载体的构建

以Ler生态型拟南芥叶片的基因组DNA为模板，用P3：5′-CATAGTTACG  TAATCTTAAC-3′和P4：5′-CCGCAAGTTTTAGTTACGTA-3′作为引物进行PCR扩增，将 得到的PCR扩增产物与pMD19-T克隆载体(TAKARA公司)连接后测序。将测序结果表 明含有SEQ ID No.1的第1-1140位所示的DNA分子的重组载体命名为pMD-AtMT1a。 其中，SEQ ID No.1由1140个核苷酸组成，为AtMT1a启动子的核苷酸序列。

用HindIII和XbaI两个限制性酶同时酶切中间载体pMD-AtMT1a和植物表达载体 pBI-121，回收AtMT1a启动子片段与pBI-121的酶切大片段进行连接，获得用SEQ ID  No.1的AtMT1a启动子替换pBI-121的HindIII和XbaI位点间片段得到的重组载体 pBI-AtMT1a-Gus；用BamHI和SacI两个限制性内切酶，同时酶切pBI-AtMT1a-Gus和 两端携带BamHI和SacI酶切位点的SEQ ID No.2所示的RFP基因，回收RFP基因酶切 片段和pBI-AtMT1a-Gus酶切大片段进行连接，获得用SEQ ID No.2第9-686位所示的 RFP基因编码序列替换pBI-AtMT1a-Gus的BamHI和SacI酶切位点间片段得到的AtMT1a 启动子驱动RFP基因的植物表达载体pBI-AtMT1a-RFP(图5)。pBI-AtMT1a-RFP中含 有SEQ ID No.3的红色荧光蛋白基因表达盒，SEQ ID No.3中，第7-1146位为AtMT1a 启动子，第1159-1836位为RFP基因，第1843-2097位为Tnos终止子。SEQ ID No.3 第1159-1836位的RFP基因编码SEQ ID No.4的红色荧光蛋白。

2、培育土壤重金属污染预警转基因拟南芥

2.1、转化及卡那霉素筛选

按照文献(Clough和Bent，1998)和实施例1的沾花方法用pBI-AtMT1a-RFP 对Ler生态型拟南芥进行遗传转化。用含有植物表达载体pBI-AtMT1a-RFP的重组根 癌农杆菌LBA4404/pBI-AtMT1a-RFP(将pBI-AtMT1a-RFP转入根癌农杆菌LBA4404感 受态细胞得到的重组菌)菌液在拟南芥的花苞喷洒；一个月后，收集pBI-AtMT1a-RFP 转化当代(T₀代)拟南芥植株所结的T₁代的种子，得到转pBI-AtMT1a-RFP T₁代拟南 芥种子。

取转pBI-AtMT1a-RFP T₁代拟南芥种子铺在筛选培养基(1/2MS+50μg/ml卡那 霉素)上中培养10天(图6)，选择根部可正常生长的植株移栽于花盆中，22℃温室 中培养。最后一共获得35株卡那霉素阳性的转pBI-AtMT1a-RFP T₁代拟南芥幼苗。

2.2、转pBI-AtMT1a-RFP T₁代拟南芥的PCR检测

在2.1的35株卡那霉素阳性的转pBI-AtMT1a-RFP T₁代拟南芥幼苗中随机选取20 株卡那霉素阳性的转pBI-AtMT1a-RFP T₁代拟南芥幼苗进行PCR检测：以叶片的基因 组DNA为模板，用AtMT1a启动子的特异引物：P5：5′-GCGATAGTTACTCTTCTTGCGT-3′， 和红色荧光蛋白基因的特异引物：P6：5′-GTCCCTCGGTTCTTTCATAC-3′进行PCR扩增， 电泳检测PCR扩增产物。其中，以重组质粒pBI-AtMT1a-RFP为模板作为PCR检测的阳 性对照。

PCR检测结果(图7)表明：在20株卡那霉素阳性的转pBI-AtMT1a-RFP T₁代拟 南芥幼苗中，有16株卡那霉素阳性的转pBI-AtMT1a-RFP T₁代拟南芥幼苗PCR检测结 果为阳性(PCR产物为972bp)。这说明了拟南芥沾花转化方法结合使用卡那霉素筛选 方法是十分有效的，转化率约为80％。

将该16株PCR阳性的转pBI-AtMT1a-RFP T₁代拟南芥的株系分别称为Line-1、 Line-2、……、Line-16。

2.3转pBI-AtMT1a-RFP T₂代拟南芥的Northern检测

分别收获2.2的16株PCR阳性的转pBI-AtMT1a-RFP T₁代拟南芥的种子，将其种 子继续种植，获得转pBI-AtMT1a-RFP T₂代拟南芥的植株。

为了检测转pBI-AtMT1a-RFP T₂代拟南芥的红色荧光蛋白基因能否在转录水平正 确表达，分别以这Line-1、Line-2、……、Line-16这16个转pBI-AtMT1a-RFP T₂代 拟南芥的叶片为材料提取总RNA，用SEQ ID No.2第9-686位所示的RFP基因作为探 针进行Northern杂交鉴定。鉴定结果表明：T₂代转基因拟南芥的红色荧光蛋白基因均 能在转录水平表达，但是表达水平呈现一定的差异性(图8)。其中，line-1、line-4、 line-5、line-6、line-7、line-8和line-13株系的红色荧光蛋白基因在转录水平 表达较强，所以分别收获这7株阳性苗的种子，得到转pBI-AtMT1a-RFP T₃代拟南芥 种子。

2.4转pBI-AtMT1a-RFP T₃代拟南芥作为土壤重金属污染预警转基因植物的验证

取2.3收获的line-1、line-4、line-5、line-6、line-7、line-8和line-13 株系转pBI-AtMT1a-RFP T₃代拟南芥种子，每个株系均设如下四个处理组：0μmol/L Cd 处理组、10μmol/L Cd处理组、20μmol/L Cd处理组、100μmol/L Cd处理组。将0μmol/L Cd处理组的转pBI-AtMT1a-RFP T₃代拟南芥种子种植在1/2MS培养基上，将10μmol/L Cd处理组的转pBI-AtMT1a-RFP T₃代拟南芥种子种植在1/2MS+10μmol/L Cd²⁺培养基上， 将20μmol/L Cd处理组的转pBI-AtMT1a-RFP T₃代拟南芥种子种植在1/2MS+20μmol/L Cd²⁺培养基上，将100μmol/L Cd处理组的转pBI-AtMT1a-RFP T₃代拟南芥种子种植在 1/2MS+100μmol/L Cd²⁺培养基上。在相同的条件下培养14天后，分别取根和叶片，用 1/2MS液体培养基冲洗后，立即采用激光共聚焦显微镜检测，激发波长为561nm，检测 范围为570-630nm。实验设三次重复，每次重复每个处理组3株拟南芥。结果表明在 0μmol/L Cd²⁺的环境中生长的line-1、line-4、line-5、line-6、line-7、line-8 和line-13株系转pBI-AtMT1a-RFP T₃代拟南芥叶片中均检测不到红色荧光(图9中 f)，在大于等于10μmol/L Cd²⁺的环境(10μmol/L Cd²⁺、20μmol/L Cd²⁺和100μmol/L Cd²⁺的环境)中生长的line-1、line-4、line-5、line-6、line-7、line-8和line-13 株系转pBI-AtMT1a-RFP T₃代拟南芥叶片中均检测红色荧光(图9中a-c)。在叶片中， RFP基因主要表达在中央大的液泡腔内，进一步提高放大倍数可以清楚地观察到，RFP 基因没有定位到液泡膜以及其他原生质膜上，而是定位在液泡腔内(图9中d和e)。

在0μmol/L Cd²⁺的环境中生长的line-1、line-4、line-5、line-6、line-7、 line-8和line-13株系转pBI-AtMT1a-RFP T₃代拟南芥的根中均检测不到红色荧光(图 10)，在10μmol/L Cd²⁺的环境中生长的line-1、line-4、line-5、line-6、line-7、 line-8和line-13株系转pBI-AtMT1a-RFP T₃代拟南芥的根的液泡腔中均检测红色荧 光(图11和图12)。

上文中，1/2MS+10μmol/L Cd²⁺培养基是向1/2MS培养基中加入CdCl₂得到的培养 基，1/2MS+10μmol/L Cd²⁺培养基中Cd²⁺的浓度为10μmol/L。1/2MS+20μmol/L Cd²⁺培养 基是向1/2MS培养基中加入CdCl₂得到的培养基，1/2MS+20μmol/L Cd²⁺培养基中Cd²⁺的浓度为20μmol/L。1/2MS+100μmol/L Cd²⁺培养基是向1/2MS培养基中加入CdCl₂得到 的培养基，1/2MS+100μmol/L Cd²⁺培养基中Cd²⁺的浓度为100μmol/L。

上述结果表明，携带AtMT1a启动子驱动RFP基因的转基因植株能够在环境存在 10μmol/L以上金属镉离子的条件下，激发出红色信号，说明AtMT1a启动子及由AtMT1a 启动子驱动RFP基因表达的表达盒可用于培育土壤重金属(如Cd²⁺)污染预警转基因 植物。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。 因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护 的范围。