一种大田马铃薯植株氮素营养分子诊断方法及在施肥上的应用

摘要

本发明公开了一种大田马铃薯植株氮素营养分子诊断方法，具体以马铃薯植株氮素吸收相关基因硝酸还原酶基因(NR)作为衡量大田马铃薯植株氮素营养状况的分子标记。诊断时以大田马铃薯植株的RNA为模板，反转录获得cDNA，进行RealtimePCR检测NR基因的表达量，根据NR基因的表达量，判断大田马铃薯植株的氮素营养状况，进而可以确定是否追施氮肥及其施用量。本诊断方法具有判断准确性好、灵敏度高等优点。

说明书

技术领域

本发明属于马铃薯的营养与施肥管理技术领域，涉及一种大田马铃薯植株氮素营养的分子诊断方法，更具体地说，采用Real time PCR的方法定量分析植株叶片硝酸还原酶NR基因的表达量，来判断大田马铃薯植株的氮素营养状况，并确定是否需要施肥及具体的施肥量，为大田施氮管理提供指导。

背景技术

氮素是作物生长发育不可缺少的营养元素，它是植物体内叶绿素、蛋白质、核酸的组成部分，又是很多内源激素的组成部分，占植物干重的1％～7％。叶绿素含量的高低，直接影响着光合作用的大小，并在一定的程度上反映了叶片含氮水平。氮肥管理对马铃薯种植效益和环境影响的起重要作用，而我国作物生产上普遍存在施氮水平过高，造成氮的浪费和环境污染。氮肥供应不足或过量，均会影响植物体内的氮素代谢，从而破坏碳氮代谢平衡，降低作物的产量和品质。氮素供应不足降低块茎产量和大小，过多氮素供应影响块茎品质如降低干物质含量，硝酸盐浓度增加，增加天冬酰胺积累，这会导致烹饪过程中形成丙烯酰胺。环境中的氮以硝酸盐淋失和一氧化二氮排放方式流失。因此，最有效的方法是实现施氮与作物需氮的平衡，即根据作物的需要来施氮，但是在大田生产的情况下，要实现两者的平衡存在很大的困难，因为不同年份、不同田块之间的土壤供氮与作物需氮存在较大差异。目前常用的马铃薯氮素营养诊断方法有植株外观诊断、植株全氮诊断、土壤氮素测试、植株硝酸盐快速诊断和叶绿素含量测定等方法，其中最为常见的光学方法是用叶绿素仪（SPAD502）测定叶绿素的相对含量（SPAD值），化学方法是硝态氮的含量，根据SPAD值和硝态氮的含量来评价植株氮素营养状况(Zebarth and Rosen，2007)，但是这些方法是间接测定方法，而且易受土壤中水分、养分等环境因素及马铃薯生育期的影响(Olfs et al. 2005)。植物通过基因表达的变化响应逆境胁迫（Hazen et al.，2003），因此，基因定量表达可以提供一种衡量植株氮素充足与否更直接的措施。

当土壤中供氮充足时，硝态氮作为非代谢物质以一种半储备状态存在于植物液泡内，因此植物体内的硝态氮包括液泡中储备的硝态氮（储存库）和细胞质内的硝态氮（代谢库），当植物需氮增加或缺氮时,硝酸还原酶的活性增强，利用植物液泡中储备的硝态氮，硝酸还原酶的活性与植物液泡中储备的硝态氮存在对应关系, 硝酸还原酶的活性和液泡中储备的硝态氮比植株硝态氮的含量更直接和灵敏地反映作物对氮的需求，而液泡中储备的硝态氮很难单独测定,因此,可以用硝酸还原酶的活性或硝酸还原酶基因的表达水平代替全氮、硝态氮作为氮素营养诊断指标，来更准确地估计植株氮素营养状况。Li等通过水培方法发现在缺氮情况下3天内马铃薯试管苗硝酸还原酶和亚硝酸还原酶基因表达下调，但是在人工温室条件下，采用营养液，氮为硝态氮，设置的氮浓度梯度较少（氮浓度突然减少或大幅减少，充足(7.5 mM NO₃^-), 有限（0.75 mM NO₃^-) ，和缺氮 (0 mM NO₃^-) ，采用的植株为瘦弱的试管苗（株高8-10cm，茎粗2-3mm），仅进行短时间（7天）的培养，没有涉及马铃薯块茎的形成、膨大，更没有涉及到产量，需要的氮少，而马铃薯生产是在田间进行，采用的是种薯切块种植，植株健壮（株高50-70cm，茎粗10-15mm）,土壤中本身含有一定浓度的氮素，种薯上含有一定的营养供植株生长前期吸收，田间施用的氮为尿素或者复合肥，不同于水培的硝态氮，施肥水平采用的不是摩尔浓度，而是单位面积施肥量（我国南方马铃薯普遍采用的是亩施15kg 纯N），种植的时间为一个较长的生长季，在80天以上，包括马铃薯出苗期、苗期、块茎形成期、块茎膨大期和块茎成熟期等5个时期，涉及到产量的形成，需要大量的氮，所以大田环境下的马铃薯植株远比水培试管苗复杂，Li等的研究结果对大田马铃薯植株氮素营养诊断及施肥没有任何借鉴意义。至今为止，还没有以NR基因表达量作为衡量大田马铃薯植株氮素营养状况的研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：针对现有间接测定方法的不足，提供一种高准确率的NR基因表达量作为衡量植株氮素营养状况的分子诊断方法。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：

一种大田马铃薯植株氮素营养的分子诊断方法，是以马铃薯植株氮素吸收相关的硝酸还原酶基因NR的表达量作为诊断大田马铃薯植株氮素营养状况的分子标记。

具体是包括Real time PCR在内的方法检测硝酸还原酶基因NR的表达，来诊断大田马铃薯植株氮素营养状况。

Real time PCR所用引物的序列如下：

正向引物：5'- TGGACATATCTATGATGCCTCACG-3'（SEQ ID NO.1），

反向引物：5'- AGTTCACCAATCCTAAAGTCCTCCA-3'（SEQ ID NO.2）。

管家基因为Actin

正向引物：5'- AGGTCCTCTTCCAGCCATCCA-3'（SEQ ID NO.3），

反向引物：5'- CCACTGAGCACAATGTTACCGTAG -3'（SEQ ID NO.4）。

本发明检测方法具体包括以下步骤：

1）马铃薯植株叶片RNA的获得

田间取马铃薯植株顶端第一片完全展开叶,通常是第四片叶,液氮处理并带回实验室,采取trizol方法提取RNA；

2）以步骤1）得到的RNA为模板，通过反转录，得到cDNA；

3）以步骤2）得到的cDNA为模板，进行Real time PCR扩增；

4）以Actin基因为内参，通过分析、计算得出NR基因的相对表达量ΔCt。其中，ΔCt = Ct_NR-Ct_Actin，Ct_NR和Ct_Actin 分别表示硝酸还原酶基因NR和内参基因肌动蛋白基因Actin在 Real time PCR扩增过程中每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值所经历的循环数，而阈值是在扩增曲线的指数增长区域内适当位置上设定的荧光检出界限，Ct值越大即扩增所需的循环数越多，基因的表达量就越小，反之，基因的表达量越大；ΔCt值小于零，表示NR基因扩增所需的循环数小于Actin基因，Actin基因的Ct_Actin比较稳定，因此，ΔCt值越小，NR基因的表达量越大，反之，表达量越小。

再根据拟合公式计算应施氮肥的量，其中一个优选的拟合公式为：N=-6.7891*ΔCt²-37.622*ΔCt-43.033，其中施氮量N的单位为纯氮kg/667m²。

本发明通过大量实验确定了施氮肥量的计算公式，将NR基因的表达量与施肥量进行明确的量化，而能够直接指导施氮量，具有实际意义。这在现有技术中尚未实现的，也是本发明突破的一个方面。

本发明用硝酸还原酶基因的表达水平代替全氮、硝态氮作为氮素营养诊断指标，来更准确地估计植株氮素营养状况，确定施氮肥量。与目前常用的马铃薯氮素营养诊断方法：植株外观诊断、植株全氮诊断、土壤氮素测试、植株硝酸盐快速诊断和叶绿素含量测定等间接测定方法相比，本发明方法不易受土壤中水分、养分等环境因素，以及马铃薯生育期的影响，更加准确，操作更加方便快捷。

 

附图说明

图1 Real time PCR 扩增曲线 ，其中A为ActB基因；B为NR基因。

图2 ΔCt 与施氮量的拟合曲线。

图3 SPAD与施氮量的拟合曲线。

 

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步地解释，但具体实施例并不对本发明做任何限定。

（1）试验设置7个施氮水平（0、3 、6 、9、12、18和24 kg/667m²）7个处理，重复3次，小区面积24m²，随机区组排列，其中9 kg/667m²为发达国家马铃薯生产上建议施氮水平。

所有小区于出苗后70天进行收获，测定和计算小区产量、单株结薯数等。

在马铃薯的块茎膨大期，每小区随机测定10株马铃薯植株第四片叶（完全展开叶）的顶小叶SPAD值和净光合速率，每小区随机选取马铃薯植株第四片叶（完全展开叶）的顶小叶10片，液氮保存带回实验室，采用Trizol 试剂盒提取总RNA，测定RNA浓度，各RNA样品稀释同一浓度0.2μg/μl。

（2）根据GenBank中马铃薯Actin与NR基因序列，用Primer 5.0设计引物，覆盖该基因部分编码序列，NR基因（基因登录号GenBank: U76701.1）引物序列为： 

正向引物：5'- TGGACATATCTATGATGCCTCACG-3'（SEQ ID NO.1），

反向引物：5'- AGTTCACCAATCCTAAAGTCCTCCA-3'（SEQ ID NO.2）；

肌动蛋白是真核生物细胞中普遍存在最保守的古老蛋白质之一。在所有细胞中均有表达，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的，基因表达水平受环境因素影响较小，在各生长阶段的大多数、或几乎全部组织中持续表达，或变化很小,因而本发明采用肌动蛋白基因作为内参基因,以提高准确性和可靠性。

Actin基因引物序列如下：

正向引物：5'- AGGTCCTCTTCCAGCCATCCA-3'（SEQ ID NO.3），

反向引物：5'- CCACTGAGCACAATGTTACCGTAG -3'（SEQ ID NO.4）。

引物由上海生工生物技术有限公司合成。

（3）用上述引物分别对提取的总RNA进行real time RT-PCR扩增。

第一步是反转录，

先配制RNA和反转录引物混合物（5μl）：RNA  2μl、 [Oligo(dT)15 引物 0.5 μl（浓度为10μ/M）、随机引物 (浓度为10μ/M) 0.5μl、超纯水补至5μl。混合物70℃变性5分钟，4℃冷却5分钟；

随后配置反转录反应液（5μl），5×反应缓冲液2 μl， 25mM MgCl₂溶液 1μl、10mM dNTPs 0.5μl、RNA酶抑制剂 0.25μl、反转录酶 0.5μl、超纯水补至5μl。

将5μl反应液加入到RNA/引物混合物中，混匀，42℃延伸1小时，70℃变性15分钟。

第二步荧光定量PCR

20μl反应体系：2× SYBR Green Real time-PCR mix 10 μl、模板（cDNA）2 μl、正向引物和反向引物各1 μl（浓度为10μ/M）、超纯水补至所需体积。

PCR程序：95℃ 2分钟预变性后40个PCR循环参数为： 95℃ 5秒，60℃　30秒。

按照上述实验方法进行获得试验数据，阈值与Ct值由荧光定量PCR仪自带软件自动得出。NR基因的相对表达量ΔCt=Ct_NR-Ct_Actin，ΔCt值越小，NR基因的表达量越高，ΔCt值越大，NR基因的表达量越低。

其中：ΔCt = Ct_NR-Ct_Actin，Ct_NR和Ct_Actin 分别表示硝酸还原酶基因NR和内参基因肌动蛋白基因Actin在 Real time PCR扩增过程中每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值所经历的循环数，而阈值是在扩增曲线的指数增长区域内适当位置上设定的荧光检出界限，Ct值越大即扩增所需的循环数越多，基因的表达量就越小，反之，基因的表达量越大；ΔCt值小于零，表示NR基因扩增所需的循环数小于Actin基因，Actin基因的Ct_Actin比较稳定，因此，ΔCt值越小，NR基因的表达量越大，反之，表达量越小。

（4）根据各施氮处理NR基因的表达水平，通过建立拟合公式，可计算得出植株的氮素营养状况而需要添加氮肥的量，建立大田马铃薯植株氮素营养分子诊断技术的量化。

试验结果见图1和表1，从表1中可以看出，随着施氮水平的提高，叶绿素含量呈上升的趋势；NR基因的ΔCt值随施氮水平的提高而增加，NR基因的表达量随施氮水平的提高降低。而马铃薯产量呈先上升后下降的趋势，9 kg /667m²时产量最高，为1357.27 kg/667m² ，但6-18 kg /667m²各处理产量差异不显著。秋播马铃薯由于生长季节短，温度高，植株生长和产量不及冬播马铃薯，因此，每亩需氮量较低，6 kg /667 m²就能满足其生长，并获得1141.25 kg/667m²产量，不施氮或过低（3 kg /667m²），植株生长不良，叶绿素合成收到影响，叶色偏淡，产量显著降低；施氮过高产量增加不显著（12，18 kg /667m²）或显著降低（24 kg /667m²），氮肥利用效率降低，造成浪费。在生产中，随着目标产量提高，植株需氮量增加，土壤中供氮减少，需要追施氮肥。由于产量最高时的施氮水平和国外发达国家马铃薯生产建议的施氮水平均为9kg/667m²，根据表1中的ΔCt和施肥水平拟合曲线（见图2），得到追施氮的拟合方程1为N=-6.7891*ΔCt²-37.622*ΔCt-43.033（R²=0.9895），根据叶绿素含量SPAD值和施肥水平拟合曲线（见图3），得到追施氮的拟合方程2为N=-0.0887*SPAD²-5.7819*SPAD-85.518（R²=0.9575），可见ΔCt的拟合度R²大于SPAD的拟合度，说明NR基因的表达更能直接反映植株氮素营养状况和土壤供氮状况，根据拟合方程1和ΔCt值，求得施氮量N（纯氮 kg/667m²），当N大于零时，需追施氮肥，当N小于零时，不用追施氮肥。因此，硝酸还原酶基因(NR)作为衡量马铃薯植株氮素营养状况的分子标记，采取Real time PCR检测植株氮素营养具有判断准确性好、灵敏度高等优点。

 

表1 不同施氮水平对秋马铃薯叶绿素含量、NR基因表达量及产量的影响

表内平均数经Ducan氏多重极差测验，小写字母表示5%水平，大写字母表示1%水平。

<110> 湖南农业大学

<120>一种大田马铃薯植株氮素营养分子诊断方法及在施肥上的应用

<160> 4

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 1

TGGACATATCTATGATGCCTCACG   24

 

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 2

AGTTCACCAATCCTAAAGTCCTCCA  25

 

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 3

AGGTCCTCTTCCAGCCATCCA  21

 

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 4

CCACTGAGCACAATGTTACCGTAG    24