多肽溶液和使用了该多肽溶液的人造多肽纤维的制造方法以及多肽的精制方法

摘要

本发明的多肽溶液为将天然蛛丝蛋白来源的多肽溶解于溶剂而得到的多肽溶液，其中，所述溶剂含有选自下述（i）～（iii）中的至少一种。（i）DMSO。（ii）在DMSO中加入无机盐而成的溶剂。（iii）在DMF中加入无机盐而成的溶剂。另外，本发明通过将所述多肽溶液制成原液，将原液从纺丝头挤出到脱溶剂槽的凝固液中，使溶剂从所述原液脱离，同时进行纤维形成，制成未拉伸丝，得到人造多肽纤维。另外，本发明还通过在对上述多肽溶液进行热处理后，将不溶物除去来对多肽进行精制。由此，能够提供溶质的溶解性高、能够高温溶解、且安全性也高、溶剂的成本低的多肽溶液、人造多肽纤维的制造方法以及多肽的精制方法。

说明书

技术领域

本发明涉及将多肽溶解于特定的溶剂而得到的多肽溶液和使用了该多 肽溶液的人造多肽纤维的制造方法以及多肽的精制方法。

背景技术

蛛丝纤维已知是兼具强度和伸缩性的纤维，其比高强度钢、尼龙（注 册商标）6纤维等具有更高的韧性。而且，还具有不以石油为原料、可将原 料生物质化的优点。关于人工蛛丝纤维，也提出了一些技术方案，例如专 利文献1中记载了将以天然蛛丝蛋白为来源的合成蛋白用六氟异丙醇 （HFIP）溶解，将得到的溶液作为纺丝液，对其进行湿式纺丝。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特表2004-503204号公报

发明内容

发明欲解决的课题

但是，用于以往的以天然蛛丝蛋白为来源的人造多肽的溶剂如六氟异 丙醇（HFIP）等昂贵、并且在安全性方面存在问题。

为了解决上述以往的问题，本发明提供溶质的溶解性高、沸点高于水 且能够高温溶解、安全性也高、溶剂本身的成本低的多肽溶液和使用了该 多肽溶液的人造多肽纤维的制造方法以及多肽的精制方法。

用于解决课题的手段

本发明的多肽溶液的特征在于，其为将天然蛛丝蛋白来源的多肽溶解 于溶剂而得到的多肽溶液，其中，所述溶剂含有选自下述（i）～（iii）中 的至少一种。

（i）二甲基亚砜

（ii）在二甲基亚砜中加入无机盐而成的溶剂

（iii）在N,N-二甲基甲酰胺中加入无机盐而成的溶剂

本发明的人造多肽纤维的制造方法的特征在于，其为使用了所述多肽 溶液的人造多肽纤维的制造方法，其中，将所述多肽溶液制成原液，将所 述原液从纺丝头挤出到脱溶剂槽的凝固液中，使溶剂从所述原液脱离，同 时进行纤维形成，制成未拉伸丝，从而得到人造多肽纤维。

本发明的多肽的精制方法的特征在于，其为使用了所述多肽溶液的多 肽的精制方法，其中，对多肽溶液进行热处理后，将不溶物除去。

发明效果

本发明的多肽溶液为将天然蛛丝蛋白（spider silk proteins）来源的多肽 （以下也称为“溶质”）溶解于溶剂而得到的溶液，其中，通过使溶剂含 有选自所述（i）～（iii）中的至少一种，从而能够使溶质的溶解性增高、沸 点增高且能够高温溶解、安全性也提高、溶剂本身的成本降低。当溶质的 溶解性高且能够以高浓度溶解时，通过将该多肽溶液制成原液使用，能够 提高纤维或膜的生产效率。当能够高温溶解时，能够使原液制备作业变得 高效，进而当沸点高于水时，还能够用作进行脱水缩合反应时的聚合溶剂。 当安全性高时，除了生产作业性提高外，用途方面也得到扩展。此外，还 有可纺性，对于湿式纺丝、流延膜等也是有用的。另外，使用多肽溶液， 还能够简便地对多肽进行精制。

附图说明

图1为表示本发明的一个实施例中的制造装置的说明图。

图2A-B为表示本发明的另一实施例中的制造装置的说明图，图2A表 示纺丝装置-第一阶段拉伸装置、图2B表示第二阶段拉伸装置。

图3为表示本发明的又一实施例中的制造装置的说明图。

图4A-B为表示本发明的又一实施例中的制造装置的说明图，图4A表 示纺丝装置、图4B表示拉伸装置。

图5为本发明的实施例2中得到的单纤维的应力-变位（变形）曲线。

图6为本发明的实施例3中得到的单纤维的应力-变位（变形）曲线。

图7为本发明的实施例4中得到的单纤维的应力-变位（变形）曲线。

图8为本发明的实施例5中得到的单纤维的应力-变位（变形）曲线。

图9为本发明的实施例6中得到的拉伸丝的应力-变位（变形）曲线。

图10为本发明的实施例7中得到的单纤维的应力-变位（变形）曲线。

图11为本发明的实施例8中得到的一次拉伸丝的单纤维的应力-变位 （变形）曲线。

图12为本发明的实施例8中得到的二次拉伸丝的单纤维的应力-变位 （变形）曲线。

图13为表示本发明的实施例9中得到的蛋白的SDS-PAGE电泳结果 的照片。

图14为表示本发明的实施例10中得到的蛋白的SDS-PAGE电泳结果 的照片。

具体实施方式

1.溶剂

（1）极性溶剂的选择

为了使天然蛛丝蛋白来源的多肽溶解而得到多肽溶液，本发明者们对 什么样的溶剂是合适的进行了研究。主要选择极性溶剂进行了溶解实验， 结果发现当为含有所述（i）～（iii）所示的物质的溶剂时，选择性地溶解度 高且能够高温溶解。当以多肽溶液为100质量%时，优选溶质的浓度（溶 解度）为3质量%（w/v%）以上、更优选为15质量%以上、进一步优选为 40质量%以上。另外，溶质的浓度还优选为45质量%以下。二甲基亚砜 （DMSO）的熔点为18.4℃、沸点为189℃、N,N-二甲基甲酰胺（DMF） 的熔点为-61℃、沸点为153℃，与以往的方法中使用的六氟异丙醇（HFIP） 的沸点为59℃、六氟丙酮（HFAc）的沸点为-26.5℃相比，DMSO及DMF 的沸点远远地高。另外，DMSO及DMF即使在一般的产业领域中也被用 于丙烯酸纤维的聚合、纺丝液等，由于也被用作聚酰亚胺的聚合溶剂，因 此是成本低且安全性也得到确认的物质。

（2）溶解促进剂

当在DMSO或DMF中加入无机盐时，溶质的溶解度进一步提高，因 此优选。无机盐优选为选自碱金属卤化物（例如LiCl、LiBr等）、碱土类 金属卤化物（例如CaCl₂等）、碱土类金属硝酸盐（例如Ca（NO₃）₂等）、 硫氰酸盐（例如NaSCN等）中的至少一种。当以溶剂为100质量%时，无 机盐的比例优选0.1～20质量%的范围。

（3）溶剂的纯度、添加物

溶剂中除了所述（i）～（iii）所示的物质外，还可以含有醇和/或水。

当以溶剂为100质量%时，所述（i）～（iii）所示的物质的比例为22 质量%～100质量%，剩余部分可以含有醇。上文中，醇优选碳原子数为1～6 的低级醇。进一步优选为选自由甲醇、乙醇及2-丙醇组成的组中的一种以 上。在含有水的情况下，当以溶剂为100质量%时，所述（i）～（iii）所示 的物质的比例为10质量%～100质量%，剩余部分可以为水。也可以将水和 醇混合。

2.多肽

本发明中，作为多肽使用例如天然型蛛丝蛋白来源的多肽。所述多肽 只要是天然型蛛丝蛋白来源的多肽即可，没有特别的限定，包括天然型蛛 丝蛋白或重组蛛丝蛋白，例如天然型蛛丝蛋白的突变体、类似物或衍生物 等。所述多肽从强韧性优异的观点出发，优选为由蜘蛛的大壶状腺产生的 大吐丝管拖丝蛋白来源的多肽。作为所述大吐丝管拖丝蛋白，可列举出 Nephila clavipes来源的大壶状腺丝蛋白（spidroin）MaSp1、MaSp2、Araneus  diadematus来源的ADF3、ADF4等。所述大吐丝管拖丝蛋白来源的多肽包 括大吐丝管拖丝蛋白的突变体、类似物或衍生物等。另外，所述多肽还可 以是由蜘蛛的鞭状腺（flagelliform gland）产生的横丝蛋白来源的多肽。作 为所述横丝蛋白，可列举出例如Nephila clavipes来源的鞭毛状丝蛋白 （flagelliform silk protein）等。

作为所述大吐丝管拖丝蛋白来源的多肽，可列举出含有2个以上、优 选5个以上、更优选为10个以上的由式1：REP1-REP2（1）所示的氨基酸 序列的单元的多肽。或者，所述大吐丝管拖丝蛋白来源的多肽可以是含有 由式1：REP1-REP2（1）所示的氨基酸序列的单元且C末端序列为序列号 1～3中任一个所示的氨基酸序列或与序列号1～3中任一个所示的氨基酸序 列具有90%以上的同源性的氨基酸序列的多肽。其中，在所述大吐丝管拖 丝蛋白来源的多肽中，由式1：REP1-REP2（1）所示的氨基酸序列的单元 可以相同，也可以不同。上述大吐丝管拖丝蛋白来源的多肽在进行以大肠 杆菌等微生物为宿主的重组蛋白生产时，从生产率的观点出发，分子量优 选为500kDa以下、更优选为300kDa以下、进一步优选为200kDa以下。

所述式1中，REP1表示聚丙氨酸。所述REP1中，连续排列的丙氨酸 优选为2个残基以上、更优选为3个残基以上、进一步优选为4个残基以 上、特别优选为5个残基以上。另外，所述REP1中，连续排列的丙氨酸 还优选为20残基以下、更优选为16个残基以下、进一步优选为12个残基 以下、特别优选为10个残基以下。所述式1中，REP2为由10～200个残基 的氨基酸构成的氨基酸序列，所述氨基酸序列中所含的甘氨酸、丝氨酸、 谷氨酰胺及丙氨酸的总残基数相对于总氨基酸残基数为40%以上、优选为 60%以上、更优选为70%以上。

大吐丝管拖丝中，上述REP1相当于纤维内形成结晶β折叠的晶体区 域，上述REP2相当于纤维内更具有柔软性且大部分缺乏整齐排列结构的 无定型区域。并且，上述[REP1-REP2]相当于由晶体区域和无定型区域构成 的重复区域（反复序列），该[REP1-REP2]为拖丝蛋白的特征性序列。

序列号1所示的氨基酸序列与由ADF3的氨基酸序列（NCBI登录号： AAC47010、GI：1263287）的C末端的50个残基的氨基酸构成的氨基酸 序列相同，序列号2所示的氨基酸序列与从序列号1所示的氨基酸序列的 C末端去除了20个残基后的氨基酸序列相同，序列号3所示的氨基酸序列 与从序列号1所示的氨基酸序列的C末端去除了29个残基后的氨基酸序列 相同。

作为包含所述式1：REP1-REP2（1）所示的氨基酸序列的单元、且C 末端序列由序列号1～3中的任一个所示的氨基酸序列或与序列号1～3中的 任一个所示的氨基酸序列具有90%以上的同源性的氨基酸序列构成的多 肽，可以使用例如由序列号8所示的氨基酸序列构成的多肽。由序列号8 所示的氨基酸序列构成的多肽是在N末端添加有由起始密码子、His10标 签（His10tag）和HRV3C蛋白酶（人鼻病毒3C蛋白酶，Human rhinovirus 3C protease）识别位点构成的氨基酸序列（序列号为5）的ADF3的氨基酸 序列（NCBI登录号：AAC47010、GI：1263287）中发生了下述变异而成 的多肽：第1～13号的反复区域增加至约2倍，并且翻译在第1154号氨基 酸残基处终止。由序列号8所示的氨基酸序列构成的多肽中，C末端序列 与序列号3所示的氨基酸序列相同。

另外，作为包含所述由式1：REP1-REP2（1）所示的氨基酸序列的单 元、且C末端序列由序列号1～3中的任一个所示的氨基酸序列或与序列号 1～3中的任一个所示的氨基酸序列具有90%以上的同源性的氨基酸序列构 成的多肽，可以使用由在序列号8所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸 被替换、缺失、插入和/或添加而成的氨基酸序列构成，且具有由晶体区域 和无定型区域构成的重复区域的蛋白。本发明中，“1个或多个”是指例如 1～40个、1～35个、1～30个、1～25个、1～20个、1～15个、1～10个、或1 个或数个。另外，本发明中，“1个或数个”是指1～9个、1～8个、1～7个、 1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个或1个。

另外，作为含有2个以上所述由式1：REP1-REP2（1）所示的氨基酸 序列的单元的多肽，可列举出例如具有序列号15所示的氨基酸序列的 ADF4来源的重组蛋白。序列号15所示的氨基酸序列为在从NCBI数据库 获得的ADF4的部分氨基酸序列（NCBI登录号：AAC47011、GI：1263289） 的N末端添加有由起始密码子、His10标签及HRV3C蛋白酶（人鼻病毒 3C蛋白酶）识别位点构成的氨基酸序列（序列号5）的氨基酸序列。另外， 作为含有2个以上的所述由式1：REP1-REP2（1）所示的氨基酸序列的单 元的多肽，还可以使用由在序列号15所示的氨基酸序列中替换、缺失、插 入和/或添加有1个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列构成、且具有由晶体 区域和无定型区域构成的重复区域的多肽。另外，作为含有2个以上所述 由式1：REP1-REP2（1）所示的氨基酸序列的单元的多肽，可列举出例如 具有序列号17所示的氨基酸序列的MaSp2来源的重组蛋白。序列号17所 示的氨基酸序列为在从NCBI数据库获得的MaSp2的部分序列（NCBI登 录号：AAT75313、GI：50363147）的N末端添加有由起始密码子、His10 标签及HRV3C蛋白酶（人鼻病毒3C蛋白酶）识别位点构成的氨基酸序列 （序列号5）的氨基酸序列。另外，作为含有2个以上所述由式1：REP1-REP2 （1）所示的氨基酸序列的单元的多肽，还可以使用由在序列号17所示的 氨基酸序列中替换、缺失、插入和/或添加有1个或多个氨基酸的氨基酸序 列构成、且具有由晶体区域和无定型区域构成的重复区域的多肽。

作为所述横丝蛋白来源的多肽，可列举出含有10个以上、优选20个 以上、更优选30个以上由式2：REP3（2）所示的氨基酸序列的单元的多 肽。所述横丝蛋白来源的多肽在进行以大肠杆菌等微生物为宿主的重组蛋 白生产时，从生产率的观点出发，分子量优选为500kDa以下、更优选为 300kDa以下、进一步优选为200KDa以下。

所述式（2）中，REP3表示由Gly-Pro-Gly-Gly-X构成的氨基酸序列， X表示选自由Ala、Ser、Tyr及Val组成的组中的一种氨基酸。

蜘蛛丝中，横丝的一大特征是不具有晶体区域而具有由无定形区域构 成的重复区域。大吐丝管拖丝等中，由于具有由晶体区域和无定形区域构 成的重复区域，因此推测同时具有高的应力和伸缩性。另一方面，横丝虽 然比大吐丝管拖丝的应力差，但具有高的伸缩性。这考虑是因为横丝的大 部分由无定形区域构成。

作为含有10个以上所述由式2：REP3（2）所示的氨基酸序列的单元 的多肽，可列举出例如具有序列号19所示的氨基酸序列的鞭毛状丝蛋白来 源的重组蛋白。序列号19所示的氨基酸序列为将从NCBI数据库获得的 Nephila clavipes的鞭毛状丝蛋白的部分序列（NCBI登录号：AAC38847、 GI：2833649）的从C末端计的第816个残基～第907个残基的C末端氨基 酸序列与相当于从NCBI数据库获得的Nephila clavipes的鞭毛状丝蛋白的 部分序列（NCBI登录号：AAF36090、GI：7106224）的重复部分及基序的 从N末端计的第1220个残基～第1659个残基的氨基酸序列（记作PR1序 列）结合，然后在结合而成的序列的N末端添加由起始密码子、His10标 签及HRV3C蛋白酶识别位点构成的氨基酸序列（序列号5）而得到的氨基 酸序列。另外，作为含有10个以上所述由式2：REP3（2）所示的氨基酸 序列的单元的多肽，还可以使用由在序列号19所示的氨基酸序列中替换、 缺失、插入和/或添加有1个或多个氨基酸的氨基酸序列构成、且具有由无 定形区域构成的重复区域的多肽。

所述多肽可使用用含有编码多肽的基因的表达载体进行了转化的宿主 来制造。基因的制造方法没有特别限制，将编码天然型蛛丝蛋白的基因从 蜘蛛来源的细胞通过聚合酶链反应（PCR）等扩增进行克隆，或者化学地 合成。基因的化学合成方法也没有特别限制，例如，可以以从NCBI的web 数据库等获得的天然型蛛丝蛋白的氨基酸序列信息为基础，将利用AKTA  oligopilot plus10/100（GE Healthcare Japan株式会社）等自动合成的寡核苷 酸通过PCR等连接来合成。此时，由于容易进行蛋白的精制、确认，因此 也可以合成编码由在上述氨基酸序列的N末端添加了由起始密码子和 His10标签构成的氨基酸序列而成的氨基酸序列构成的蛋白的基因。

作为上述表达载体，可以使用能够从DNA序列表达蛋白的质粒、噬菌 体、病毒等。作为上述质粒型表达载体，只要在宿主细胞内能够表达目标 基因、且自身能够进行扩增即可，没有特殊限定。例如作为宿主使用大肠 杆菌Rosetta（DE3）时，可以使用pET22b（+）质粒载体、pCold质粒载 体等。其中，从蛋白的生产率的观点出发，优选使用pET22b（+）质粒载 体。作为上述宿主，例如可以使用动物细胞、植物细胞、微生物等。

本发明中使用的多肽优选为十字园蛛（Araneus diadematus）的两种主 要的拖丝蛋白之一即ADF3来源的多肽。作为该多肽的优点，可列举出强 伸长率和韧性基本上都高，且易于合成。

3.多肽溶液

（1）多肽溶液的制备

多肽溶液通过在所述多肽中加入溶剂来制备。溶剂含有上述（i）～（iii） 所示的物质。或者，溶剂除了上述（i）～（iii）所示的物质外还含有水和/ 或醇。所述多肽溶液可以以原液形式使用。原液对于湿式纺丝、流延膜液 等是有用的。原液通过将多肽溶液的粘度调整为能够纺丝的粘度来制作。 例如将多肽溶液的粘度调整为100～10000cP（厘泊），得到原液。多肽溶 液粘度的调整可以通过调整例如溶液中的多肽的浓度来进行。多肽溶液的 粘度使用例如京都电子工业公司制的商品名“EMS粘度计”来测定。需要说 明的是，本发明的多肽溶液还可以含有不可避免的含有成分、例如多肽中 所含的的夹杂物等。

（2）使用了多肽溶液的多肽的聚合

由于本发明的原液的沸点与水相比为高温，因此适于在溶液中进行脱 水缩合反应。例如，在用于湿式纺丝、流延膜等之前，通过将多肽溶液中 溶解的多肽利用脱水缩合进行聚合，能够使多肽高分子化，还能够使得到 的纤维、膜高强力化、高韧性化。通过在所述多肽中加入含有上述（i）～ （iii）所示的物质的溶剂、并加热至100℃以上，多肽彼此之间能够发生脱 水缩合并聚合。此时，通过在回流条件、减压条件、真空条件等下进行反 应，能够提高聚合效率。另外，通过与公知的脱水缩合催化剂并用，还能 够飞跃式地提高聚合效率。使用多肽溶液进行通过脱水缩合反应进行的聚 合时，优选多肽分子末端的NH₂基与其它的多肽分子末端的COOH基脱水 缩合、多肽主链延长，因此所用多肽的侧链的官能团（NH₂基、COOH基、 OH基、SH基）越少越好，最优选所用多肽的侧链没有官能团。这些官能 团的数目可通过调整所用氨基酸的比例来进行控制。如此进行了聚合反应 的多肽溶液可以直接或者在适当地加入上述（i）～（iii）所示的物质、乙醇、 甲醇、水等进行稀释后用于湿式纺丝、流延膜的制作。

4.湿式纺丝-拉伸

（1）湿式纺丝

纺丝采用湿式纺丝。由此，将使聚合物溶解的溶剂从得到原液中除去 （也称为脱溶剂或凝固），进行纤维形成，得到未拉伸丝。湿式纺丝中使 用的凝固液只要是能够脱溶剂的溶液，则可是任何溶液。用于使溶剂脱离、 纤维形成的凝固液优选使用甲醇、乙醇、2-丙醇等碳原子数为1～5的低级 醇或丙酮。可以适当加入水。凝固液的温度优选为5～30℃。只要在上述范 围内，则纺丝稳定。通过将所述纺丝液从纺丝头挤出到脱溶剂槽的凝固液 中来得到未拉伸丝。在为具有直径为0.1～0.6mm的喷嘴的注射泵的情况下， 挤出速度优选每孔为0.2～6.0ml/h。进一步优选的挤出速度为每孔为 1.4～4.0ml/h。在该范围内时，纺丝稳定。脱溶剂槽（凝固液槽）的长度为 200～500mm、未拉伸丝的牵引速度优选为1～14m/min、滞留时间优选为 0.01～0.15min。更优选的未拉伸丝的牵引速度为1～3m/min。在该范围内时， 脱溶剂可高效地进行。凝固液中，也可进行拉伸（前拉伸），但当考虑低级 醇的蒸发时，优选将凝固液维持在低温，以未拉伸丝的状态牵引。

（2）拉伸

拉伸可以为一阶段拉伸，也可以为两阶段以上的多阶段拉伸。由于天 然型蛛丝蛋白来源的多肽的分子难以取向，通过多阶段地进行拉伸，使分 子多阶段地取向，还能够提高总拉伸倍率，因此结果能够得到韧性高的纤 维。

图1～2为多阶段拉伸的例子，图1表示纺丝和拉伸的连续工序。纺丝 拉伸装置10包含挤出装置1、未拉伸丝制造装置2、湿热拉伸装置3、干热 拉伸装置4。纺丝液6贮藏在贮槽7中，通过齿轮泵8从纺丝头9挤出。在 实验室规模（Labscale）中，可以将纺丝液充填到滚筒中，用注射泵从喷嘴 挤出。被挤出的纺丝液具有空隙19地或直接供给至凝固液槽20的凝固液 11内，将溶剂除去。接着，供给至拉伸浴槽21内的温水12内，进行第一 阶段拉伸。拉伸倍率由供给夹持辊13与牵引夹持辊14之间的速度比决定。 接着，供给至干热拉伸装置17。在丝道22内进行第二阶段拉伸，制成卷丝 体5。拉伸倍率由供给夹持辊15与牵引夹持辊16之间的速度比决定。 18a～18f为导丝器。

图2A-B为两阶段拉伸的例子。图2A表示纺丝装置30和第一阶段拉 伸装置40、图2B表示第二阶段拉伸装置50。各装置中，还可以将丝卷取 或不卷取地留存在容器中。纺丝装置30中，将纺丝液32预先加入到微型 注射器31内，用注射泵使其沿箭头P方向移动，将纺丝液32从喷嘴33挤 出，供给至凝固液槽34内的凝固液35中，制成未拉伸丝36。然后，在第 一阶段拉伸装置40中，将未拉伸丝36供给至拉伸浴槽37内的温水38内， 进行第一阶段拉伸，制成第一阶段拉伸丝的卷丝体39。拉伸倍率由供给夹 持辊41与牵引夹持辊42之间的速度比决定。接着，从卷丝体39牵出第一 阶段拉伸丝，供给至干热拉伸装置43，在丝道47内进行第二阶段拉伸。拉 伸倍率由供给夹持辊45与牵引夹持辊46之间的速度比决定。接着，将拉 伸丝卷取成卷丝体44。

图3～4为一阶段拉伸的例子，图3表示纺丝和拉伸的连续工序。纺丝 拉伸装置60包含挤出装置61、未拉伸丝制造装置62和干热拉伸装置63。 纺丝液66贮藏在贮槽67中，通过齿轮泵68从纺丝头69挤出。在实验室 规模中，可以将纺丝液充填到滚筒中，用注射泵从喷嘴挤出。被挤出的纺 丝液具有空隙73地或直接供给至凝固液槽72的凝固液71内，将溶剂除去。 接着，供给至干热拉伸装置77，在丝道78内进行拉伸，制成卷丝体64。 拉伸倍率由供给夹持辊75与牵引夹持辊76之间的速度比决定。74a～74f 为导丝器。

图4A-B为纺丝和拉伸分离的例子的说明图。图4A表示纺丝装置80、 图4B表示拉伸装置90。各装置中，可以将丝卷取或不卷取地留存在容器 中。纺丝装置80中，将纺丝液82预先加入微型注射器81内，用注射泵使 其沿箭头P方向移动，将纺丝液82从喷嘴83挤出，供给至凝固液槽84内 的凝固液85中，制成未拉伸丝的卷丝体86。然后，在拉伸装置90中，将 未拉伸丝从卷丝体86牵出，供给至干热拉伸装置89，在丝道91内进行拉 伸。拉伸倍率由供给夹持辊87与牵引夹持辊88之间的速度比决定。接着， 将拉伸丝卷取成卷丝体92。由此，得到拉伸丝。

通过湿式纺丝-拉伸得到的人造多肽纤维优选直径在5～100μm的范围 内。当在上述范围内时，可稳定地得到纤维。更优选的纤维直径为8～50μm 的范围、进一步优选为10～30μm的范围。通过湿式纺丝-拉伸得到的人造多 肽纤维的截面不限于圆形而包括各种形状，因此是指将截面假定为圆形时 的平均直径。

5.流延膜

本发明的多肽溶液可以以原液形式制成流延膜。例如将原液以规定的 厚度流延到玻璃板等对原液中的溶剂具有耐受性的平板上，然后从所述流 延膜使溶剂脱离而得到人造多肽膜。为了将原液以规定的厚度流延，使用 刮涂机（doctor coater）、刮刀式涂布机（knife coater）等冶具以数微米以 上的厚度进行流延，然后通过减压干燥或浸渍到脱溶剂槽中将溶剂脱离， 从而获得。

6.交联

本发明的人造多肽纤维或膜可以使多肽分子间进行化学交联。可用于 多肽交联的官能团例如有氨基、羧基、巯基、羟基等，但并不限定于这些。 多肽中所含的赖氨酸侧链的氨基可通过与谷氨酸或天冬氨酸侧链的羧基脱 水缩合而通过酰胺键交联。交联可以在真空加热下进行脱水缩合反应，也 可以利用碳二亚胺等脱水缩合剂使其交联。另外，还可以使用戊二醛等交 联剂。另外，还可以利用转谷氨酰胺酶等酶进行交联。作为一个例子，可 以利用碳二亚胺、戊二醛、多官能环氧树脂（一个例子为Nagasechemtex 公司制，商品名“DENACOL”）等交联剂使其发生交联反应。碳二亚胺 用通式R¹N=C=NR²（其中，R¹、R²表示包含碳原子数为1～6的烷基、环烷 基在内的有机基团。）表示，具体的化合物有1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基） 碳二亚胺盐酸盐（EDC）、N,N’-二环己基碳二亚胺（DCC）、1-环己基-3-（2- 吗啉代乙基）碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺（DIC）等。其中，EDC、DIC 的肽链的酰胺键形成能力高、易于发生交联反应，因此优选。交联处理可 以在原液中加入交联剂后进行交联，也可以在对拉伸丝赋予交联剂后在真 空加热干燥下进行交联。交联剂可以将100%的交联剂赋予纤维，也可以在 用碳原子数为1～5的低级醇或缓冲液等稀释后以0.005～10质量%的浓度赋 予纤维。处理条件优选温度为20～45℃、3～42小时。通过利用交联剂的交 联处理，能够提高人造多肽拉伸纤维的强度、韧性、耐化学品性。

7.多肽的精制方法

可以使用所述多肽溶液对多肽进行精制。特别是多肽为不溶性的蛋白 时效果高。本发明中，“不溶性的蛋白”是指水不溶性的蛋白即疏水性高 的蛋白。具体地，在所述天然蛛丝蛋白来源的多肽中添加含有上述（i）～ （iii）中的任一种物质的溶剂，进行热处理使其溶解后，回收上清，得到 多肽溶液。所述热处理的条件只要是能够将不溶性的蛋白溶解且不会使蛋 白分解的条件，则没有特殊限定。例如，热处理的温度从溶解性的观点出 发，优选为45℃以上、更优选为50℃以上。另外，从抑制分解的观点出发， 热处理的温度优选为100℃以下、更优选为95℃以下。另外，热处理的时 间例如优选为15～300分钟、更优选为30～180分钟。另外，所述上清的回 收只要能够将沈降物分离，则没有特殊限定，但从操作的简便性出发，优 选通过利用过滤的分离或离心分离来进行。利用过滤的分离例如可以使用 滤纸、过滤膜等来进行。离心分离的条件没有特殊限定，例如可以以11000×g 进行5分钟。

所述天然蛛丝蛋白来源的多肽为重组蛛丝蛋白时，从进一步提高精制 度的观点出发，在添加所述溶剂之前，优选将重组蛛丝蛋白用阴离子表面 活性剂、例如SDS洗涤。具体地，将表达重组蛛丝蛋白的宿主细胞破碎， 以沉淀物形式提取含有重组蛛丝蛋白的不溶性的蛋白级分，然后用阴离子 表面活性剂洗涤含有提取的重组蛛丝蛋白的不溶性的蛋白。

如上所述，由于将天然蛛丝蛋白来源的多肽溶解于所述溶剂而得到的 多肽溶液能够以原液的形式使用，因此通过上述多肽的精制方法精制得到 的多肽溶液不需要通过冷冻干燥制成粉末，可以直接以原液的形式使用。

实施例

使用以下实施例对本发明进一步具体地进行说明。需要说明的是，本 发明并不限于下述的实施例。

（重组蛛丝蛋白）

<基因合成>

（1）ADF3Kai基因的合成

从NCBI的web数据库获得作为十字园蛛的两种主要的拖丝蛋白之一 的ADF3的部分氨基酸序列（NCBI登录号：AAC47010、GI：1263287）， 委托GenScript公司合成编码在该序列的N末端添加了由起始密码子、His10 标签和HRV3C蛋白酶（人鼻病毒3C蛋白酶）识别位点构成的氨基酸序列 （序列号5）的氨基酸序列（序列号6）的基因。其结果，获得了由序列号 7所示的碱基序列构成的导入了ADF3Kai基因的pUC57载体（基因在5’ 末端紧接的上游具有Nde I位点、和在5’末端紧接的下游具有Xba I位点）。 其后，用Nde I和EcoR I对该基因进行限制性酶处理，重组到pET22b（+） 表达载体中。

（2）ADF3Kai-Large基因的合成

以ADF3Kai为模板，使用T7启动子引物（序列号11）和Rep Xba I 引物（序列号12）进行PCR反应，对ADF3Kai的基因序列中的5’侧一半 的序列（以下记为序列A）进行扩增，将该片段重组到使用Mighty Cloning  Kit（Takara Bio株式会社制）预先用Nde I和Xba I进行了限制性酶处理的 pUC118载体中。同样地，以ADF3Kai为模板，使用Xba I Rep引物（序列 号14）和T7终止子引物（序列号13）进行PCR反应，对ADF3Kai的基 因序列中3’侧一半的序列（以下记为序列B）进行扩增，将该片段重组到 使用Mighty Cloning Kit（Takara Bio株式会社制）预先用Xba I、EcoR I进 行了限制性酶处理的pUC118载体中。将导入了序列A的pUC118载体用 Nde I、Xba I进行限制性酶处理，将导入了序列B的pUC118载体用Xba I、 EcoR I进行限制性酶处理，通过切出凝胶对序列A和序列B的目标DNA 片段进行精制。使DNA片段A、B与预先用Nde I和EcoR I进行了限制性 酶处理的pET22b（+）进行连接反应，转化到大肠杆菌DH5α中。利用使 用了T7启动子引物和T7终止子引物的克隆PCR，在确认了目标DNA片 段插入后，将目标大小（3.6kbp）的条带从得到的克隆中提取质粒，通过使 用了3130xl Genetic Analyzer（Applied Biosystems）的序列反应对全碱基序 列进行确认。其结果，确认构建了序列号9所示的ADF3Kai-Large基因。 其中，ADF3Kai-Large的氨基酸序列如序列号4所示。

（3）ADF3Kai-Large-NRSH1基因的合成

以导入了上述中得到的ADF3Kai-Large基因的pET22b（+）载体为模 板，通过使用了Prime Star Mutagenesis Basal Kit（Takara Bio株式会社制） 的部位特异性变异导入，使ADF3Kai-Large的氨基酸序列（序列号4）中 的与第1155号氨基酸残基甘氨酸（Gly）对应的密码子GGC变异为终止密 码子TAA，在pET22b（+）上构建序列号10所示的ADF3Kai-Large-NRSH1 基因。关于变异导入的准确性，通过使用了3130xl Genetic Analyzer（Applied  Biosystems）的序列反应进行确认。其中，ADF3Kai-Large-NRSH1的氨基 酸序列如序列号8所示。

（4）ADF4Kai基因的合成

从NCBI的web数据库（NCBI登录号：AAC47011、GI：1263289） 获得作为十字园蛛的两种主要的拖丝蛋白之一的ADF4的部分氨基酸序列， 合成编码由在该序列的N末端添加了由起始密码子、His10标签和HRV3C 蛋白酶识别位点构成的氨基酸序列（序列号5）的氨基酸序列（序列号15） 构成的蛋白ADF4Kai的基因。其结果，获得了由序列号16所示的碱基序 列构成的导入了ADF4Kai基因的pUC57载体（基因在5’末端紧接的上游 具有Nde I位点、和在5’末端紧接的下游具有Xba I位点）。其后，用Nde I 和EcoR I对该基因进行限制性酶处理并重组到pET22b（+）表达载体中， 得到导入有ADF4Kai的基因的pET22b（+）载体。

（5）MaSp2_N基因的合成

从NCBI的web数据库（NCBI登录号：AAT75313、GI：50363147） 获得作为Nephila clavipes的大壶状腺丝蛋白（MaSp2）的部分氨基酸序列， 合成编码由在该序列的N末端添加了由起始密码子、His10标签和HRV3C 蛋白酶识别位点构成的氨基酸序列（序列号5）的氨基酸序列（序列号17） 构成的蛋白MaSp2_N的基因。其结果，获得了由序列号18所示的碱基序 列构成的导入了MaSp2_N基因的pUC57载体（基因在5’末端紧接的上游 具有Nde I位点、和在5’末端紧接的下游具有Xba I位点）。其后，用Nde I 和EcoR I对该基因进行限制性酶处理，重组到pET22b（+）表达载体中， 得到导入有MaSp2_N的基因的pET22b（+）载体。

（6）Flag_92_short2基因的合成

从NCBI的web数据库获得Nephila clavipes的鞭毛状丝蛋白的部分序 列（NCBI登录号：AAF36090、GI：7106224），提取从相当于重复部分及 基序的N末端开始的第1220个残基～第1659个残基的氨基酸序列（记为 PR1序列。）。另外，从NCBI的web数据库获得Nephila clavipes的鞭毛 状丝蛋白的部分序列（NCBI登录号：AAC38847、GI：2833649），提取 从C末端开始的第816个残基～第907个残基的C末端氨基酸序列（记为C 末NR。）。合成编码由在结合有PR1序列和C末NR的N末端添加了由 起始密码子、His10标签和HRV3C蛋白酶识别位点构成的氨基酸序列（序 列号5）的氨基酸序列（序列号19）构成的蛋白Flag_92_short2的基因。 其结果，获得了由序列号20所示的碱基序列构成的导入了Flag_92_short2 的基因的pUC57载体（基因在5’末端紧接的上游具有Nde I位点、和在5’ 末端紧接的下游具有Xba I位点）。其后，用Nde I和EcoR I对该基因进行 限制性酶处理，重组到pET22b（+）表达载体中，得到导入有Flag_92_short2 的基因的pET22b（+）载体。

<蛋白的表达>

将包含上述得到的ADF3Kai-Large-NRSH1的基因序列的pET22b（+） 表达载体、包含ADF4Kai的基因序列的pET22b（+）表达载体、包含 MaSp2_N的基因序列的pET22b（+）表达载体、包含Flag_92_short2的基 因序列的pET22b（+）表达载体转化到大肠杆菌Rosetta（DE3）中。将得 到的单克隆在含有氨苄青霉素的2mL的LB培养基中培养15小时后，将该 培养液1.4ml添加到含有氨苄青霉素的140mL的LB培养基中，在37℃、 200rpm的条件下进行培养，直至培养液的OD₆₀₀达到3.5。接着，将OD₆₀₀为3.5的培养液与50%葡萄糖140mL一起加入到含有氨苄青霉素的7L的 2×YT培养基中进一步进行培养，直至OD₆₀₀达到4.0。其后，向得到的OD₆₀₀ 为4.0的培养液中添加异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）使终浓度达 到0.5mM，诱导蛋白表达。在IPTG添加后的2小时时，将培养液离心分 离，回收菌体。将由IPTG添加前和IPTG添加后的培养液制备的蛋白溶液 进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果观察到依赖于IPTG添加的目标大小 （ADF3Kai-Large-NRSH1为约101.1kDa、ADF4Kai为约37.7kDa、MaSp2_N 为约31.7kDa、Flag_92_short2为约46.6kDa）的条带，从而确认了目标蛋 白表达。将表达ADF3Kai-Large-NRSH1蛋白的大肠杆菌、表达ADF4Kai 蛋白的大肠杆菌、表达MaSp2_N蛋白的大肠杆菌及表达Flag_92_short2蛋 白的大肠杆菌保持在冷冻室（-20℃）中。

（实施例1）

（1）所用蛋白

（I）向离心管（50ml）中添加表达ADF3Kai-Large-NRSH1蛋白的 大肠杆菌的菌体约4.5g和缓冲液AI（20mM Tris-HCl、pH为7.4）30ml， 用混合器（GE公司制“SI-0286”、10级）使菌体分散，然后用离心分离 机（TOMY精工制的“MX-305”）进行离心分离（10000rpm、10分钟、 室温），弃去上清。

（II）向通过离心分离得到的沉淀物（菌体）中添加缓冲液AI30ml 和0.1M的PMSF（用异丙醇溶解）0.3ml，用上述GE公司制的混合器（10 级）分散3分钟。其后，用超声粉碎机（SONIC&MATERIALSINC制 “VCX500”）将菌体粉碎，进行离心分离（10000rpm、10分钟、室温）。

（III）向通过离心分离得到的沉淀物中加入缓冲液AI30mL，用混合 器（IKA公司制“T18BASIC ULTRA-TURRAX”、2级）分散3分钟后， 用上述TOMY精工制的离心分离机进行离心分离（10000rpm、10分钟、 室温），除去上清。

（IV）向弃去了上清的离心管中加入7.5M的尿素缓冲液I（7.5M尿 素、10mM磷酸二氢钠、20mM NaCl、1mM Tris-HCl、pH为7.0），用上 述SMT公司制的超声粉碎机（7级）使沉淀充分分散。其后，用上述TAITEC 公司制的振荡器（200rpm、60℃）使其溶解120分钟。将溶解后的蛋白溶 液用上述TOMY精工制的离心分离机离心分离（11000×g、10分钟、室温）， 将上清用透析管（三光纯药株式会社纤维素管36/32）并用水进行透析。将 透析后得到的白色的凝集蛋白通过离心分离回收，用冷冻干燥机除去水分， 回收冷冻干燥粉末。得到的冷冻干燥粉末中的目标蛋白ADF3Kai-Large- NRSH1（约101.1kDa）的精制度通过使用Totallab（nonlinear dynamics ltd.） 对粉末的聚丙烯酰胺凝胶电泳（CBB染色）结果进行图像分析来确认。其 结果，ADF3Kai-Large-NRSH1的精制度为约85%。

2.溶剂

（1）极性溶剂

关于溶剂，以丙烯酸纤维的聚合、纺丝液用、用作聚酰亚胺的聚合溶 剂的极性溶剂为中心进行研究。

DMA：N,N-二甲基乙酰胺

DMF：N,N-二甲基甲酰胺

DMI：1,3-二甲基-2-咪唑啉酮

NMP：N-甲基-2-吡咯烷酮

HFIP：六氟异丙醇

DMSO：二甲基亚砜

甲酸

碳酸丁二醇酯

碳酸丙二醇酯

γ-丁内酯

六甲基磷酰胺

（2）溶解促进剂（无机盐）

研究了下述无机盐。

碱金属卤化物：LiCl、LiBr

碱土类金属卤化物：CaCl₂

碱土类金属硝酸盐：Ca（NO₃）₂

硫氰酸钠：NaSCN

<实验1>

如表1所示，用极性溶剂和在其中加入了无机盐的体系中进行溶解性 试验。将温度设为100℃。将天然蛛丝蛋白来源的多肽（蛋白）的浓度设为 4质量%。下述表1中按照以下基准对进行以下的溶解性评价。其中，表1 中，无机盐的质量%为无机盐相对于极性溶剂与无机盐的总质量的质量比 例。

[溶解性评价基准]

A溶解。

B大部分溶解，但残留一部分不溶物。

C不溶解。

表1

（备注1）EtOH为乙醇、MeOH为甲醇。

（备注2）HFIP的沸点低，因此在37℃溶解。另外，HFIP中盐（LiCl）不溶解。

（备注3）在甲酸作用下蛋白质的分解用质谱确认。

（备注4）表1中，“—”表示未进行实验。

从表1可知，含有下述（i）～（iii）的溶剂选择性地优异。

（i）二甲基亚砜：DMSO

（ii）在二甲基亚砜：DMSO中加入无机盐而成的溶剂

（iii）在N,N-二甲基甲酰胺：DMF中加入无机盐而成的溶剂

另外还可知，即使是在上述（i）～（iii）的物质中加入乙醇、甲醇、超 纯水而成的体系中溶解性也高。

接着，对表1的溶解性评价基准为A的溶剂的可纺性进行了研究。可 纺性通过能否采用湿式纺丝，在图4A所示的纺丝工序中，将纺丝液充填到 滚筒中，从0.3mm直径的喷嘴用注射泵以2.0ml/h的速度挤出，在100质 量%的甲醇凝固液中提取溶剂、制作未拉伸丝来判定。凝固液槽的长度为 250mm、卷取速度为2.1m/min。其结果，表1的溶解性评价基准为A的溶 剂均具有可纺性。

<实验2>

提高天然蛛丝蛋白来源的多肽（蛋白）的浓度，进行实验。对在100℃ 的溶剂中是否溶解40、45、50质量%的蛋白进行了研究。其结果如表2所 示。其中，DMF（LiCl浓度为14.4质量%）、DMSO（LiCl浓度为10质 量%）的溶解物即使降低到室温（25℃）也稳定地溶解。

表2

（备注1）在甲酸作用下蛋白质的分解用质谱确认。

（备注2）HFIP的沸点低，因此在37℃溶解。

（备注3）表2中，“—”表示未进行实验。

从表2可知，当在DMSO中添加无机盐时，蛋白直至40质量%都充分 良好地溶解（溶解性的边界为43质量%），当在DMF中添加盐时，蛋白 直至45质量%都充分良好地溶解（溶解性的边界为48质量%）。

<实验3>

接着，使用DMSO在100℃下将蛋白溶解，直接进行温度保持或者将 多肽溶液的温度降至低温并保持3小时，观察其稳定性。结果示于表3。

表3

从表3确认了，若LiCl浓度为10质量%，则当蛋白浓度为40质量% 以下时在25～100℃的实用温度范围内是稳定的。

（实施例2）

（1）纺丝液（原液）

使用实施例1中使用的蛋白制成纺丝液（原液）。首先，将冷冻干燥 粉末添加到含有10质量%LiCl的DMSO（100℃）中，使冷冻干燥粉末（蛋 白）的浓度达到20质量%。用旋转器溶解6小时后，除去废物和泡。溶液 粘度为1200cP（厘泊）。将其作为纺丝液（原液）。

（2）纺丝-拉伸工序

从纺丝工序到拉伸工序使用图2A所示的方法。将纺丝液填充到滚筒 中，使用注射泵从0.3mm直径的喷嘴以2.0ml/h的速度挤出至100质量% 甲醇凝固液中，提取溶剂，制作未拉伸丝。使凝固液槽的长度为250mm、 使卷取速度为2.1ml/h。接着，作为拉伸，将未拉伸丝在50℃的温水中拉伸 至4.5倍。使卷取速度为9.35m/min。

（3）物性测定

（a）用光学显微镜求出纤维的直径。

（b）拉伸试验

在温度为25℃、相对湿度为60%的气氛温度下使用拉伸试验机（岛津 公司制小型台式试验机EZ-S）测定纤维的强度（应力）、初始弹性模量（20 点的最大斜率。以50msec间隔进行测定，将以20点间隔进行斜率计算时 的最大斜率作为初始弹性模量。）、伸长率，算出韧性。将样品贴到用厚纸 制作的框架上，在夹具间距离为20mm、拉伸速度为10mm/min下进行。测 力传感器容量为1N、夹具为clip式。测定值取样品数n=5的平均值。韧性 的计算式如下。

韧性=[E/（r²×π×L）×1000]（单位：MJ/m³）

其中：

E：破坏能量（单位：J）

R：纤维的半径（单位：mm）

π：圆周率

L：拉伸试验测定时的夹具间距离

将各物性值汇总示于表4。另外，得到的纤维的应力-变位（变形）曲 线如图5所示。

（实施例3）

将与实施例2相同的纺丝液填充到滚筒中，用注射泵从0.3mm直径的 喷嘴以1.4ml/h的速度挤出，在100质量%甲醇凝固液中提取溶剂，制作未 拉伸丝。使凝固液槽的长度为250mm、使卷取速度为2.2m/min。接着，作 为拉伸，将未拉伸丝在50℃的温水中拉伸至3.5倍。使卷取速度为7.7m/min。 其后，通过160℃的干热拉伸拉伸至1.25倍。从纺丝工序到拉伸工序使用 图2A-B所示的方法。

如上测定得到的纤维的各种物性值，将其结果汇总示于表4。另外，将 得到的纤维的应力-变位（变形）曲线示于图6。

表4

（实施例4）

除了仅使蛋白的浓度为7质量%、使溶剂为DMSO以外，与实施例2 同样地制作了纺丝液。使用了图2A-B所示的纺丝装置。湿式纺丝中的各条 件如下所述。

（1）挤出-凝固工序

挤出喷嘴直径：0.3mm

挤出速度：3.0ml/h

凝固液槽的液温：10℃

（2）第一阶段拉伸

在50℃的温水中，以2.5倍的拉伸倍率、5.5m/min（55rpm）的卷取速 度卷取3.5分钟。

（3）第二阶段拉伸

在190℃的干热炉中，以20rpm的送出速度、31rpm（1.55倍拉伸）的 卷取速度进行拉伸。

（4）得到的拉伸丝的物性

得到的拉伸丝的物性如上进行测定。其结果，单纤维的平均直径为 22.0μm、最大点应力为99.2MPa、初始弹性模量为3.5GPa、断裂点变位（伸 长率）为8.7%、韧性为6.8MJ/m³。得到的单纤维的应力-变位（变形）曲 线如图7所示。

（实施例5）

除了仅使蛋白的浓度为10质量%、使溶剂为DMSO以外，与实施例2 同样地制作纺丝液。当溶剂不含有无机盐等溶解促进剂时，若蛋白为高浓 度，则会发生凝胶化。因此，将图2A所示的注射器31用加热器加热到60℃， 在防止凝胶化的同时进行纺丝。湿式纺丝‐拉伸使用了图2A-B所示的纺丝 装置。湿式纺丝的各条件如下所述。

（1）挤出-凝固工序

注射器加热器的温度：60℃

挤出喷嘴直径：0.2mm

挤出速度：4.0ml/h

凝固液槽的液温：10℃

（2）第一阶段拉伸

在50℃的温水中，以3.5倍的拉伸倍率、7.7m/min（77rpm）的卷取速 度卷取4分钟。

（3）第二阶段拉伸

在180℃的干热炉中，以20rpm的送出速度、26rpm（1.3倍拉伸）的 卷取速度进行拉伸。

（4）得到的拉伸丝的物性

得到的拉伸丝的物性如上进行测定。其结果，单纤维的平均直径为 22.0μm、最大点应力为285.9MPa、初始弹性模量为7.6GPa、断裂点变位（伸 长率）为14.8%、韧性为35.5MJ/m³。得到的单纤维的应力-变位（变形） 曲线如图8所示。

（实施例6）

（1）所用蛋白

（I）向离心管（50ml）中添加表达ADF4Kai蛋白的大肠杆菌的菌体 约4.5g和缓冲液AI（20mM Tris-HCl、pH为7.4）30ml，用混合器（GE 公司制“SI-0286”，10级）使菌体分散，然后用离心分离机（TOMY精工 制的“MX-305”）进行离心分离（10000rpm、10分钟、室温），弃去上 清。

（II）向通过离心分离得到的沉淀物（菌体）中添加缓冲液AI30ml 和0.1M的PMSF（用异丙醇溶解）0.3ml，用上述GE公司制的混合器（10 级）分散3分钟。其后，用超声粉碎机（SONIC&MATERIALSINC制 “VCX500”）将菌体粉碎，进行离心分离（10000rpm、10分钟、室温）。

（III）向通过离心分离得到的沉淀物（不溶性级分的蛋白）中加入含 有3w/v%的SDS的缓冲液B（50mM Tris-HCl、100mM NaCl、pH为7.0） 30mL，用混合器（IKA公司制“T18BASIC ULTRA-TURRAX”、2级） 分散3分钟后，用振荡器（TAITEC公司制的Bioshaker“BR-43FL”、200rpm、 37℃）搅拌60分钟。然后用上述TOMY精工制的离心分离机进行离心分 离（10000rpm、10分钟、室温），除去上清。

（IV）除去上清并用80℃的DMSO（含有2M LiCl）将沉淀物溶解， 用搅拌器搅拌，然后用上述TOMY精工制的离心分离机进行离心分离 （11000×g、10分钟、室温），用透析管（三光纯药株式会社纤维素管36/32） 对上清用水进行透析。通过离心分离回收透析后得到的白色的凝集蛋白， 用冷冻干燥机除去水分，回收冷冻干燥粉末。关于得到的冷冻干燥粉末中 的目标蛋白ADF4Kai（约37.7kDa）的精制度，用ImageLab（Bio-RAD  Laboratories、Inc）对粉末的聚丙烯酰胺凝胶电泳（利用Bio-RAD制的Oriole  Fluorescent Gel Stain进行Oriole染色）结果进行图像分析来确认。其结果， ADF4Kai的精制度为约75.5%。

（2）纺丝液（原液）

使用上述得到的ADF4Kai的蛋白制作纺丝液。将冷冻干燥粉末添加到 加热到80℃的DMSO中，使其浓度达到10.2质量%。用旋转器溶解6小时 后，除去废物和泡。溶液粘度为1200cP（厘泊）。将其作为纺丝液。

（3）纺丝-拉伸工序

使用上述得到的纺丝液进行湿式纺丝。挤出-凝固工序使用了图4A所 示的纺丝装置。湿式纺丝的各条件如下所示。

（I）挤出-凝固工序

挤出喷嘴直径：0.3mm

挤出速度：6.0ml/h

凝固液槽的液温：4℃

卷取速度：13.6m/min

（II）第一阶段拉伸

在50℃的温水中，以1.5倍的拉伸倍率进行拉伸。

（III）第二阶段拉伸

在180℃的干热炉中，以1.3倍的拉伸倍率进行拉伸。

（IV）得到的拉伸丝的物性

得到的拉伸丝的物性如上进行测定。其结果，单纤维的平均直径为 83.8μm、最大点应力为196.4MPa、初始弹性模量为6.0GPa、断裂点变位（伸 长率）为14.6%、韧性为24.6MJ/m³。得到的单纤维的应力-变位（变形） 曲线如图9所示。

（实施例7）

（1）所用蛋白

（I）向离心管（50ml）中添加表达MaSp2_N的蛋白的大肠杆菌的菌 体约4.5g和缓冲液AI（20mM Tris-HCl、pH为7.4）30ml，用混合器（GE 公司制“SI-0286”、10级）使菌体分散，然后用离心分离机（TOMY精工 制的“MX-305”）进行离心分离（10000rpm、10分钟、室温），弃去上 清。

（II）向通过离心分离得到的沉淀物（菌体）中添加缓冲液AI30ml 和0.1M的PMSF（用异丙醇溶解）0.3ml，用上述GE公司制的混合器（10 级）分散3分钟。其后，用超声粉碎机（SONIC&MATERIALSINC制 “VCX500”）将菌体粉碎，进行离心分离（10000rpm、10分钟、室温）。

（III）向通过离心分离得到的沉淀物（不溶性级分的蛋白）中加入含 有3w/v%的SDS的缓冲液B（50mM Tris-HCl、100mM NaCl、pH为7.0） 30mL，用混合器（IKA公司制“T18BASIC ULTRA-TURRAX”、2级） 分散3分钟后，用振荡器（TAITEC公司制的Bioshaker“BR-43FL”、200rpm、 37℃）搅拌60分钟。然后用上述TOMY精工制的离心分离机进行离心分 离（10000rpm、10分钟、室温），除去上清。

（IV）除去上清并用80℃的DMSO（含有2M LiCl）将沉淀物溶解， 用搅拌器搅拌，然后用上述TOMY精工制的离心分离机进行离心分离 （11000×g、10分钟、室温），用透析管（三光纯药株式会社纤维素管36/32） 对上清用水进行透析。通过离心分离回收透析后得到的白色的凝集蛋白， 用冷冻干燥机除去水分，回收冷冻干燥粉末。关于得到的冷冻干燥粉末中 的目标蛋白MaSp2_N（约31.7kDa）的精制度，用ImageLab（Bio-RAD Laboratories、Inc）对粉末的聚丙烯酰胺凝胶电泳（Oriole染色）结果进行 图像分析来确认。其结果，MaSp2_N的精制度为约68.1%。

（2）纺丝液（原液）

使用上述得到的MaSp2_N的蛋白制作纺丝液。将冷冻干燥粉末添加到 加热到40℃的DMSO中，使其浓度达到18质量%。用旋转器溶解6小时 后，除去废物和泡。溶液粘度为1200cP（厘泊）。将其作为纺丝液。

（3）纺丝-拉伸工序

使用上述得到的纺丝液进行湿式纺丝。挤出-凝固工序使用了图4A所 示的纺丝装置。湿式纺丝的各条件如下所示。

（I）挤出-凝固工序

挤出喷嘴直径：0.2mm

挤出速度：2.0ml/h

凝固液槽的液温：10℃

卷取速度：2.5m/min

（II）第一阶段拉伸

在50℃的温水中，以2.5倍的拉伸倍率进行拉伸。

（III）第二阶段拉伸

在80℃的干热炉中，以1.85倍的拉伸倍率进行拉伸。

（IV）得到的拉伸丝的物性

得到的拉伸丝的物性如上地进行测定。其结果，单纤维的平均直径为 35μm、最大点应力为236.7MPa、初始弹性模量为5.7GPa、断裂点变位（伸 长率）为14.9%、韧性为26.5MJ/m³。得到的单纤维的应力-变位（变形） 曲线如图10所示。

（实施例8）

（1）所用蛋白

（I）向离心管（50ml）中添加表达Flag_92_short2的蛋白的大肠杆菌 的菌体约4.5g和缓冲液AI（20mM Tris-HCl、pH为7.4）30ml，用混合器 （GE公司制“SI-0286”、10级）使菌体分散，然后用离心分离机（TOMY 精工制的“MX-305”）进行离心分离（10000rpm、10分钟、室温），弃 去上清。

（II）向通过离心分离得到的沉淀物（菌体）中添加缓冲液AI30ml 和0.1M的PMSF（用异丙醇溶解）0.3ml，用上述GE公司制的混合器（10 级）分散3分钟。其后，用超声粉碎机（SONIC&MATERIALSINC制 “VCX500”）将菌体粉碎，超声粉碎重复进行20秒处理和5秒停止，共 计进行8分钟。

（III）用离心分离机（TOMY精工制的“MX-305”）对经超声粉碎的 菌体进行离心分离（11000×g、30分钟、室温）。

（IV）向离心分离得到的上清（可溶性级分的蛋白）中添加Ni琼脂糖 （50%料浆、GE Healthcare公司制，型号“17-5318-02”），用混合器 （IKA公司制“T18BASIC ULTRA-TURRAX”、2级）分散3分钟，然后 用搅拌器搅拌60分钟。其后，用上述TOMY精工制的离心分离机进行离 心分离（500×g、5分钟、室温），除去上清。将上述Ni琼脂糖填充到空 的柱子（GE Healthcare公司制，型号“17-0435-01”）中，用缓冲液 AI洗涤，用洗脱缓冲液（50mM Tris、50mM NaCl、300mM咪唑、pH为 7.5）将Flag_92_short2的蛋白洗脱。

（V）用透析管（三光纯药株式会社纤维素管36/32）对得到的洗脱液 用水进行透析。用冷冻干燥机将透析后得到的液体的水分除去，回收冷冻 干燥粉末。关于得到的冷冻干燥粉末中的目标蛋白Flag_92_short2（约 46.6kDa）的精制度，通过用ImageLab（Bio-RAD Laboratories、Inc）对粉 末的聚丙烯酰胺凝胶电泳（Oriole染色）结果进行图像分析来进行确认。 其结果，Flag_92_short2的精制度为约69.1%。

（2）纺丝液（原液）

使用上述得到的Flag_92_short2的蛋白制作纺丝液。将冷冻干燥粉末 添加到加热到45℃的DMSO中，使其浓度达到23质量%。用旋转器溶解6 小时后，除去废物和泡。溶液粘度为1200cP（厘泊）。将其作为纺丝液。

（3）纺丝-拉伸工序

使用上述得到的纺丝液进行湿式纺丝。挤出-凝固工序使用了图4A所 示的纺丝装置。湿式纺丝的各条件如下所示。

（I）挤出-凝固工序

挤出喷嘴直径：0.2mm

挤出速度：1.0ml/h

凝固液槽的液温：10℃

卷取速度：1.65m/min

（II）第一阶段拉伸

在室温的空气中，以1.5倍的拉伸倍率进行拉伸。将该阶段中得到的纤 维记为一次拉伸丝。

（III）第二阶段拉伸

在160℃的干热炉中，以1.34倍的拉伸倍率进行拉伸。将该阶段中得 到的纤维记为二次拉伸丝。

（IV）得到的拉伸丝的物性

得到的一次拉伸丝及二次拉伸丝的物性如上地进行测定。其结果如下 述表5所示。另外，得到的一次拉伸丝及二次拉伸丝的单纤维的应力-变位 （变形）曲线分别示于图11及图12。

表5

（实施例9）

<蛋白的提取>

（1）向离心管（50ml）中添加表达ADF3Kai-Large-NRSH1的蛋白的 大肠杆菌的菌体约4.5g和缓冲液AI（20mM Tris-HCl、pH为7.4）30ml， 用混合器（GE公司制“SI-0286”、10级）使菌体分散，然后用离心分离 机（TOMY精工制的“MX-305”）进行离心分离（10000rpm、10分钟、 室温），弃去上清。

（2）向通过离心分离得到的沉淀物（菌体）中添加缓冲液AI30ml和 0.1M的PMSF（用异丙醇溶解）0.3ml，用上述GE公司制的混合器（10级） 分散3分钟。其后，用超声粉碎机（SONIC&MATERIALSINC制 “VCX500”）将菌体粉碎，进行离心分离（10000rpm、10分钟、室温）。 弃去上清后，通过放置到冰水中约10分钟左右来散热。再次重复同样的菌 体的粉碎和离心分离。

<蛋白的洗涤>

向通过离心分离得到的沉淀物（不溶性级分的蛋白）中加入含有3w/v% 的SDS的缓冲液B（50mM Tris-HCl、100mM NaCl、pH为7.0）30mL，用 上述SMT公司制的超声粉碎机（7级）充分使其分散，然后用振荡器 （TAITEC公司制、200rpm、37℃）搅拌60分钟。其后，用上述TOMY 精工制的离心分离机进行离心分离（10000rpm、10分钟、室温），弃去上 清，得到SDS洗涤颗粒（沉淀物）。

<蛋白的精制>

将SDS洗涤颗粒悬浮到下述表6所示的各溶剂中，使其浓度达到 100mg/mL，在80℃下热处理1小时。其后，用上述TOMY精工制的离心 分离机进行离心分离（11000×g、5分钟），回收上清。上清中的蛋白的浓 度利用BCA法进行测定。其中，利用BCA法的蛋白的测定使用了Takara Bio 公司制的Pierce（注册商标）BCA Protein Assay Kit。

（实施例10）

用表达ADF4Kai的蛋白的大肠杆菌替换表达ADF3Kai-Large-NRSH1 的蛋白的大肠杆菌，除此以外，与实施例9同样地对ADF4Kai的蛋白进行 精制。

使用实施例9～10中得到的蛋白进行SDS-PAGE电泳，通过Oriole染 色对条带进行确认，使用分析软件ImageLab（Bio-RAD Laboratories、Inc） 进行图像分析，求出目标蛋白的纯度（精制率），将其结果示于下述表中。 其中，实施例9中得到的蛋白（包含ADF3Kai-Large-NRSH1）的SDS-PAGE 电泳结果示于图13，实施例10中得到的蛋白（包含ADF4Kai）的SDS-PAGE 电泳结果示于图14。另外，将使用7.5M的尿素缓冲液（pH9.0）作为溶剂 时的蛋白纯度为基准的相对值结果示于下述表6。

表6

图13示出了使用了将ADF3Kai-Large-NRSH1的蛋白溶解于各种溶剂 而得到的多肽溶液的电泳（SDS-PAGE）结果，图14示出了使用了将 ADF4Kai的蛋白溶解于各种溶剂而得到的多肽溶液的电泳（SDS-PAGE） 结果。图13及14中，Lane M为分子量标记物、Lane1～4分别为溶剂为7.5M 的尿素缓冲液（pH为9.0）、DMSO（含有1M的LiCl）、DMSO（含有 2M LiCl）、DMSO（含有3M的LiCl）时的样品。从图13及14可知，当 将DMSO中加入无机盐而成的溶剂用作溶剂时，与将7.5M的尿素缓冲液 （pH9.0）作为溶剂的情况相比，夹杂蛋白更少、溶解性也进一步提高。另 外，溶剂中的无机盐浓度上升，并且精制率增加。

产业上的可利用性

本发明的多肽溶液可用于原液和多肽的精制。另外，将本发明的多肽 溶液用作原液而制造的人造多肽纤维适用于树脂或金属的强化纤维、复合 材料、注塑成形等。关于其用途，适用于汽车等的输送机器部件、轮胎的 补强纤维等。此外，还适用于手术用线、面罩、过滤器、创伤覆盖材料、 再生医疗片材、生物片材等。作为形态，可用作纺织物、编织物、线绳、 无纺布等。

符号说明

1、31、61、81              挤出装置

2、30、62、80              未拉伸丝制造装置

3、40                      湿热拉伸装置（第一阶段拉伸装置）

4、50、63、90              干热拉伸装置（第二阶段拉伸装置）

5、39、44、64、86、92      卷丝体

6、32、66、82              纺丝液

7                          贮槽

8                          齿轮泵

9、69、83                  纺丝头

10、60                     纺丝拉伸装置

11、35、71、85             凝固液

36                         未拉伸丝

12、38                     温水

13、15、41、45             供给夹持辊

14、16、42、46             牵引夹持辊

17、43、77、89             干热拉伸装置

18a～18f                   导丝器

19、73                     空隙

20、34、72、84             凝固液槽

21、37                     拉伸浴槽

22、47、78、91             丝道

序列表独立文本

序列号1～6、8、15、17、19        氨基酸序列

序列号7、9、10、16、18、20       碱基序列

序列号11～14                     引物序列