富集唾液中糖基化多肽与磷酸化多肽的方法学建立以及在宫颈癌患者中的应用

摘要

背景:宫颈癌是一种常见的女性生殖系统肿瘤，在发展中国家发病率仅次于乳腺癌，严重的威胁到了女性的身体健康。由于宫颈癌早期症状不典型，所以大多数患者很难意识到问题所在，往往延误治疗，因此宫颈癌早期诊断对于提高患者的生存率有很大的帮助。目前宫颈癌早期筛查的方法主要有阴道脱落细胞涂片法，阴道镜检，但都存在漏诊误诊的可能，而活组织病理检查对患者造成一定的创伤，所以寻找一种无创伤，精度高的诊断方法是很有必要的。随着分子生物学的快速发展，肿瘤标志物越来越受到人们的重视，对恶性肿瘤的筛查和预后的评价有重要临床价值。
　　 疾病蛋白质组学的出现，使得寻找肿瘤特异性和相关性标志物向前迈进了一大步。其主要方法是利用各种有效地手段，分离纯化特定疾病相关蛋白或者多肽，然后利用质谱对其鉴定和分析，再与健康人群作对比，观察其中的差异，以期能为临床诊断，研究疾病的发生和发展以及开发新药等提供理论和技术支持。众所周知，蛋白质作为机体功能的主要承担者不可避免的参与到肿瘤的发生发展之中，而糖基化和磷酸化是两种较为常见的蛋白质翻译后修饰，影响机体生命活动的各个方面。如细胞增殖、细胞分化、细胞信号传递等。异常的糖基化或者磷酸化作用是导致细胞癌变的关键步奏之一。许多细胞外糖蛋白的糖链上含有唾液酸，其已被证明与肿瘤的发生发展有关。所以利用蛋白质组学的方法检测分析糖基化或者磷酸化蛋白质进而研究这两种翻译后修饰在疾病中的发展变化，以及与健康人之间的差异，具有重要的临床指导意义。
　　 目的:本实验利用二氧化钛作为富集材料，分别收集健康女性和宫颈癌患者的唾液中所含有的唾液酸糖肽和磷酸化肽，再利用组内开发的材料“ClickTE-Cys”把收集到的糖肽和磷酸化肽分开，之后分别进入质谱检测，最终再分别比较宫颈癌患者与健康女性唾液中唾液酸糖肽数量的差异和磷酸化肽数量的差异，为肿瘤的诊断提供理论依据。
　　 方法:先以标准品为样品，建立一种胰蛋白酶酶解、金属氧化物和“ClickTE-Cys”材料富集分离、之后联合质谱检测的方法。再取10例肿瘤患者和10例正常健康女性的唾液利用上述方法检测对比。
　　 结果:1、我们建立了一种利用二氧化钛同时富集唾液中磷酸化肽和唾液酸糖肽，再利用组内合成的材料“ClickTE-Cys”把两种多肽分开，最后分别进入质谱检测的方法。
　　 2、利用上述方法，在宫颈癌患者的唾液中发现7个糖肽和7个磷酸化肽，在健康女性的唾液中发现11个糖肽和6个磷酸化肽，两者相比宫颈癌患者的唾液中发现4个糖肽的差异，4个磷酸化肽的差异。
　　 结论:通过对宫颈癌患者的唾液中磷酸化肽和糖肽的检测，以及与健康人的相互比较，成功的发现了其中的差异，为以后提高宫颈癌的检测准确度打下了良好的基础。

目录

声明

摘要

前言

材料和方法

一、材料

1、样品

2、富集材料

3、试剂

4、仪器耗材

二、试验方法

1、混合标准品中目标多肽检测新方法的建立

2、实际样品中目标多肽的检测

3、质谱分析

结果

1．标准品中磷酸化肽和唾液酸糖肽检测新方法的建立

1．1 评价XP材料的方案

1．2 C8材料方案优化

2 检测灵敏度的测定

3．实际唾液中所含有的唾液酸糖肽和患者唾液的比较

讨论

结论

参考文献

综述

致谢