特征在于是将透明质酸及黄素腺嘌呤二核苷酸组合而成的角膜上皮细胞死亡的抑制剂

摘要

透明质酸或其盐、及黄素腺嘌呤二核苷酸或其盐的组合由于显著地抑制通过紫外线照射或干燥诱导的角膜上皮细胞的活细胞数的降低，因此可以用作通过紫外线照射及/或干燥诱导的角膜上皮细胞死亡的抑制剂。

说明书

技术领域

本发明涉及一种抑制剂，是角膜上皮细胞死亡的抑制剂，该角膜 上皮细胞死亡是通过紫外线照射及/或干燥而被诱导的，所述抑制剂的 特征在于，是将透明质酸或其盐（以下，也将它们总称为“透明质酸 等”）及黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD：Flavin Adenine Dinucleotide）或 其盐（以下，也将它们总称为“FAD等”）组合而成的。本发明还涉及 一种方法，是抑制角膜上皮细胞死亡的方法，包括将药学上有效量的 透明质酸等及FAD等组合并给予至患者的步骤，该角膜上皮细胞死 亡是通过紫外线照射及/或干燥而被诱导的。另外，本发明还涉及一种 应用，是透明质酸等及FAD等的组合的用于抑制角膜上皮细胞死亡 的应用，该角膜上皮细胞死亡是通过紫外线照射及/或干燥而被诱导 的。进而，本发明还涉及一种应用，是透明质酸等及FAD等的组合 的用于制造角膜上皮细胞死亡的抑制剂的应用，该角膜上皮细胞死亡 是通过紫外线照射及/或干燥而被诱导的。

背景技术

由于角膜是与外界直接接触的组织，因此暴露于紫外线、干燥等 各种刺激（stress）下。

对于紫外线来说，已知紫外线A波（波长：320nm以上且不足 400nm）、紫外线B波（波长：290nm以上且不足320nm）、及紫外 线C波（波长：200nm以上且不足290nm）3种。日本眼科纪要，57， 734－738（2006）（非专利文献1）中记载了下述内容：紫外线B波 （以下，也称为“UV－B”）及紫外线C波（以下，也称为“UV－C”） 在角膜上皮被吸收，以及，由于UV－C在臭氧层被吸收所以不会成 为问题，另一方面，临床上成为问题的是UV－B。另外，Exp.Eye Res.， 90（2），216－22（2010）（非专利文献2）中公开了角膜上皮细胞 的凋亡（细胞死亡）通过UV－B而被诱导，实际上，上述非专利文 献1中公开了UV－B导致角膜上皮损伤、角膜水肿·混浊等。

另外，British Journal of Ophthalmology（英国眼科杂志），85（5）， 610－612（2001）（非专利文献3）中公开了作为由干燥诱导的角膜 上皮细胞死亡的结果，发生细胞剥离，角膜溃疡等。

上述非专利文献1中公开了透明质酸等抑制UV－B照射导致的 角膜上皮细胞的活性氧产生增加及Caspase－3/7活化，但是实际上未 记载透明质酸等是否抑制由紫外线照射诱导的角膜上皮细胞死亡。另 外，上述非专利文献3中记载了，透明质酸等不抑制由干燥诱导的角 膜上皮细胞的细胞死亡。

进而，关于FAD，实际上也未明确是否抑制由紫外线照射诱导的 角膜上皮细胞的细胞死亡。另外，日本特开平11－263729号公报（专 利文献1）中记载了FAD等具有泪液分泌促进作用，但是未明确是否 直接抑制由干燥诱导的角膜上皮细胞的细胞死亡。

如上所述，不明确透明质酸等或FAD等是否抑制通过紫外线照 射及/或干燥诱导的角膜上皮细胞死亡，当然也不清楚组合透明质酸等 及FAD等的情况下是否实现上述效果。

需要说明的是，国际公开第2005/027893号（专利文献2）、日 本特开2005－330276号公报（专利文献3）、日本特开2005－298448 号公报（专利文献4）中公开了以含有透明质酸等和FAD等的方式配 合的滴眼剂，但是未记载或暗示该滴眼剂是否抑制通过紫外线照射及 /或干燥被诱导的角膜上皮细胞死亡。

专利文献1：日本特开平11－263729号公报

专利文献2：国际公开第2005/027893号

专利文献3：日本特开2005－330276号公报

专利文献4：日本特开2005－298448号公报

非专利文献1：日本眼科纪要，57，734－738（2006）

非专利文献2：Exp.Eye Res.，90（2），216－22（2010）

非专利文献3：British Journal of Ophthalmology，85（5），610 －612（2001）

发明内容

如上所述，探索抑制通过紫外线照射及/或干燥诱导的角膜上皮 细胞死亡的药剂是很有意义的课题。

本发明人等为了探索抑制通过紫外线照射及/或干燥诱导的角膜 上皮细胞死亡的药剂进行了潜心研究，结果发现透明质酸或其盐和黄 素腺嘌呤二核苷酸或其盐的组合（以下，也称为“本发明组合”）具有 显著的细胞死亡抑制效果，从而完成了本发明。

即，本发明是一种抑制剂（以下，也称为“本发明药剂”），是角 膜上皮细胞死亡的抑制剂，该角膜上皮细胞死亡是通过紫外线照射及 /或干燥而被诱导的，所述抑制剂的特征在于，是将透明质酸或其盐（透 明质酸等）及黄素腺嘌呤二核苷酸或其盐（FAD等）组合而成的。

另外，本发明的其他方案是一种抑制剂，是角膜上皮细胞死亡的 抑制剂，该角膜上皮细胞死亡是通过紫外线B波照射而被诱导的，所 述抑制剂的特征在于，是将透明质酸等及FAD等组合而成的。

另外，本发明的其他方案是本发明药剂，其中，透明质酸等的浓 度为0.02～1%（w/v），FAD等的浓度为0.01～1%（w/v）。

另外，本发明的其他方案是本发明药剂，其中，透明质酸等的浓 度为0.02～0.5%（w/v），FAD等的浓度为0.02～0.5%（w/v）。

另外，本发明的其他方案是本发明药剂，其中，透明质酸等的浓 度为0.05～0.3%（w/v），FAD等的浓度为0.05%（w/v）。

另外，本发明的其他方案是本发明药剂，其中，给予方式为滴眼 给予。

另外，本发明的其他方案是本发明药剂，其中，剂型为滴眼剂。

本发明还提供一种方法（以下，也称为“本发明方法”），是抑制 角膜上皮细胞死亡的方法，包括将药学上有效量的透明质酸等及FAD 等组合并给予至患者的步骤，该角膜上皮细胞死亡是通过紫外线照射 及/或干燥而被诱导的。

另外，本发明的其他方案是一种方法，是抑制角膜上皮细胞死亡 的方法，包括将药学上有效量的透明质酸等及FAD等组合并给予至 患者的步骤，该角膜上皮细胞死亡是通过紫外线B波照射而被诱导 的。

另外，本发明的其他方案是本发明方法，其中，透明质酸等的浓 度为0.02～1%（w/v），FAD等的浓度为0.01～1%（w/v）。

另外，本发明的其他方案是本发明方法，其中，透明质酸等的浓 度为0.02～0.5%（w/v），FAD等的浓度为0.02～0.5%（w/v）。

另外，本发明的其他方案是本发明方法，其中，透明质酸等的浓 度为0.05～0.3%（w/v），FAD等的浓度为0.05%（w/v）。

另外，本发明的其他方案是本发明方法，其中，给予方式为滴眼 给予。

另外，本发明的其他方案是本发明方法，其中，剂型为滴眼剂。

本发明还提供一种应用（以下，也称为“本发明第1应用”），是 透明质酸等及FAD等的组合的用于抑制角膜上皮细胞死亡的应用， 该角膜上皮细胞死亡是通过紫外线照射及/或干燥而被诱导的。

另外，本发明的其他方案还提供一种应用，是透明质酸等及FAD 等的组合的用于抑制角膜上皮细胞死亡的应用，该角膜上皮细胞死亡 是通过紫外线B波照射而被诱导的。

另外，本发明的其他方案是本发明第1应用，其中，透明质酸等 的浓度为0.02～1%（w/v），FAD等的浓度为0.01～1%（w/v）。

另外，本发明的其他方案是本发明第1应用，其中，透明质酸等 的浓度为0.02～0.5%（w/v），FAD等的浓度为0.02～0.5%（w/v）。

另外，本发明的其他方案是本发明第1应用，其中，透明质酸等 的浓度为0.05～0.3%（w/v），FAD等的浓度为0.05%（w/v）。

另外，本发明的其他方案是本发明第1应用，其中，给予方式为 滴眼给予。

另外，本发明的其他方案是本发明第1应用，其中，剂型为滴眼 剂。

还提供一种应用（以下，也称为“本发明第2应用”），是透明质 酸等及FAD等的组合的用于制造角膜上皮细胞死亡的抑制剂的应用， 该角膜上皮细胞死亡是通过紫外线照射及/或干燥而被诱导的。

还提供一种应用，是透明质酸等及FAD等的组合的用于制造角 膜上皮细胞死亡的抑制剂的应用，该角膜上皮细胞死亡是通过紫外线 B波照射而被诱导的。

另外，本发明的其他方案是本发明第2应用，其中，透明质酸等 的浓度为0.02～1%（w/v），FAD等的浓度为0.01～1%（w/v）。

另外，本发明的其他方案是本发明第2应用，其中，透明质酸等 的浓度为0.02～0.5%（w/v），FAD等的浓度为0.02～0.5%（w/v）。

另外，本发明的其他方案是本发明第2应用，其中，透明质酸等 的浓度为0.05～0.3%（w/v），FAD等的浓度为0.05%（w/v）。

另外，本发明的其他方案是本发明第2应用，其中，给予方式为 滴眼给予。

另外，本发明的其他方案是本发明第2应用，其中，剂型为滴眼 剂。

如下所述，由于本发明组合显著抑制通过紫外线照射或干燥诱 导的角膜上皮细胞的活细胞数的降低，因此可以用作通过紫外线照射 及/或干燥诱导的角膜上皮细胞死亡的抑制剂。另外，本发明还提供一 种方法，是抑制角膜上皮细胞死亡的方法，包括将药学上有效量的透 明质酸等及FAD等组合并给予至患者的步骤，该角膜上皮细胞死亡 是通过紫外线照射及/或干燥而被诱导的。另外，本发明还提供一种应 用，是透明质酸等及FAD等的组合的用于抑制角膜上皮细胞死亡的 应用，该角膜上皮细胞死亡是通过紫外线照射及/或干燥而被诱导的。 进而，本发明还提供一种应用，是透明质酸等及FAD等的组合的用 于制造角膜上皮细胞死亡的抑制剂的应用，该角膜上皮细胞死亡是通 过紫外线照射及/或干燥而被诱导的。

附图说明

[图1]为表示在UV－B照射（80mJ/cm²、约1分钟）前用本发明 组合处置了角膜上皮细胞的情况下的生存率的图。

[图2]为表示在UV－B照射（80mJ/cm²、约1分钟）后用本发明 组合处置了角膜上皮细胞的情况下的生存率的图。

[图3]为表示在干燥负荷前用本发明组合处置了角膜上皮细胞的 情况下的生存率的图。

具体实施方式

透明质酸为下述通式（1）表示的化合物。

[化1]

[式中，m表示自然数]

作为本发明中的“透明质酸”，优选平均分子量为50万～390万的 透明质酸，更优选平均分子量为50万～120万的透明质酸。

黄素腺嘌呤二核苷酸为下述式（2）表示的化合物。

[化2]

作为透明质酸或黄素腺嘌呤二核苷酸的盐，只要是作为医药被允 许的盐则没有特别限定，可以举出与盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、 硫酸、磷酸等无机酸形成的盐、与乙酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、 柠檬酸、酒石酸、己二酸、葡糖酸、葡庚糖酸、葡糖醛酸、对苯二甲 酸、甲磺酸、乳酸、马尿酸、1，2－乙二磺酸、羟乙基磺酸、乳糖酸、 油酸、双羟萘酸、多聚半乳糖醛酸、硬脂酸、鞣酸、三氟甲磺酸、苯 磺酸、对甲苯磺酸、硫酸月桂酯、硫酸甲酯（methyl sulfate）、萘磺 酸、磺基水杨酸等有机酸形成的盐；与溴代甲烷、碘代甲烷等的季铵 盐；与溴离子、氯离子、碘离子等卤素离子形成的盐；与锂、钠、钾 等碱金属形成的盐；与钙、镁等碱土金属形成的盐；与铁、锌等的金 属盐；与氨形成的盐；与三亚乙基二胺、2－氨基乙醇、2，2－亚氨 基双（乙醇）、1－脱氧－1－（甲基氨基）－2－D－山梨糖醇、2－ 氨基－2－（羟基甲基）－1，3－丙二醇、普鲁卡因、N，N－双（苯 基甲基）－1，2－乙二胺等有机胺形成的盐等。

作为本发明中的“透明质酸的盐”，优选的为钠盐，特别优选下述 通式（3）表示的钠盐（以下，也称为“透明质酸钠”）。

[式中，n表示自然数]

作为本发明中的“黄素腺嘌呤二核苷酸的盐”，优选为钠盐，特别 优选下述式（4）表示的二钠盐（以下，也称为“黄素腺嘌呤二核苷酸 二钠盐”）。

[化4]

另外，透明质酸或其盐（透明质酸等）、黄素腺嘌呤二核苷酸或 其盐（FAD等）可以采用水合物或溶剂合物的形态。

透明质酸或黄素腺嘌呤二核苷酸中存在几何异构体或光学异构 体的情况下，该异构体或它们的盐也包含在本发明的范围内。另外， 透明质酸或黄素腺嘌呤二核苷酸中存在质子互变异构体的情况下，该 互变异构体或它们的盐也包含在本发明的范围内。

透明质酸、黄素腺嘌呤二核苷酸或它们的盐（包括采用水合物或 溶剂合物的形态的情况）中，存在多晶型及多晶型组（多晶型系统） 的情况下，这些多晶型体及多晶型组（多晶型系统）也包含在本发明 的范围内。此处，所谓多晶型组（多晶型系统），表示根据这些结晶 的制造、结晶、保存等的条件及状态（需要说明的是，本状态中也包 括经制剂化的状态），晶形变化时的各阶段中的各晶形及其整个过程。

透明质酸或其盐、及黄素腺嘌呤二核苷酸或其盐可以通过有机合 成化学领域中的通常方法进行制造，也可以使用Sigma公司等在市场 上销售的产品。

本发明中所谓“抑制通过紫外线照射及/或干燥诱导的角膜上皮细 胞死亡”，不仅表示抑制通过紫外线照射及/或干燥诱导的角膜上皮细 胞的活细胞数的降低，还表示预防或治疗伴随该活细胞数的降低（即， 角膜上皮细胞死亡）的角膜上皮损伤、角膜水肿·混浊等。

本发明中，所谓“紫外线”，表示紫外线A波（波长：320nm以上 且不足400nm）、紫外线B波（波长：290nm以上且不足320nm）、 及紫外线C波（波长：200nm以上且不足290nm）3种。如背景技术 项中说明的那样，已知作为诱导角膜上皮细胞死亡的紫外线在临床上 成为问题的是“紫外线B波（UV－B）”。

对于本发明药剂来说，可以在透明质酸或其盐、及黄素腺嘌呤二 核苷酸或其盐的组合中，混合其他有效成分及医药中允许的添加剂， 采用通用的技术，作为含有3种以上的有效成分的眼科用剂而制剂化； 另外，也可以在透明质酸或其盐、及黄素腺嘌呤二核苷酸或其盐的组 合中，加入医药中允许的添加剂，采用通用的技术，作为仅含有透明 质酸或其盐、及黄素腺嘌呤二核苷酸或其盐作为有效成分的眼科用剂 而制剂化。

本发明中，本发明药剂被给予至眼局部。作为本发明药剂的给予 方式，例如，可以举出滴眼给予（将眼软膏的点入也包括在内）、结 膜下给予、结膜囊内给予、眼球囊下给予等，特别优选滴眼给予。

本发明药剂的剂型只要能够用于眼局部给予则没有特别限定，例 如，可以举出滴眼剂、眼软膏、注射剂、贴剂、凝胶、插入剂等，其 中优选滴眼剂。需要说明的是，它们可以采用在该领域中通用的常规 技术进行制备。进而，关于本治疗剂，除了上述制剂之外，也可以采 用眼内植入剂、微球体等经DDS（药物传递系统）化的制剂。

关于滴眼剂，可以根据需要从氯化钠、氯化钾、浓甘油等等渗剂 （日语：等張剤）；磷酸钠、乙酸钠、ε-氨基己酸等缓冲剂；聚氧乙 烯山梨糖醇酐单油酸酯、聚氧乙烯－40－硬脂酸酯、聚氧乙烯氢化蓖 麻油等表面活性剂；柠檬酸钠、依地酸钠等稳定剂；苯扎氯铵、对羟 基苯甲酸酯等防腐剂等中选择使用进行制备，关于pH，只要在眼科 制剂允许的范围内即可，通常优选在4～8的范围内。

眼软膏可以使用白凡士林、液体石蜡等通用的基质进行制备。

注射剂可以根据需要从下述物质中选择使用进行制备，所述物质 为：氯化钠等等渗剂；磷酸钠等缓冲剂；聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸 酯等表面活性剂；甲基纤维素等增稠剂等。

关于插入剂，可以将生物可降解性聚合物、例如羟丙基纤维素、 羟丙基甲基纤维素、羧基乙烯聚合物、聚丙烯酸等生物可降解性聚合 物与本发明化合物一并粉碎混合，将该粉末压缩成型，由此进行制备， 根据需要可以使用赋形剂、粘合剂、稳定剂、pH调节剂等。

关于眼内植入剂，可以使用生物可降解性聚合物，例如，聚乳酸、 聚乙醇酸、乳酸·乙醇酸共聚物、羟丙基纤维素等生物可降解性聚合物， 进行制备。

关于本发明药剂的用量，可以根据剂型、需要给予的患者的症状 的轻重、年龄、体重、医生的判断等适当改变，例如，选择滴眼剂的 情况下，将含有0.02～5%（w/v）透明质酸或其盐及0.005～5%（w/v） 黄素腺嘌呤二核苷酸或其盐的本发明药剂按照一次1～2滴向眼中滴 入，优选将含有0.02～1%（w/v）透明质酸或其盐及0.01～1%（w/v） 黄素腺嘌呤二核苷酸或其盐的本发明药剂按照一次1～2滴向眼中滴 入，更优选将含有0.02～0.5%（w/v）透明质酸或其盐及0.02～0.5% （w/v）黄素腺嘌呤二核苷酸或其盐的本发明药剂按照一次1～2滴向 眼中滴入，进一步优选将含有0.05～0.3%（w/v）透明质酸或其盐及 0.05%（w/v）黄素腺嘌呤二核苷酸或其盐的本发明药剂按照一次1～ 2滴向眼中滴入。

需要说明的是，上述透明质酸或其盐、及黄素腺嘌呤二核苷酸或 其盐的浓度可以为透明质酸（游离体）及黄素腺嘌呤二核苷酸（游离 体）的浓度，也可以为它们的盐的浓度。

本发明药剂的用法可以根据剂型、需要给予的患者的症状的轻 重、年龄、体重、医生的判断等适当改变，例如，作为剂型选择滴眼 剂的情况下，可以按照1日1～10次、优选1日2～8次、较优选1 日3～6次、进一步优选1日5～6次分次给予至眼局部。

本发明中，所谓“特征在于是将（a）透明质酸或其盐、及（ｂ） 黄素腺嘌呤二核苷酸或其盐组合而成的”，不仅表示一次性地给予含 有透明质酸或其盐、及黄素腺嘌呤二核苷酸或其盐的配合眼科用剂， 还表示将含有透明质酸或其盐的眼科用剂和含有黄素腺嘌呤二核苷 酸或其盐的眼科用剂分别且连续地给予。

需要说明的是，在日本，仅含有0.1%（w/v）或0.3%（w/v）的 浓度的透明质酸钠作为有效成分的“Hyalein（注册商标）滴眼液0.1%”、 “Hyalein（注册商标）滴眼液0.3%”等、仅含有0.05%（w/v）的浓度 的黄素腺嘌呤二核苷酸二钠盐作为有效成分的“Flavitan（注册商标） 滴眼液0.05%”等正在市场上销售。

需要说明的是，本发明药剂可以在角膜暴露于紫外线前及/或在 角膜干燥前预防性地给予至眼局部，也可以在角膜暴露于紫外线后及 /或在角膜干燥后治疗性地给予。

进而本发明还提供下述方案：一种方法（本发明方法），是抑制 角膜上皮细胞死亡的方法，包括将药学上有效量的透明质酸等及FAD 等组合并给予至患者的步骤，该角膜上皮细胞死亡是通过紫外线照射 及/或干燥而被诱导的；一种应用（本发明第1应用），是透明质酸等 及FAD等的组合的用于抑制角膜上皮细胞死亡的应用，该角膜上皮 细胞死亡是通过紫外线照射及/或干燥而被诱导的；以及，一种应用（本 发明第2应用），是透明质酸等及FAD等的组合的用于制造角膜上 皮细胞死亡的抑制剂的应用，该角膜上皮细胞死亡是通过紫外线照射 及/或干燥而被诱导的。所述发明中的各术语的定义也如上所述，关于 优选方案也与上述相同。

以下示出药理试验及制剂例的结果，但是所述例子用于更好地理 解本发明，并不限定本发明的范围。

实施例

[药理试验1]

在紫外线（UV－B）照射前，用本发明药剂处置角膜上皮细胞， 在该情况下，对是否抑制紫外线照射导致的活细胞数的降低进行评 价。

（试验方法）

将SV40永生化人角膜上皮细胞（HCE－T：理化学研究所、 BioResource Center、CellNo.：RCB2280、在实施例中以下相同）接种 于96孔板（1×10⁴个/孔），用含有10%FBS的DMEM/F－12培养基 培养1天。第二天，将上述含有10%FBS的DMEM/F－12培养基替 换为含有0.1%（w/v）透明质酸钠的PBS、含有0.05%（w/v）黄素腺 嘌呤二核苷酸二钠盐的PBS、含有0.1%（w/v）透明质酸钠及0.05% （w/v）黄素腺嘌呤二核苷酸二钠盐的PBS、或不含受试物质的PBS （以下，也分别称为“0.1%HA组”、“0.05%FAD组”、 “0.1%HA/0.05%FAD组”或“基质组”）。之后，对角膜上皮细胞进行 UV－B照射（80mJ/cm²）约1分钟。将各组的培养基替换为DMEM/F －12培养基之后，于37℃培养24小时，之后，使用CellTiter96（注 册商标）AQueous单溶液细胞增殖检测试剂盒（Aqueous One Solution  Cell Proliferation Assay）（Promega公司制、商品目录号：G3580、在 实施例中以下相同）测定活细胞数，按照下述式1算出生存率。需要 说明的是，本试验中使用的透明质酸钠及黄素腺嘌呤二核苷酸二钠盐 分别购自Kewpie株式会社及KYOWA HAKKO BIO CO.,LTD.。

[式1]

生存率（%）＝（各组的活细胞数/UV－B非照射组的活细胞数）×100

（结果）

试验结果示于图1。需要说明的是，图1中，值表示平均值±标准 误差（N＝3）。

（讨论）

由图1可以明确，在UV－B照射前用本发明药剂对角膜上皮细 胞预先进行了前处置的情况下，生存率约为100%。即，在角膜暴露 于紫外线之前，组合透明质酸或其盐、及黄素腺嘌呤二核苷酸或其盐 并预防性地给予至眼局部的情况下，显示出高效地抑制通过紫外线照 射诱导的角膜上皮细胞死亡。

[药理试验2]

改变UV－B的照射条件，进行与药理试验1相同的试验。

（试验方法）

与药理试验1同样地操作后，将含有10%FBS的DMEM/F－12 培养基替换为含有0.05%（w/v）黄素腺嘌呤二核苷酸二钠盐的PBS、 含有0.05%（w/v）透明质酸钠的PBS、含有0.05%（w/v）透明质酸 钠及0.05%（w/v）黄素腺嘌呤二核苷酸二钠盐的PBS、含有0.3%（w/v） 透明质酸钠的PBS、含有0.3%（w/v）透明质酸钠及0.05%（w/v）黄 素腺嘌呤二核苷酸二钠盐的PBS、或不含受试物质的PBS（以下，也 分别称为“0.05%FAD组”、“0.05%HA组”、“0.05%HA/0.05%FAD组”、 “0.3%HA组”、“0.3%HA/0.05%FAD组”或“基质组”）。接下来，对角 膜上皮细胞进行UV－B照射（120mJ/cm²）约2分钟，再次进行与药 理试验1相同的操作。之后，按照上述式1，算出生存率，进而，按 照下述式2，算出各组的细胞死亡抑制率。

[式2]

细胞死亡抑制率（%）＝各组的生存率－基质组的生存率

（结果）

试验结果示于表1。需要说明的是，表1中，值表示各组的细胞 死亡抑制率的平均值（N＝3）。

[表1]

0.05％FAD 0.05％HA 0.05％HA/0.05%FAD 0.3％HA 0.3％HA/0.05％FAD 48.78% -0.17％ 53.3％ 4.17％ 62.28％

（讨论）

由表1可以明确，对于透明质酸钠来说，虽然单独使用时基本无 法抑制UV－B照射（120mJ/cm²、约2分钟）导致的角膜上皮细胞死 亡，但是与黄素腺嘌呤二核苷酸钠并用的情况下，显示出使黄素腺嘌 呤二核苷酸二钠盐的细胞死亡抑制效果显著增强。即，在角膜暴露于 紫外线之前，组合透明质酸或其盐、及黄素腺嘌呤二核苷酸或其盐并 预防性地给予至眼局部的情况下，两者协同作用，显示出高效地抑制 通过紫外线照射诱导的角膜上皮细胞死亡。

[药理试验3]

在紫外线（UV－B）照射后，用本发明药剂处置角膜上皮细胞， 在该情况下，对是否抑制紫外线照射导致的活细胞数的降低进行评 价。

（试验方法）

将SV40永生化人角膜上皮细胞接种于96孔板（1×10⁴个/孔）， 用含有10%FBS的DMEM/F－12培养基培养1天。第二天，对角膜 上皮细胞进行UV－B照射（80mJ/cm²）约1分钟。之后，将上述含 有10%FBS的DMEM/F－12培养基替换为含有0.1%（w/v）透明质 酸钠的PBS、含有0.05%（w/v）黄素腺嘌呤二核苷酸二钠盐的PBS、 含有0.1%（w/v）透明质酸钠及0.05%（w/v）黄素腺嘌呤二核苷酸二 钠盐的PBS、或不含受试物质的PBS，之后，于37℃培养60分钟（以 下，也分别称为“0.1%HA组”、“0.05%FAD组”、“0.1%HA/0.05%FAD 组”或“基质组”）。之后，将各组的培养基替换为含有10%FBS的 DMEM/F－12培养基，之后于37℃培养24小时，之后，使用CellTiter96 （注册商标）AQueous单溶液细胞增殖检测试剂盒（Aqueous One  Solution Cell Proliferation Assay）测定活细胞数，按照下述式3，算出 生存率。需要说明的是，本试验中使用的透明质酸钠及黄素腺嘌呤二 核苷酸二钠盐的购入地与药理试验1相同。

[式3]

生存率（%）＝（各组的活细胞数/UV－B非照射组的活细胞数）×100

（结果）

试验结果示于图2。图2中，值表示平均值±标准误差（N＝3）。

（讨论）

由图2可以明确，在UV－B照射后用透明质酸钠或黄素腺嘌呤 二核苷酸二钠盐处置了角膜上皮细胞的情况下，基本未确认到角膜上 皮细胞死亡的抑制。另一方面，用透明质酸钠及黄素腺嘌呤二核苷酸 二钠盐处置了角膜上皮细胞的情况下，令人惊讶地确认到明显的角膜 上皮细胞死亡的抑制作用。即，可以明确，即使在角膜暴露在紫外线 中以后，若组合透明质酸或其盐、及黄素腺嘌呤二核苷酸或其盐并给 予至眼局部，则可以抑制由紫外线诱导的角膜上皮细胞死亡。

[药理试验4]

在干燥负荷前用本发明药剂处置了角膜上皮细胞的情况下，对是 否抑制干燥导致的活细胞数的降低进行评价。

（试验方法）

将SV40永生化人角膜上皮细胞接种于96孔板（1×10⁴细胞/孔）， 用含有10%FBS的DMEM/F－12培养基培养1天。第二天，将培养 基替换为含有0.1%（w/v）透明质酸钠的D－MEM/F12培养基、含有 0.05%（w/v）黄素腺嘌呤二核苷酸二钠盐的D－MEM/F12培养基、 含有0.1%（w/v）透明质酸钠及0.05%（w/v）黄素腺嘌呤二核苷酸二 钠盐的D－MEM/F12培养基、或不含受试物质的D－MEM/F12培养 基，之后于37℃培养60分钟（以下，也分别称为“0.1%HA组”、 “0.05%FAD组”、“0.1%HA/0.05%FAD组”或“基质组”）。培养后，除 去各组的培养基，之后进行干燥负荷15分钟。负荷后，使用CellTiter96 （注册商标）AQueous单溶液细胞增殖检测试剂盒（Aqueous One  Solution Cell Proliferation Assay），测定活细胞数，按照下述式4算 出生存率。需要说明的是，本试验中使用的透明质酸钠及黄素腺嘌呤 二核苷酸二钠盐的购入地与药理试验1相同。

[式4]

生存率（%）＝（各组的活细胞数/未实施干燥负荷组的活细胞数）×100

（结果）

试验结果示于图3。图3中，值表示平均值±标准误差（N＝6）。

（讨论）

由图3可以明确，在0.1%HA组中确认到角膜上皮细胞死亡的抑 制作用，但是在0.05%FAD组中未确认到相同作用。另一方面，在 0.1%HA/0.05%FAD组中，确认到超过0.1%HA组的显著的角膜上皮 细胞死亡抑制作用。如上所述，若考虑到单独给予黄素腺嘌呤二核苷 酸二钠盐时，完全未确认到角膜上皮细胞死亡的抑制作用，则上述结 果应是令人吃惊的结果。由以上结果可以明确，若组合透明质酸或其 盐、及黄素腺嘌呤二核苷酸或其盐并给予至眼局部，则可以显著地抑 制干燥导致的角膜上皮细胞死亡。

[制剂例]

给出制剂例更具体地说明本发明的药剂，但本发明不限于这些制 剂例。

（处方例1）

滴眼剂（透明质酸钠浓度：0.1%（w/v）、黄素腺嘌呤二核苷酸 二钠盐浓度：0.05%（w/v））             100ml中

在灭菌纯化水中加入透明质酸钠、黄素腺嘌呤二核苷酸二钠盐及 除它们以外的上述成分，将它们充分混合来制备滴眼剂。改变透明质 酸钠及黄素腺嘌呤二核苷酸二钠盐的添加量，由此能够制备透明质酸 钠的浓度为0.05%（w/v）、0.3%（w/v）或0.5%（w/v）、黄素腺嘌 呤二核苷酸二钠盐的浓度为0.01%（w/v）或0.1%（w/v）的滴眼剂。

（处方例2）

眼软膏（透明质酸钠浓度：0.1%（w/w）、黄素腺嘌呤二核苷酸 二钠盐浓度：0.05%（w/w））           100g中

在均匀地熔融了的白凡士林及液体石蜡中，加入透明质酸钠及黄 素腺嘌呤二核苷酸二钠盐，将它们充分混合后慢慢冷却，由此制备眼 软膏。改变透明质酸钠及黄素腺嘌呤二核苷酸二钠盐的添加量，由此 能够制备透明质酸钠的浓度为0.05%（w/w）、0.3%（w/w）或0.5% （w/w）、黄素腺嘌呤二核苷酸二钠盐的浓度为0.01%（w/w）或0.1% （w/w）的眼软膏。

产业上的可利用性

透明质酸或其盐、及黄素腺嘌呤二核苷酸或其盐的组合由于显著 抑制通过紫外线照射或干燥诱导的角膜上皮细胞的活细胞数的降低， 因此可以用作通过紫外线照射及/或干燥诱导的角膜上皮细胞死亡的 抑制剂。