荧光树枝状纳米大分子在制备药物载体中的应用

摘要

本发明提供了荧光树枝状纳米大分子在制备药物载体中的应用，还提供了荧光树枝状纳米大分子在制备复合药物中的应用，还提供了一种复合药物，由上述药物载体和疏水性药物混合而成，还提供了上述复合药物在害虫防治方面的应用。通过食物饲喂或注射上述复合药物于昆虫，该类树枝状化合物能够作为药物载体包裹装载药物快速进入昆虫体内细胞中，有助于药物在昆虫体内发挥作用，增强药效，有效地灭杀非靶标害虫。因此，本发明成功实现了作为杀虫剂载体应用于害虫防治领域的新策略。这项新的应用增强了杀虫剂的药效，扩大了杀虫范围，为避免化学杀虫剂的过度使用提供了新途径。此类纳米大分子在农业害虫防治领域和生物科研领域具有很好的应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及药物载体领域，具体地说，涉及一种水溶性荧光树枝 状纳米大分子作为药物载体在害虫防治领域中的应用。

背景技术

近几十年来，杀虫剂的过度使用导致害虫产生了抗药性，农药的 残留引发了一系列的环境问题，对人类和动物的健康安全构成了很大 的威胁。因此，在害虫防治领域探索一种新方法，借助药物载体将杀 虫剂传送到害虫体内，增强杀虫剂的细胞毒性、提高杀虫效率、扩大 杀虫范围引起了研究者们的关注。近些年，一些纳米载体，譬如聚合 纳米颗粒、脂质体、树枝状大分子等已经开始应用于药物传送的研究 领域。树枝状大分子由于精确可控的纳米结构、低分散性、内部具有 空腔结构、大量表面可修饰的官能团等优异的结构及生物相容性、免 疫相容性、生物降解性等出色的特性，使其在药物载体的研究方面具 有广阔的应用前景。

苝及其衍生物具有很好的光、热、化学稳定性、高的荧光量子产 率、窄的荧光发射峰、能够与细胞背景荧光分开以及优异的染色性能， 已广泛应用于有机光电器件、激光染料以及生物荧光探针领域。近年 来，此类化合物已经应用于生物领域，如蛋白质靶向标记、细胞特异 性标记和基因载体等，然而水溶性差直接影响了它在这一领域的应 用，因此提高此类化合物的水溶性及在水溶液中保持高荧光量子产率 具有重要意义。

目前，多数杀虫剂都是疏水性的，在生理环境中水溶性很差，这 就阻碍了它们进入细胞，从而导致了低杀虫效率。通常用一些有机溶 剂(如二甲亚砜，DMSO)来溶解杀虫剂以提高其水溶性，但是这些 有机溶剂往往都具有高细胞毒性。此外，以往研究的树枝状药物载体 虽然都具有良好的水溶性和生物相容性，但却不具有荧光特性，这就 在一定程度上限制了其应用范围。因而，发明一种可荧光追踪，能够 包裹封装疏水性药物的树枝状纳米大分子药物载体，研究这类荧光树 枝状药物载体在害虫防治及生物医药领域的应用，将具有非常重要的 意义。

发明内容

针对现有技术不足，本发明的目的在于提供一种以苝酰亚胺衍生 物及其类似物为荧光核的荧光树枝状纳米大分子作为药物载体应用 于害虫防治领域。

为实现上述目的，本发明提供一种荧光树枝状纳米大分子在制备 药物载体中的应用，所述荧光树枝状纳米大分子为式Ⅰ所示的化合 物：

式Ⅰ中，n为0-6之间的任一自然数。

优选的，所述荧光树枝状纳米大分子还可以选择多环芳香族烃的 萘、芘、苝、三萘嵌二苯及其衍生物作为荧光发射团。

本发明提供一种药物载体，它的活性成分为树枝状纳米大分子， 所述树枝状纳米大分子为式Ⅰ所示的化合物：

式Ⅰ中，n为0-6之间的任一自然数。

优选的，所述荧光树枝状纳米大分子还可以选择多环芳香族烃的 萘、芘、苝、三萘嵌二苯及其衍生物作为荧光发射团。

本发明还提供了一种荧光树枝状纳米大分子在制备复合药物中 的应用，所述荧光树枝状纳米大分子为式Ⅰ所示的化合物：

式Ⅰ中，n为0-6之间的任一自然数；

所述药物为疏水性药物。

优选的，所述荧光树枝状纳米大分子还可以选择多环芳香族烃的 萘、芘、苝、三萘嵌二苯及其衍生物作为荧光发射团。

优选的，所述疏水性药物为噻虫嗪。

优选的，所述荧光树枝状纳米大分子与所述药物的摩尔比为1： 1-80。

本发明还提供了一种上述复合药物在害虫防治方面的应用，将所 述荧光树枝状纳米大分子与所述药物混合，再与害虫的细胞共孵育， 通过细胞的内吞作用，使携带药物的荧光树枝状纳米大分子进入活体 培养细胞内；

或者，将所述荧光树枝状纳米大分子与所述药物混合，通过饲喂 或注射方法，使携带药物的荧光树枝状纳米大分子进入害虫体内。

随着药物浓度的加大，细胞毒性增强；树枝状化合物代数越高， 对细胞的毒性越强。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、该类荧光功能性树枝状纳米大分子具有良好的光、热、化学 稳定性、结构可设计性、优异的生物相容性、细胞标记性等特性。

2、本发明制备得到的荧光功能性树枝状纳米大分子具有很好的 生物相容性和很低的细胞毒性。分子外围携有带正电荷的氨基，能够 进入活细胞，并且能够包裹装载疏水性药物，形成一个稳定的复合物， 可以作为药物载体将药物传送进入活体昆虫培养细胞，显著提高药物 的细胞毒性，能够有效地灭杀害虫。这项新的应用增强了杀虫剂的药 效，扩大了杀虫范围，为避免化学杀虫剂的过度使用提供了新途径。 因此，该类载体作为一种新型的荧光纳米大分子药物载体在生物科研 领域和农业害虫防治领域具有很好的应用价值。

3、本发明制备得到的荧光功能性树枝状纳米大分子具有很好的 水溶性，能够在水溶液环境中包裹装载疏水性药物，形成稳定的复合 物，减少了有机溶剂的使用及其应用带来的细胞毒性。

附图说明

图1荧光功能性树枝状纳米大分子G1的化学结构式；

图2荧光功能性树枝状纳米大分子G2的化学结构式；

图3荧光功能性树枝状纳米大分子G3的化学结构式；

图4PDI及可替代PDI的荧光核类似物的结构；

图5噻虫嗪的化学结构式；

图6G2与噻虫嗪相互作用的示意图；

图7G2与噻虫嗪相互作用的紫外吸收光谱图；

图8G2与噻虫嗪相互作用的和荧光光谱谱图；

图9滴加400μM噻虫嗪后，G1-G3(5.0μM)的相对荧光强度；

图10等温滴定微量热测试，图A中药物载体G1、图B中药物载体 G2、图C中药物载体G3；

图11G1-G3与噻虫嗪相互作用的热力学参数；

图12G1-G3与药物结合后对细胞毒性的检测；

图13G2昆虫活体组织染色，其中图A-C为幼虫的脑，图D-F为脂 肪体，图G-I为脑；

图14G2进入昆虫幼虫肠细胞显微成像图，其中，图A、A’为饲 喂含有G2的食物后昆虫幼虫的肠在荧光下的成像图，图A’为荧光下 G2成像图；B饲喂正常食物的昆虫幼虫的肠；

图15饲喂G2/药的昆虫幼虫在不同时间段的死亡率；

图16饲喂G2/药的昆虫幼虫在120h后的死亡率；

图17饲喂G2/药复合体及对照实验中幼虫的生长状况对比图；

图18荧光功能性树枝状纳米大分子作为药物载体的示意图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1荧光功能性树枝状纳米大分子(G1-G3)药物载体的制备

荧光功能性树枝状纳米大分子(G1-G3)药物载体是依据本课题 组报道的文献所合成。具体实验步骤参照文献：

1、Xu Z,He B,Shen J,et al.Fluorescent water-soluble  perylenediimide-cored cationic dendrimers:synthesis,optical properties, and cell uptake[J].Chem.Commun.,2013,49(35):3646-3648；

2、水溶性荧光树枝状大分子的合成方法及其应用，专利公开号： 103204999A。

采用上述方法制得的荧光功能性树枝状纳米大分子结构式 G1-G3，参见图1-3。

PDI及可替代PDI的荧光核类似物的结构有多种，参见图4。

实施例2基于荧光功能性树枝状纳米大分子递送颗粒的构建和表征

分别用实施例1制备的不同代数的荧光功能性树枝状纳米大分子 (G1-G3)与噻虫嗪(化学结构式参见图5)制备复合药物，参见图6， 具体步骤如下：

1、不同代数的荧光功能性树枝状纳米大分子(G1-G3)对噻虫 嗪的负载能力

1)紫外吸收光谱测试：将实施例1制备的不同代数的荧光功能性 树枝状纳米大分子(G1-G3)分别用去离子水配制为浓度为5μM的溶 液，加入噻虫嗪(浓度为0-400μM)，对样品进行紫外吸收光谱测试。 参见图7，紫外吸收峰没有明显变化。

2)荧光发射光谱测试：将上述步骤1)配制的样品溶液进行荧光 发射光谱测试。参见图8，G1-G3样品溶液中分别加入噻虫嗪后，荧 光发射光谱强度强度明显增强，并伴随有轻微蓝移；参见图9，当噻 虫嗪浓度达到400μM时，G2、G3样品溶液的荧光强度均大约增加到 原来的225％，而G1样品溶液的荧光强度则增加到原来的192％，实验 表明G1-G3都具有作为药物载体的潜能。

3)等温滴定微量热(ITC)测试：将实施例1制备的G1-G3分别 用去离子水配制为浓度为65μM的溶液，噻虫嗪用去离子水配制为浓 度为138μM的溶液。然后将G1-G3(250μL)注射到噻虫嗪溶液(1mL) 中，进行ITC测试。参见图10，G1-G3与噻虫嗪的结合常数分别为2.07 ×10⁵M^-1、3.98×10⁵M^-1、5.45×10⁵M^-1，表明G1-G3与噻虫嗪具有 适中的亲和力，且G2、G3与噻虫嗪结合的能力强于G1。同时，参见 图11，热力学参数均呈现ΔH>0和ΔG<0，表明G1-G3与噻虫嗪之 间主要是非共价键相互作用，如疏水性相互作用或氢键相互作用。

2、不同代数的荧光功能性树枝状纳米大分子(G1-G3)/噻虫嗪 复合药物颗粒的表征

G1-G3/噻虫嗪复合药物粒径由英国马尔文公司的ZetaSizer  Nano-ZS(Malvern Instruments,Southborough,MA)仪器在25℃下测 定，所有实验重复测定3次。

表1 G1-G3在水溶液中的动态光散射数据

表2 G1-G3与噻虫嗪形成的复合物水溶液尺寸

参见表1，树枝状化合物G1-G3在水溶液中的粒径大约为1-4nm， 而它们与噻虫嗪复合后的粒径大约为100-200nm(参见表2)，表明树 枝状化合物G1-G3装载疏水性药物噻虫嗪后能够组装为粒径较大的 纳米颗粒(100-200nm)，且在这个粒径范围内，复合物大分子很容易 通过内吞作用进入细胞，适合于细胞实验和活体实验研究。

实施例3荧光功能性树枝状纳米大分子作为药物载体的应用

将荧光功能性树枝状纳米大分子G1-G3分别与药物噻虫嗪混合， 然后与细胞共孵育，通过细胞的内吞作用使包裹药物的树枝状化合物 载体进入活体培养细胞，或通过饲喂昆虫的方法，使包裹药物的树枝 状化合物载体进入昆虫体内细胞中。

具体地，将荧光功能性树枝状纳米大分子作为药物载体，应用于 活体培养细胞和活体昆虫：

1、树枝状纳米大分子与药物结合后对活体培养细胞的毒性

将药物噻虫嗪以不同浓度分别与实施例1制得的荧光功能性树枝 状纳米大分子G1-G3化合物混合，荧光树枝状纳米大分子与药物的摩 尔比为1：1-80，然后加入到细胞培养液中，与细胞孵育一段时间后 (孵育时间越长效果越好)，该类树枝状化合物发挥载体功能，包裹 装载药物进入细胞，便于药物在细胞内发挥作用。G1-G3分别在浓度 为0.5μM时均表现出极低的细胞毒性。本发明用Tali^TM细胞活力试剂 盒Dead Cell Green测定了G1-G3在0.5μM时结合不同浓度的药物噻虫 嗪后对细胞的毒性。G1-G3分别与药物混合后加入到细胞培养液中， 与细胞孵育48h后，加入标记凋亡的染料Dead Cell Green，0.5h后在 荧光显微镜下成像，细胞核为绿色的表示凋亡细胞率。参见图12，随 着药物浓度的加大，细胞毒性增强；树枝状化合物代数越高，对细胞 的毒性越强。在没有树枝状化合物载体的情况下，药物本身对细胞的 毒性显著降低。因此，该类树枝状化合物发挥载体功能，包裹装载药 物进入活体昆虫培养细胞，有助于药物在细胞内发挥作用，增强了药 物的细胞毒性。

2、树枝状纳米大分子活体昆虫组织染色

根据以上对这三种树枝状化合物的合成步骤、光谱分析、DLS、 ITC及细胞毒性的研究，选择G2来研究其作为药物载体在活体器官组 织及昆虫上的应用研究。用G2进行幼虫的活体组织染色。在培养液 中解剖害虫幼虫，获得活体组织肠、脂肪体、脑。在含有一定浓度 G2的培养液中活体染色1h，然后用PBS清洗1h，洗去残存在组织表 面上的G2，制片后置于荧光显微镜下成像观察，如图13所示。所获 得的被试组织都能够被G2标记，G2能够有效地进入活体害虫组织。

3、G2能够进入害虫活体昆虫的肠细胞

将G2拌入新鲜的饲料中饲喂害虫的一龄幼虫，三天之后，解剖 幼虫获得其肠组织，于荧光显微镜下成像观察，如图14所示，可以很 清楚地观察G2存在于肠细胞中。此外，G2对幼虫的生长发育没有影 响，幼虫都能够正常化蛹、羽化成成虫并且产生子代。

4、树枝状纳米大分子结合药物对害虫的灭杀

室温下，将G2与药物混合，半小时后，加入到昆虫饲料中，与 饲料混匀后单独饲喂棉铃虫的二龄幼虫。于24h、48h、72h、96h、 120h观察拍照，并统计其死亡率，共设置两个对照组，分别为：水/ 药物，水。该药物噻虫嗪的杀虫谱包括同翅目害虫，但不包括鳞翅目 害虫例如棉铃虫。正如预期结果，对照组中所有的棉铃虫幼虫都能正 常生长发育。然而，参见图15，48h后，饲喂G2/药物复合物的棉铃 虫幼虫死亡率达到了50％，72h幼虫死亡率为66.67％，96h幼虫死亡 率上升到83.3％。参见图16，到了120h的时候，幼虫死亡率已经超过 了90％。此时对照组水/药物中幼虫死亡率还不到20％。每只幼虫总共 饲喂7.2μg药物和24μg G2。参见图17，G2/药复合物饲喂的幼虫表 型有严重缺陷，虫体大小明显小于对照组且虫体发黑，最终死亡。因 此，参见图18，G2包裹装载药物进入害虫体内细胞中，显著提高了 药物对细胞的毒性，增强了药效，有效地灭杀了非靶标害虫，扩大了 农药的防治谱。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发 明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神 的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。