基于离散三维荧光光谱的浮游植物识别测定方法与装置

摘要

本发明公开了一种基于离散三维荧光光谱的浮游植物识别测定方法与装置，测定方法根据浮游植物荧光光谱的指纹特征，选择不同光合色素对应的特征荧光峰作为分析对象，最大程度地保留了三维荧光谱中浮游植物特征信息，以标准离散三维荧光光谱库中的各特征光谱对样品特征光谱进行拟合，反演出样品中浮游植物种类及其含量；测定装置以多波段LED阵列作为激发光源，以多波段滤光片组作为接收荧光的波段选择器。本发明装置结构简单紧凑、体积小、携带方便，适用用于现场浮游植物的识别与测定，结合发明中提出的浮游植物识别与测定方法，可实现浮游植物现场快速的分类测量。

说明书

技术领域

本发明涉及环境科学领域，具体涉及一种基于离散三维荧光光谱的浮游植物 识别测定方法与装置。

背景技术

浮游植物种类和数量可以反映该区域的生态状况，浮游植物长期以来就被用 作水质的指标生物，特别对于大面积水域，测定浮游植物的物种和数量，对水质 评价有着更为重要的实用意义。随着我国内陆湖泊和近海海域水体富营养化，导 致水体浮游植物过量增殖，赤潮和水华频发，迫切需要发展能够直接、快速进行 浮游植物种类和数据分析技术与设备，为赤潮和水华监测预警提供重要手段。

浮游植物常用的识别测定方法主要有高效液相色谱法（HPLC）、分光光度法、 荧光分析法。分光光度法和HPLC具有选择性好、分离性能和灵敏度等特点，在 我国的废水监测分析和湖泊富营养化调查广泛应用，其中HPLC是美国EPA中 标准浮游藻类叶绿素a浓度检测方法447.0，但这两处方法都需要复杂而昂贵的 检测仪器、且样品需要预处理、分析时间长、整套设备体积大、对实验环境条件 要求高、只适于在实验室内进行测量；荧光分析法具有灵敏度高、易于实现实时 现场检测及对物质具有良好的鉴别性等优点而广受关注，是最具发展潜力的浮游 植物快速识别测定手段。Cowles等（1993）通过测量藻红蛋白荧光发射光谱波 长的位移,推断了海水中含藻红蛋白浮游植物种类和丰度的变化；Lee等（1995） 根据蓝藻所具有的藻蓝蛋白发出的特征激发荧光谱，建立了现场活体监测蓝藻含 量的荧光分析技术；Kolbowski等（1995）通过初始叶绿素荧光区分开了三个主 要的藻类种群；Beutler等（2002），利用浮游植物活体叶绿素激发荧光光谱，将 浮游植物分为四大类（绿藻，蓝藻，隐藻，混合藻（含甲藻和硅藻））识别测定， 建立了浮游植物群落组成测定技术。然而，单独利用激发或发射荧光光谱进行浮 游植物分类测量，存在的缺陷是识别与测定精度不够，无法将色素组成相近的浮 游植物（如硅藻和甲藻）或同门类不同种类的浮游植物分类识别，难以满足我国 赤潮和水华常见浮游植物监测的需要。张前前等（2006）、王志刚等（2007）、苏 荣国等（2008）利用浮游植物活体三维荧光光谱，结合平行因子、小波变换等光 谱模型算法，对浮游植物的浓度进行了分类测量。因为三维荧光光谱提供了更为 丰富的指纹信息，所以能够在更细层次上区分浮游植物，浮游植物识别与测定精 度都有很大程度提高。但由于传统三维荧光光谱测量仪器体积大、功耗高、光栅 传动等机构对运行稳定性要求高，使得基于三维荧光光谱的浮游植物识别测定方 法停留在实验室样品分析阶段，难以满足浮游植物现场识别测定的需求。

发明目的

针对我国水体富营养化现状和国家对赤潮和水华灾害监测的急迫需求，结合 浮游植物监测方法和技术的发展方向，本发明提出了一种基于离散三维荧光光谱 的浮游植物识别测定方法，并针对浮游植物荧光光谱特征，设计了一种离散三维 荧光光谱测定装置，该装置体积小、功耗低、结构简单稳定，能够现场检测浮游 植物的特征离散三维荧光光谱，实现浮游植物种类识别与含量测定。

发明内容

本发明提供了一种基于离散三维荧光光谱的浮游植物识别测定方法与装置， 可以直接测量水体中浮游植物的群落组成和色素含量，整个操作过程无需预处 理，可用于野外水体浮游植物现场快速调查。

本发明采用的技术方案是：

一种基于离散三维荧光光谱的浮游植物识别测定方法，其特征在于，具体包 括以下步骤：

（1）首先利用荧光分光光度计测量不同门类浮游植物连续三维荧光光谱， 结合浮游植物色素组成得到不同门类浮游植物的荧光光谱特征，结合目前单色发 光二极管的技术水平和滤光片加工工艺，选择412nm、435nm、455nm、470nm、 507nm、535nm、567nm、624nm、635nm、665nm等10个激发波段，选择620nm、 654nm、670nm、683nm、692nm、725nm等6个发射波段，构建由36个特征光 谱点组成的离散三维荧光光谱；

（2）然后，以叶绿素a浓度为统一标准，将特征荧光光谱对叶绿素a浓度 归一化，建立不同门类浮游藻类标准离散三维荧光光谱库；

（3）在浮游植物标准离散三维荧光光谱库找到与待测样品离散三维荧光光 谱最为相似的特征谱或特征谱组合，再转化为线性回归问题，即以标准离散三维 荧光光谱库中的各特征光谱对样品特征光谱进行拟合，具体计算过程如下：

1）建立需要测量的浮游植物的标准离散三维荧光光谱库；

2）测量混合浮游植物样品的离散三维荧光光谱；

3）以各门类浮游植物标准离散三维荧光光谱为自变量，混合浮游植物样品 荧光光谱为因变量进行多元线性回归分析，得出各门类浮游植物叶绿素a浓度。

一种基于离散三维荧光光谱的浮游植物识别测定装置，其特征在于：包括有 激发-发射驱动电路、激发-发射光学系统、荧光信号检测电路、数据采集与控制 电路；所述的激发-发射驱动电路包括有数字电位器、电机驱动器，数字电位器 连接恒流源、模拟开关，数字电位器与模拟开关之间连接有MOS管；所述的激 发-发射光学系统包括有圆柱形的样品池，距样品池底部10mm处环设有多段波的 LED阵列，LED阵列与样品池之间放置低通滤光片，样品池底部放置有光电探测 器，样品池底与光电探测器之间设有荧光波段选择滤光片组，荧光波段选择滤光 片组安装在滤光片轮，滤光片轮由直流电机驱动而转动，滤光片轮上设有光电定 位孔、光耦，模拟开关的各个开关并联并与LED阵列的各LED灯一一对应控制连 接；所述的荧光信号检测电路包括有依次链接的I/V转换电路、带通滤波电路、 可变增益放大电路、全波整流电路、低通滤波电路，光电探测器的信号输出端与 I/V转换电路的信号输入端连接；所述的数据采集与控制电路包括有主控制器， 主控制器与数据处理中心、模数转换器连接，数据处理中心的信号输出端与显示 屏连接，低通滤波电路的信号输出端与模数转换器的信号输入端连接，主控制器 与MOS管、模拟开关、电机驱动器控制连接；在主控制器的控制下，激发-发射 驱动电路通过模拟开关切换多段波的LED阵列、通过直流电机控制滤光片轮切换 波段选择滤光片，实现多波段分时激发和多波段荧光分时接收，荧光信号由光电 探测器转化为电信号，电信号由荧光信号检测电路放大调理成直流电平，直流电 平信号由模数转换器44转换成数据字信号交数据处理中心分析处理，最终测量 获得样品的离散三维荧光光谱，并反演得到样品中浮游植物种类和含量，测量结 果由显示屏输出。

所述的一种基于离散三维荧光光谱的浮游植物识别测定装置，其特征在于： 所述的样品池采用直径为10mm标准圆柱形石英样品池。

所述的一种基于离散三维荧光光谱的浮游植物识别测定装置，其特征在于： 所述的LED阵列共由10个LED组成，激发LED的中心波长分别为412nm、435nm、 455nm、470nm、507nm、535nm、567nm、624nm、635nm、665nm。

所述的一种基于离散三维荧光光谱的浮游植物识别测定装置，其特征在于： 所述的LED阵列与样品池之间放置的低通滤光片的低通截止波长稍高于LED中 心波长，滤除激发光中荧光波段光，减小光源散射光对荧光测量的影响。

所述的一种基于离散三维荧光光谱的浮游植物识别测定装置，其特征在于： 所述的光电探测器采用S3590-18型PIN管，与LED阵列成90°方向接收样品荧 光。

所述的一种基于离散三维荧光光谱的浮游植物识别测定装置，其特征在于： 所述的荧光波段选择滤光片组的波段分别为620nm、654nm、670nm、683nm、 692nm、725nm。

所述的一种基于离散三维荧光光谱的浮游植物识别测定装置，其特征在于： 所述的激发-发射光学系统安装在光学结构外壳中，光学结构外壳上方罩设有遮 光帽。

本发明的优点简述如下：

（1）为了区分和识别不同门的浮游植物，本发明根据浮游植物色素荧光光 谱的指纹特征，选择不同光合色素对应的特征荧光峰作为分析对象，提出了一种 基于离散三维荧光光谱的浮游植物识别与测定方法，本发明方法最大程度地保留 了三维荧光谱中浮游植物特征信息，对浮游植物具有较高的识别测定能力。

（2）针对浮游植物荧光光谱指纹特征，本发明以多波段LED阵列作为激发 光源，以多波段滤光片组作为接收荧光的波段选择器，设计了一种离散三维荧光 光谱测定装置，该装置结构简单紧凑、体积小、携带方便，适用于现场浮游植物 的识别与测定。

附图说明

图1为浮游植物离散三维荧光光谱点示意图。

图2为离散三维荧光光谱测定装置结构示意图。

图3为激发-发射驱动时序图。

图4为激发-发射光学系统结构示意图。

具体实施方式

一、基于离散三维荧光光谱的浮游植物识别测定方法

浮游植物活体荧光产生于细胞光合作用过程，与光合作用色素密切相关，荧 光的激发与发射波长取决于色素对光能的吸收、传递和释放特性。由于不同种类 浮游植物的光合色素组成和含量各异，所以光合色素荧光具有显著的浮游植物种 类指纹信息，是理想的浮游植物识别测定的标志物。

1、首先利用荧光分光光度计测量不同门类浮游植物连续三维荧光光谱，结 合浮游植物色素组成得到不同门类浮游植物的荧光光谱特征，结合目前单色发光 二极管的技术水平和滤光片加工工艺，本发明选择412nm、435nm、455nm、470 nm、507nm、535nm、567nm、624nm、635nm、665nm等10个激发波段，选 择620nm、654nm、670nm、683nm、692nm、725nm等6个发射波段，构建由 36个特征光谱点组成的离散三维荧光光谱，如图1所示。

2、然后，以叶绿素a浓度为统一标准，将特征荧光光谱对叶绿素a浓度归 一化，建立不同门类浮游藻类标准离散三维荧光光谱库。

3、基于离散三维荧光光谱的浮游植物识别测定方法的基本思想是在浮游植 物标准离散三维荧光光谱库找到与待测样品离散三维荧光光谱最为相似的特征 谱或特征谱组合，可转化为线性回归问题，即以标准离散三维荧光光谱库中的各 特征光谱对样品特征光谱进行拟合，具体计算过程如下：

1）建立需要测量的浮游植物的标准离散三维荧光光谱库；

2）测量混合浮游植物样品的离散三维荧光光谱；

3）以各门类浮游植物标准离散三维荧光光谱为自变量，混合浮游植物样品 荧光光谱为因变量进行多元线性回归分析，得出各门类浮游植物叶绿素a浓度。

二、基于离散三维荧光光谱的浮游植物识别测定装置

根据浮游植物荧光光谱的指纹特征，本发明设计了一种离散三维荧光光谱测 定装置，装置结构如图2所示。装置主要由四部分组成：激发-发射驱动电路10、 激发-发射光学系统20、荧光信号检测电路30、数据采集与控制电路40。在主控 制器41的控制下，激发-发射驱动电路通过模拟开关13切换多段波的LED阵列 21、通过直流电机25控制滤光片轮26切换波段选择滤光片24，实现多波段分 时激发和多波段荧光分时接收，驱动时序如图3所示。荧光信号由光电探测器 27转化为电信号，电信号由荧光信号检测电路30放大调理成直流电平，直流电 平信号由模数转换器44转换成数据字信号交数据处理中心42分析处理，最终测 量获得样品的离散三维荧光光谱，并反演得到样品中浮游植物种类和含量，测量 结果由显示屏43输出。

图2中：激发-发射驱动电路10包括有恒流源11、模拟开关12、数字电位 器13、MOS管14、电机驱动器15，激发-发射光学系20包括有LED阵列21、 低通滤光片22、样品池23、荧光波段选择滤光片组24、直流电机25、滤光片轮 26、光电定位孔27、光耦28、光电探测器29，荧光信号检测电路30包括有I/V 转换电路31、带通滤波电路32、可变增益放大电路33、全波整流电路34、低通 滤波电路35，数据采集与控制电路40包括有主控制器41、数据处理中心42、 显示屏43模数转换器44。

激发-发射光学系统20如图4所示，光学系统中心是直径10mm标准圆柱形 石英样品池23；激发光源共由10个LED组成，距离样品池底部10mm处，均 匀围绕在样品池周围，激发LED的中心波长分别为412nm、435nm、455nm、470 nm、507nm、535nm、567nm、624nm、635nm、665nm，LED与样品池23之 间放置低通滤光片22，低通截止波长稍高于LED中心波长，滤除激发光中荧光 波段光，减小光源散射光对荧光测量的影响；光电探测器29采用S3590-18型 PIN管，放置在样品池底部，与激发光源成90方向接收样品荧光，样品池底与 探测器之间荧光波段选择滤光片组24，波段分别为620nm、654nm、670nm、 683nm、692nm、725nm，安装在滤光片轮26上，由直流电机25、光电定位孔 27和光耦28配合实现滤光片切换；光学结构外壳2与遮光帽1相结合实现样品 室，激发-发射光学系统进行了光学密封设计，浮游植物的微弱荧光信号容易受 外界光照影响，针对浮游植物荧光光谱特征，采用离散化波长的激发光发射单元 和荧光探测单元设计，摒弃了传统三维荧光光谱仪复杂的分光系统，大大简化光 学结构，减小了装置体积和功耗。

激发-发射驱动电路10用于控制激发-发射光学系统20的激发光源LED阵列 21和荧光波段选择滤光片组24的切换。激发光源驱动电路采用恒流源驱动方式， 提高光源的稳定性，使用多档数字电位器13调节各路LED的驱动电流，让各路 LED光强都在1500μmol/m²/s左右，保障浮游植物活体细胞受激下能够正常光合 作用；使用模拟开关12控制10路LED的切换；使用MOS管开关14对光源进行 10kHz调制，让激发产生的荧光携带特定的频率信息，以提高荧光信号测量的信 噪比。滤光片轮驱动电路使用光耦检测滤光片轮光电定位孔确定滤光片轮的位 置，通过直流电机控制滤光片轮转动，切换荧光波段选择滤光片。激发-发射驱 动电路所有控制时序由主控制器41提供。

荧光信号检测电路30由I/V转换电路31、带通滤波电路32、可变增益放大 电路33、全波整流电路34和低通滤波电路35组成。I/V转换电路使用低噪声、 高精度的放大器OPA637进行电路电压转化放大，转化电阻200kΩ；带通滤波电 路使用4阶巴特沃斯滤波电路，带通频率10kHz，对信号进行选频输出；可变增 益放大电路共有100、300、900、2400四档放大倍数，电路通过模拟开关选择放 大器的增益电阻来调节放大倍数，模拟开关由主控制器41控制；全波整流电路 和低通滤波电路组成解调电路，将10kHz正弦信号调理成直流信号，直流信号 大小正比与正弦信号幅度。

数据采集与控制电路40由主控制器41、模数转换器44、数据处理中心42、 显示屏43组成。主控制器控制激发-发射驱动和荧光检测电路的时序，接收由模 数转换器采集的数据信号，测量得到样品的离散三维荧光光谱；数据处理中心利 用预先存储的浮游植物标准离散三维荧光光谱对测量的样品荧光光谱进行拟合， 反演得到不同门类浮游植物的叶绿素a含量；样品离散三维荧光光谱和浓度计算 结果最终由显示屏显示输出。

实施例

选择蓝藻门的铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）、绿藻门的小球藻 （Chlorella vulgaris）、硅藻门的桅杆藻（Fragilaria sp）、甲藻门的光甲藻 （Glenodinium gymnodinium）和隐藻门的卵形隐藻（Cryptomonas ovata）实验藻 种，取上述五种藻类15天的纯种培养体，使用高效液相色谱法测量各纯种培养 体叶绿素a浓度，将纯种培养体以蒸馏水稀释一定倍数作为样品母液，根据稀释 比例计算出样品母液叶绿素a浓度，母液叶绿素a浓度控制在80-100μg/L范围。 然后，用蒸馏水将五种藻类母液分别对半稀释成3个浓度梯度的纯种样品，再按 表2所示体积比例混合配制成26种浮游藻类混合样品。

表1配制浮游藻类混合样品的体积比例

表1注：数字0代表蒸馏水，字母A、B、C、D、E分别代表铜绿微囊藻、小球藻、 桅杆藻、光甲藻和卵形隐藻。

将配制的浮游藻类混合样品暗适应30min后，利用本课题研制的浮游藻类识别测 定装置测量上述各样品离散三维荧光光谱，并计算出混合样品种各门类浮游藻类 的叶绿素a浓度，每个样品测量3次，平均值作为测量结果，将荧光法的测量结 果与高效液相色谱法测量结果比较。结果的统计分析显示：对纯种藻类样品，荧 光法测量结果准确高，测量值与HPLC测量值非常接近，铜绿微囊藻、小球藻、 桅杆藻、光甲藻和卵形隐藻浓度测量结果的相对误差分别为0.7％、7.64％、 5.73％、4.66％、8.68％；在混合样品中，对浓度比率高于50%的优势藻，荧光 法浓度测量值与HPLC测量值接近，铜绿微囊藻、小球藻、桅杆藻、光甲藻和卵 形隐藻浓度测量结果的相对误差分别为6.42％、10.26％、5.78％、4.66％、9.84％。