一种18O在线标记的蛋白质定量分析平台及其操作方法

摘要

本发明涉及一种18O在线标记的蛋白质定量分析平台及其操作方法。18O在线标记的蛋白质定量分析平台是一种集蛋白质在线酶解，18O在线标记，多肽分离、检测于一体的系统，包括：注射泵，进样针，柱温箱，酶反应器，切换阀，肽段捕集柱，液相色谱泵，多肽分离柱以及质谱检测器。蛋白样品首先通过注射泵上样到酶反应器中进行孵育，在酶解的同时进行18O标记，酶解完成后18O标记的肽段经捕集柱在线富集后，转入多肽分离柱进行进一步的分离，最后通过质谱检测器进行检测。本发明的优点是将蛋白酶解、18O标记、多肽分离集成化。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种¹⁸O在线标记的蛋白质定量分析平台及其操作方法， ¹⁸O在线标记的蛋白质定量分析平台是一种集蛋白质在线酶解，¹⁸O在线标 记，多肽分离，检测为一体的系统。

背景技术：

蛋白质组学起步阶段蛋白质混合物主要分离技术是二维凝胶电泳 （2DE），通过第一维等电聚焦电泳和第二维尺寸排阻电泳使蛋白混合物充 分分离，然后通过考马斯亮蓝染色或银染使分离在凝胶上面的蛋白显色， 显色强度代表样品中对应蛋白含量。通过比较两个样品在二维凝胶电泳中 相同位置蛋白显色强度就可以得到对应蛋白在两个样品中的相对含量，同 时同一块凝胶上不同蛋白点的强度也粗略代表不同蛋白质在同一个样品中 相对丰度。但是二维凝胶电泳操作步骤多，重现性差，不能分析极酸极碱 性蛋白、膜蛋白；另外在生物样品中蛋白含量具有很宽动态范围（跨越7-12 个数量级，如血清样品），而二维凝胶电泳只能显色大部分高丰度蛋白。随 着“shotgun”蛋白质组学技术发展，二维凝胶电泳定量已经逐渐被各种基 于液相色谱分离质谱检测的高通量、高灵敏度定量方法所取代。

同位素标记定量是现阶段应用最为广泛的蛋白质组学定量方法，主要包 括二甲基标记，18O标记，体内同位素标记（SILAC），iTRAQ标记等等。 其中18O标记由于标记试剂相对便宜；可以对体液、细胞、组织等各类样 品进行标记；在酶解的同时进行标记，无需引入额外标记步骤等诸多优势 而得到了较广泛的应用。目前，限制这种方法进一步推广的原因主要有如 下两点：1、¹⁸O标记效率较低：¹⁸O标记主要分为一步法和两步法，一步 法操作较简单，只需将样品溶在¹⁸O的溶液中进行酶解即可，但此种方法标 记效率很低；两步法标记效率相对一步法高，但操作繁琐耗时，需先将样 品在¹⁶O的溶液中进行酶解，酶解后除盐蒸干，蒸干后的肽段再溶于¹⁸O的 溶液中孵育。2、¹⁸O标记存在回交问题，即采用传统方法进行¹⁸O标记后， 由于蛋白酶仍存在于溶液中，一旦碰到¹⁶O的溶液，标记上¹⁸O的肽段又会 回交为¹⁶O（Journal of Proteome Research 2009,8,2140-2143；Journal of Proteome Research 2009,8,2157-2163）。

针对¹⁸O标记存在的上述问题，我们构建了一种集蛋白质在线酶解、¹⁸O 在线标记、多肽分离、检测于一体的分析系统。该系统通过将包含酶反应 器的在线分析平台与¹⁸O标记有机结合，实现蛋白质在线酶解、¹⁸O在线标 记、多肽分离以及检测的快速定量分析，在蛋白质组学研究中具有很好的 应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种集蛋白质在线酶解、¹⁸O在线标记、多肽分 离、检测于一体的系统。该系统可以快速的进行¹⁸O在线标记，避免了传统 的离线标记方法所带来的操作繁琐耗时、标记效率低、存在回交等问题。 为了实现该目的，本发明的技术方案是：

一种¹⁸O在线标记的蛋白质定量分析平台，

¹⁸O在线标记的蛋白质定量分析平台的构建：进样针与注射泵传动连接， 由注射泵驱动进样针向酶反应器内进样；酶反应器置于一柱温箱内，酶反 应器的样口入口与进样针相连，酶反应器的样口出口接第一四通或六通阀 的第一接口；二台液相色谱泵的物料入口分别与两个流动相储罐相连，二 台液相色谱泵的物料出口分别与一个混合器的入口相连，混合器的出口接 第一四通或六通阀的第二接口；肽段捕集柱入口端与三通的第一接口相连， 三通的第二接口与第一四通或六通阀的第三接口相连，三通的第三接口与 第二四通或六通阀的第一接口相连；第一四通或六通阀的第四接口接废液 收集容器；肽段捕集柱的出口端与四通的第一接口相连，四通的第二接口 与第二四通或六通阀的第二接口相连，第二四通或六通阀的第三接口和第 四接口接废液收集容器；四通的第三接口接高压加电金属针；四通的第四 接口与多肽分离柱的入口端相连，多肽分离柱的出口端与质谱检测器的进 样口相连。

所述¹⁸O在线标记的蛋白质定量分析平台将蛋白酶解部件、¹⁸O在线标 记、多肽分离部件、检测器集成化。

酶反应器是实现¹⁸O在线标记的关键部件，能够在酶解的同时对酶解后 的肽段进行高效的¹⁸O标记；制备酶反应器的材料可以为有机基质的整体材 料，有机-无机杂化的整体材料，有机基质的颗粒材料；制备酶反应器所固 载的酶的种类为：丝氨酸蛋白酶。

所述¹⁸O在线标记的蛋白质定量分析平台的操作方法：

通过注射泵调节流速，将进样针中的蛋白样品注射进入酶反应器中， 酶反应器被放置在柱温箱中，停留孵育45min至90min后，将酶反应器中 酶解后的肽段通过第一四通或六通阀注入到捕集柱上，切换第一四通或六 通阀和第二四通或六通阀，捕集柱上的肽段样品将被液相色谱泵流动相带 入多肽分离柱中进行进一步分离，最后通过质谱检测器进行分析。

¹⁸O在线酶促标记时，样品溶于NH₄HCO₃溶液中，其浓度范围为20mM 至100mM；¹⁸O在线酶促标记时，反应温度可设定为25℃至40℃；¹⁸O在 线酶促标记时，酶促标记的时间为45min至90min。

1、采用酶反应器对蛋白质进行在线酶解。

2、酶解后的肽段在酶反应器中原位进行¹⁸O酶促标记。

3、标记完成后，用¹⁸O的溶液将标记后的肽段冲到捕集柱上，再进行 后续的质谱分析。

本发明的有益效果是：

1、系统集成化、自动化程度高。

2、由于不需要离线酶解，系统的分析通量大大提高。

3、可以直接分析蛋白，样品预处理步骤减少，从而样品损失、污染的 可能性也将降低。

4、相比于传统的离线¹⁸O标记方法，¹⁸O在线标记需要的样品量更少， 在大大降低操作繁琐程度、标记时间的同时能保证很高的标记效率，且不 存在回交的问题。

附图说明

图1、分析平台装置图；

图2、¹⁸O在线标记对牛血清白蛋白的标记情况（与未标记样品对比）；

图3、¹⁸O在线标记与两步法离线标记对牛血清白蛋白的标记情况对比图；

图4、¹⁸O在线标记回交情况（标记后当天与标记一周后¹⁸O标记情况对比）。

具体实施方式

实施例1

如图1所示，该分析装置由注射泵1、进样针2、柱温箱3、酶反应器 4、第一四通或六通阀5、肽段捕集柱6、多肽分离柱7、第二四通或六通阀 8、液相色谱泵9、质谱检测器10组成。该分析装置的特征在于将蛋白酶解， ¹⁸O标记，多肽分离系统集成化。操作过如下：通过注射泵1调节流速，将 进样针2中的蛋白样品注射进入酶反应器4中（酶反应器4被放置在柱温 箱3中），停留孵育1小时后，将酶反应器4中酶解后的肽段通过第一四通 或六通阀5注入到捕集柱6上，切换第一四通或六通阀5和第二四通或六 通阀8，捕集柱6上的肽段样品将被液相色谱泵9流动相带入多肽分离柱7 中进行进一步分离，最后通过质谱检测器10进行分析。

实施例2

采用¹⁸O在线标记的方法对牛血清白蛋白进行分析。将0.1mg/mL的牛血清 白蛋白溶液（溶于H₂¹⁶O配成的50mM NH₄HCO₃中）上样到酶柱上孵育一 小时，孵育完后使用H₂¹⁶O配成的50mM NH₄HCO₃将样品洗脱并使用 MALDI-TOF进行分析；同样，将0.1mg/mL的牛血清白蛋白溶液（溶于 H₂¹⁸O配成的50mM NH₄HCO₃中）上样到酶柱上孵育一小时，孵育完后使 用H₂¹⁸O配成的50mM NH₄HCO₃将样品洗脱并使用MALDI-TOF进行分析。 两份样品的MALDI-TOF分析结果如图2所示。

实施例3

分别采用¹⁸O在线标记和文献报道的两步法对牛血清白蛋白进行分析。将 0.1mg/mL的牛血清白蛋白溶液（溶于H₂¹⁸O配成的50mM NH₄HCO₃中） 上样到酶柱上孵育一小时，孵育完后使用H₂¹⁸O配成的50mM NH₄HCO₃将样品洗脱并使用MALDI-TOF分析了¹⁸O的标记效率；向另一份0.1 mg/mL的牛血清白蛋白溶液（溶于H₂¹⁶O配成的50mM NH₄HCO₃中）中加 入胰酶（胰酶与蛋白质量比为1:25）酶解过夜，再对酶解后的溶液进行除 盐蒸干，蒸干后的样品复溶于H₂¹⁸O配成的50mM NH₄HCO₃（其中含体积 比为20%的乙腈）中，再加入胰酶（胰酶与蛋白质量比为1:25）孵育24小 时，最后用MALDI-TOF对¹⁸O的标记效率进行分析。两种方法对牛血清白 蛋白的¹⁸O标记效率对比如图3所示。

实施例4

考察了¹⁸O在线标记方法对牛血清白蛋白标记后样品的回交情况。按实施例 2所示方法对牛血清白蛋白进行在线¹⁸O标记后，对样品进行了MALDI-TOF 分析；向这一份样品中添加10倍体积H₂¹⁶O配成的50mM NH₄HCO₃溶液， 放置一周后，对样品进行了MALDI-TOF分析。分析结果如图4所示。

实施例5

采用¹⁸O在线标记方法与文献报道的一步法及两步法进行对比。其中¹⁸O在 线标记方法是将样品在酶反应器中孵育一小时即可；一步法是将样品直接 溶于H₂¹⁸O配成的溶液中进行离线酶解；两步法是将样品先溶于H₂¹⁶O配成 的溶液中进行酶解，酶解后的溶液经除盐蒸干后再复溶于H₂¹⁸O配成的溶 液中进行孵育。具体对比结果如表1所示。

表1、¹⁸O在线标记与文献报道的离线方法的标记耗时、标记效率对比

  ¹⁸O在线标记 一步法 两步法 时间 1hour 约24hour 大于48hour 标记效率 90%以上 低于80% 90%左右