一种血葡萄糖的检测方法及检测试剂盒

摘要

本发明公开了一种血葡萄糖的检测方法，采用酶学速率测定法，根据在波长500nm处，反应体系吸光度的升高速率与样本中血葡萄糖的浓度成正比，延迟30～60秒后，测定30～180秒内的吸光度升高速率，得到血葡萄糖的含量,使用酶学速率测定法，测定的是反应的速率，在反应过程中的线性期进行读数，可以完全排除血清样品本底的干扰，提高了结果的准确度；延迟时间短，读数时间也很短，这样就使整个反应时间大大缩短，由原来的5～15分钟缩短为3分钟以内，提高了效率。

说明书

技术领域

 本发明涉及一种血葡萄糖的检测方法，具体地说，涉及一种酶学速率法人血清血葡萄糖的检测方法及检测试剂盒，用于体外定量测定人血清、血浆中的血葡萄糖的浓度，属于医用诊断制剂技术领域。

背景技术

正常情况下，人体中糖的分解和合成代谢处于动态平衡中，保持相对恒定。血清葡萄糖是指血液中的葡萄糖浓度，一般禁食8～12h后空腹抽取静脉血，标本在1小时内送检，血糖测定是诊断糖尿病的最主要检查项目之一。

正常参考值成人3.9～6.1mmol/L，足月新生儿2.8～4.5mmol/L。异常结果分析，生理性增高见于餐后1～2h和情绪紧张时，但不应超过10mmol/L；生理性降低见于饥饿、妊娠、剧烈运动后。病理性增高有以下几种情况：（1）胰岛功能低下，胰岛素分泌不足的糖尿病；（2）使血糖升高的激素分泌增多，如嗜铬细胞瘤、肾上腺皮质功能亢进（库欣综合征）、垂体前叶功能亢进（肢端肥大症）、甲状腺功能亢进等；（3）中枢性疾病，如颅内压增高，颅内出血，重症脑炎，颅脑外伤、脑瘤、脑膜炎等；（4）其他疾病，如慢性胰腺炎、甲状腺功能亢进、心肌梗死、皮质醇增多症、肢端肥大症、嗜铬细胞瘤、胰高血糖素瘤、肝硬化、妊娠呕吐、脱水、全身麻醉时。病理性降低有以下几种情况：（1）胰岛β细胞瘤，胰岛素分泌过多；（2）降血糖药物用量过多；（3）垂体前叶功能减退、肾上腺皮质功能减退、艾迪生病、甲状腺功能减退；（4）长期营养不良、严重肝炎、肝硬变、糖原累积病、酒精中毒等。

血糖测定方法很多，迄今为止大体可分为四类：氧化还原法、缩合法、酶法及其他类方法。其中酶法包括葡萄糖氧化酶法（GOD）、己糖激酶法（HK）和葡萄糖脱氢酶法（GDH），其中以GOD法应用最为广泛。己糖激酶（HK）法是目前国际上公认的测定葡萄糖参考方法，但试剂比较昂贵。目前有很少单位仍沿用邻甲苯胺法。其他方法已基本没有使用。以上方法均为终点法测定，有一个共同的缺点就是易受血清本底干扰，而且反应时间长，大大影响了结果的准确性和测定效率。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对以上不足，提供一种酶学速率法人血清血葡萄糖的检测方法，用于体外定量测定人血清、血浆中的血葡萄糖的浓度，克服了现有检测方法易受血清本底干扰、反应时间长的缺陷，本发明检测方法以酶催化法，创新使用酶学速率测定法，完全排除了血清本底的干扰，大大缩短了反应时间，操作简便，结果准确可靠，适用于各种生化分析仪器。

本发明的另一目的是提供一种实施该检测方法的检测试剂盒。

为解决以上问题，本发明采用的技术方案是：一种血葡萄糖的检测方法，其特征在于：所述检测方法为采用酶学速率测定法，根据在波长500nm处，反应体系吸光度的升高速率与样本中血葡萄糖的浓度成正比，延迟30～60秒后，测定30～180秒内的吸光度升高速率，得到血葡萄糖的含量。

一种优化方案，所述吸光度上升速率测定步骤：

a、制备反应液

取空白管、标准管及样本管，分别加入缓冲液；然后在样本管、空白管及标准管内对应加入待测样本、蒸馏水及标准液，混匀，37℃条件下保温3～5分钟，再加入酶试剂，混匀，得到反应液；或

将缓冲液和酶试剂按比例混合配成试剂工作液，稳定3～5分钟；然后根据测定取所需要的空白管、标准管及样本管，分别加入试剂工作液；再分别在样本管、空白管及标准管内对应加入待测样本、蒸馏水及标准液，得到反应液；

b、反应液在37℃条件下反应，延迟30～60秒后，在波长500nm处读取反应液的吸光度变化，读数间隔时间为30～180秒，计算平均每分钟吸光度变化率，得到空白管、标准管及样本管内反应液的每分钟吸光度变化率。

进一步地，所述缓冲液与酶试剂的体积比为5:1～1:1；缓冲液、酶试剂之和与样本的体积比为200:1～100:1。 

进一步地，所述缓冲液为含有25mmol/L对羟基苯甲酸盐的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液。

进一步地，所述酶试剂为葡萄糖氧化酶和过氧化酶溶液，葡萄糖氧化酶浓度为5～200U/ml；过氧化酶浓度为2～30U/ml。

进一步地，所述标准液为葡萄糖溶液，浓度为2～7mmol/L。

基于所述检测方法的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括包装盒、缓冲液、酶试剂、标准液；

所述缓冲液为含有25mmol/L对羟基苯甲酸盐的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液。

进一步地，所述酶试剂为葡萄糖氧化酶和过氧化酶溶液，葡萄糖氧化酶浓度为5～200U/ml；过氧化酶浓度为2～30U/ml。

进一步地，所述标准液为葡萄糖溶液，浓度为2～7mmol/L。 

另一种优化方案，根据下列公式计算血葡萄糖的含量： 

血葡萄糖含量(mmol/L)=                                                         ×标准浓度

标准浓度为标准液的浓度值。

使用方法：根据仪器要求，在半自动生化分析仪上使用单试剂模式，也可以使用单试剂模式；在分光光度计上使用单试剂模式；在全自动生化分析仪上可以使用双试剂模式，也可以使用单试剂模式。

储存条件及有效期为：原装试剂2～8℃保存，有效期12个月；缓冲液、酶试剂配成试剂工作液后，室温可以稳定8小时，在2～8℃冷藏可稳定30天。

适用仪器为适用于各种半自动和全自动生化分析仪及分光光度计。

样本要求为：样本可以是新鲜不溶血血清或血浆，血样中葡萄糖在室温（15～25℃）条件可稳定4小时，在冷藏（2～8℃）条件可稳定1天。样本应避光；采样后最好立即测定。

本发明采用以上技术方案，与现有技术方案相比，具有以下优点：

本发明使用酶学速率测定法，测定的是反应的速率，在反应过程中的线性期进行读数，完全不同于其他方法的终点测定法，可以完全排除血清样品本底的干扰，提高了结果的准确度；

本发明采用速率法后，延迟时间短，读数时间也很短，这样就使整个反应时间大大缩短，由原来的5～15分钟缩短为3分钟以内，提高了效率；

本发明因为无需考虑血清样品本底的去除，所以操作简便，仪器参数设置也很简单，无需复杂的计算公式；

本发明可以使用双试剂模式进行测定，也可以使用单试剂模式进行测定，因此可以适用于各种自动、半自动生化分析仪器，适用范围广。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

附图说明

附图1为本发明实施例中葡萄糖氧化酶浓度一定、血葡萄糖浓度不同时的反应吸光度曲线；

附图2为本发明实施例中血葡萄糖浓度一定、葡萄糖氧化酶浓度不同时的反应吸光度曲线。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1，一种检测试剂盒，包括包装盒、缓冲液、酶试剂、标准液；包装盒为试剂盒外包装；以下称缓冲液为试剂1，称酶试剂为试剂2。

缓冲液为含有25mmol/L对羟基苯甲酸盐的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液。

酶试剂为葡萄糖氧化酶和过氧化酶溶液，葡萄糖氧化酶浓度为5～200U/ml；过氧化酶浓度为2～30U/ml。

试剂1与试剂2的体积比为5～1:1。

标准液为葡萄糖溶液，浓度为2～7mmol/L，以国家标准品赋值校准。

储存条件及有效期为：原装试剂2～8℃保存，有效期12个月；缓冲液、酶试剂配成工作液后，室温可以稳定8小时，在2～8℃冷藏条件下可稳定30天。

适用仪器为适用于各种半自动和全自动生化分析仪。

基于以上检测试剂盒，血葡萄糖的检测方法按照以下步骤进行，检测方法的原理为酶学速率法，根据在波长500nm处，吸光度的上升速率与样本中血葡萄糖的浓度成正比，延迟30～60秒后，测定30～180秒时间段内的吸光度上升速率，根据公式计算血葡萄糖的含量。

测定原理依据如下：

如图1 所示，在葡萄糖氧化酶浓度一定的情况下，葡萄糖氧化酶活性为0.2U/ml，不同浓度葡萄糖的反应曲线在0～6分钟内基本为直线关系，进一步的，在0～5分钟内，反应的线性良好，所以确定线性期为0～5分钟，读数时间应在此范围内。

如图2 所示，葡萄糖一定的情况下，葡萄糖浓度为10mmol/ml，不同浓度葡萄糖氧化酶的反应曲线有明显差异，通过进行不同浓度血葡萄糖情况下改变葡萄糖氧化酶浓度得到的反应曲线，结果显示反应液中葡萄糖氧化酶浓度在1U/ml～40U/ml范围内，0～5分钟内的线性良好，超过40U/ml则线性期很短，在4分钟内即基本到达反应终点，浓度越高，到达终点的时间越短，这样无法确定一定的读数期，或者读数期内无法实现均匀的速率反应，而且过多的酶对反应产物有一定影响，到达终点后的吸光度有下降趋势，不稳定；低于1U/ml则反应吸光度变化很小，灵敏度很低。所以确定反应液中酶浓度范围为1U/ml～40U/ml。

具体操作方法如下：

（1）吸光度上升速率检测

双试剂模式操作步骤： 首先根据测定取所需要的空白管、标准管及样本管，分别加入缓冲液；然后在样本管、空白管及标准管内对应加入待测样本、蒸馏水及标准液，混匀，混匀，37℃条件下保温3～5分钟，优选为5分钟，然后再加入酶试剂，混匀，延迟30～60秒后，得到反应液，反应液中酶浓度为1～40U/ml，在波长500nm处读取反应液的吸光度变化，读数间隔时间为30～180秒，计算平均每分钟吸光度变化率ΔA/分钟，得到空白管、标准管及样本管内反应液的每分钟吸光度变化率ΔA/分钟；

或，

单试剂模式操作步骤：先将缓冲液和酶试剂配成试剂工作液，稳定10分钟；然后根据测定取所需要的空白管、标准管及样本管，分别加入试剂工作液；再分别在样本管、空白管及标准管内对应加入待测样本、蒸馏水及标准液，得到反应液，反应液中酶浓度为1～40U/ml，37℃反应，延迟30～60秒后，在波长500nm处读取反应液的吸光度变化，读数间隔时间为30～180秒，计算平均每分钟吸光度变化率ΔA/分钟，得到空白管、标准管及样本管内反应液的每分钟吸光度变化率ΔA/分钟；

试剂1与试剂2之和与样本的体积比为200:1～100:1。

（2）计算结果：

根据下列公式计算血葡萄糖的含量：

血葡萄糖含量(mmol/L) = ×标准浓度

标准浓度为标准液的浓度值。

样本的制备方法为：样本采用血清或血浆，按照医院通常采用的标准方法采集血样，然后分离血清或者血浆。

样本要求为：样本可以是新鲜不溶血血清或血浆，血样中葡萄糖在室温（15～25℃）条件可稳定4小时，在冷藏（2～8℃）条件可稳定1天。样本应避光；采样后最好立即测定。

实施例2，一种检测试剂盒，除以下与实施例1不同外，其余与实施例1中检测试剂盒相同；缓冲液为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液，含有25mmol/L对羟基苯甲酸盐，pH值为7.3；酶试剂为葡萄糖氧化酶溶液，浓度为10U/ml，含有5U/ml过氧化酶和3mmol/L的4-氨基安替比林；试剂1与试剂2的体积比为4:1；标准液为血葡萄糖溶液，浓度为5.55mmol/L，以国家标准品赋值校准。

采用以上检测试剂盒对血葡萄糖进行检测，检测方法按照以下步骤进行：吸光度上升速率测定步骤按照双试剂模式操作进行，首先根据测定取所需要的空白管、标准管及样本管，分别加入缓冲液；然后在样本管、空白管及标准管内对应加入待测样本、蒸馏水及标准液，混匀，37℃条件下保温5分钟，然后再加入酶试剂，混匀，得到反应液，反应液中酶浓度为2U/ml；37℃反应，延迟30秒后，在波长500nm处读取反应液的吸光度变化，读数时间为60秒，计算平均每分钟吸光度变化率ΔA/分钟，得到空白管、标准管及样本管内反应液的每分钟吸光度变化率ΔA/分钟；各成分的具体量见下表，其余步骤与实施例1的检测方法相同。

分析方法：速率法；反应方向：正反应。

 空白管标准管样本管试剂1（μl）240240240蒸馏水（μl）2--------标准液（μl）----2 标  本（μl）---------2试剂2（μl）606060

 

血葡萄糖含量(mmol/L) =    ×标准浓度 

ΔA为吸光度变化率；

标准浓度为标准液的浓度值。

血葡萄糖参考范围为：

3.9-6.1mmol/L  (70-110mg/dL)

检验结果的解释：本试剂用于体外定量测定人血清中葡萄糖（Glucose，GLU）的浓度。葡萄糖的准确测定对于诊断和处理高糖血症和低糖血症是十分重要的。葡萄糖浓度的升高可由糖尿病、葡萄糖摄入过量、柯兴氏综合症和脑血管意外等引起。葡萄糖浓度的降低则可由胰岛瘤、胰岛素过量、先天性碳水化合物代谢障碍或厌食等引起。通常在查找这些病症的起因时，还将各种耐量试验和刺激试验与葡萄糖测定一同进行。血糖测定是诊断糖尿病的最主要检查项目之一，结合糖化血红蛋白检测对糖尿病是否控制能更准确地判定。

线性范围：0～25mmol/L（450mg/dL）（37℃）。

注意事项

1、在全自动生化分析仪上使用双试剂工作模式，结果会更加准确可靠；

2、根据不同仪器的要求，试剂与样本用量可按比例改变；

3、测定波长可在500nm附近选择；

4、国际单位换算：mmol/L × 18 = mg/dL。

5、如果样品血糖浓度＞25 mmol/L （37℃）或怀疑高值而测定偏低（钩状效应），将其以生理盐水稀释后重测，结果乘以稀释倍数；

实施例3，一种检测试剂盒，除以下与实施例1不同外，其余与实施例1中检测试剂盒相同；缓冲液为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液，含有40mmol/L对羟基苯甲酸盐，pH值为7.3；酶试剂为葡萄糖氧化酶溶液，浓度为12U/ml，含有2U/ml过氧化酶和1.2mmol/L的4-氨基安替比林；试剂1与试剂2的体积比为1:1；标准液为血葡萄糖溶液，浓度为5.55mmol/L，以国家标准品赋值校准。

采用以上检测试剂盒对血葡萄糖进行检测，检测方法按照以下步骤进行：吸光度上升速率测定步骤按照双试剂模式操作进行，首先根据测定取所需要的空白管、标准管及样本管，分别加入缓冲液；然后在样本管、空白管及标准管内对应加入待测样本、蒸馏水及标准液，混匀，37℃条件下保温5分钟，然后再加入酶试剂，混匀，得到反应液，反应液中酶浓度为6U/ml；37℃反应，延迟30秒后，在波长500nm处读取反应液的吸光度变化，读数时间为60秒，计算平均每分钟吸光度变化率ΔA/分钟，得到空白管、标准管及样本管内反应液的每分钟吸光度变化率ΔA/分钟；各成分的具体量见下表，其余步骤与实施例2的检测方法相同。

分析方法：速率法；反应方向：正反应。

 空白管标准管样本管试剂1（μl）150150150蒸馏水（μl）2--------标准液（μl）----2 标  本（μl）---------2试剂2（μl）150150150

 

实施例4，一种检测试剂盒，除以下与实施例1不同外，其余与实施例1中检测试剂盒相同；缓冲液为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液，含有20mmol/L对羟基苯甲酸盐，pH值为7.3；酶试剂为葡萄糖氧化酶溶液，浓度为15U/ml，含有6U/ml过氧化酶和4mmol/L的4-氨基安替比林；试剂1与试剂2的体积比为5:1；标准液为血葡萄糖溶液，浓度为5.55mmol/L，以国家标准品赋值校准。

采用以上检测试剂盒对血葡萄糖进行检测，检测方法按照以下步骤进行：吸光度上升速率测定步骤按照双试剂模式操作进行，首先根据测定取所需要的空白管、标准管及样本管，分别加入缓冲液；然后在样本管、空白管及标准管内对应加入待测样本、蒸馏水及标准液，混匀，37℃条件下保温5分钟，然后再加入酶试剂，混匀，得到反应液，反应液中酶浓度为2.5U/ml；37℃反应，延迟30秒后，在波长500nm处读取反应液的吸光度变化，读数时间为60秒，计算平均每分钟吸光度变化率ΔA/分钟，得到空白管、标准管及样本管内反应液的每分钟吸光度变化率ΔA/分钟；各成分的具体量见下表，其余步骤与实施例2的检测方法相同。

分析方法：速率法；反应方向：正反应。

 空白管标准管样本管试剂1（μl）250250250蒸馏水（μl）2--------标准液（μl）----2 标  本（μl）---------2试剂2（μl）505050

 

以上实施例中吸光度上升速率测定步骤也可以按照单试剂模式操作进行，首先将试剂1与试剂2配成试剂工作液，稳定5分钟；然后根据测定取所需要的空白管、标准管及样本管，分别加入试剂工作液；再分别在样本管、空白管及标准管内对应加入待测样本、蒸馏水及标准液，混匀，得到反应液，37℃反应，其余步骤与各实施例相同；各成分的具体见下表，所得结果与各实施例的结果一致。

分析方法：速率法；反应方向：正反应。

 空白管标准管样本管试剂工作液（μl）300300300蒸馏水（μl）2--------标准液（μl）----2 标  本（μl）---------2

 

在半自动生化分析仪和全自动生化分析仪上均可以使用双试剂模式，也可以使用单试剂模式，推荐使用双试剂模式。

本发明上述实施例2至实施例4与传统的氧化酶终点法及己糖激酶终点法进行血葡萄糖的检测，结果如下表：

 测定次数平均值相对偏差%实施例21011.50 mmol/L2.7实施例31011.64 mmol/L3.9实施例41011.55 mmol/L3.1氧化酶终点法1011.75 mmol/L 4.9己糖激酶终点法1011.56 mmol/L3.2

结果显示：通过本发明的实施例进行血葡萄糖的检测，并与氧化酶终点法及己糖激酶终点法的检测结果进行比较，无显著差异，但从数据看出，本发明的方法因为完全排除了血清本底因素的干扰，去除了本底对测定值的增高的影响，因此测值略微偏低，更加接近真实值，结果更加准确可靠；从结果还可看出相对偏差小，表明准确度高；本发明还缩短了反应时间，并使操作更加简便，适用于各种生化分析仪器。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。