作为有效HDAC抑制剂的携带内酰胺的新硫代衍生物和它们作为药物的用途

摘要

本发明涉及新颖的式(I)的酰胺化合物和它们作为抗肿瘤剂和促细胞凋亡剂的用途。本发明包括这样的化合物在医学中的用途和含有这样的化合物的药物组合物，所述医学涉及癌症疾病以及其中HDAC的抑制是应答性的其它疾病。

说明书

技术领域

本发明涉及新颖的硫代化合物和它们作为药物的用途。本发明包括 这样的化合物和含有这样的化合物的药物组合物在医学中的用途，所述 医学涉及癌症疾病、炎性疾病、神经元疾病、寄生虫感染(例如，疟原 虫属感染)、以及其中HDAC的抑制是应答性的其它疾病。

背景技术

组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)是在包括细菌、真菌、植物和动物在内的众 多生物体中发现的酶家族。这样的酶催化从不同蛋白底物的ε-N-乙酰化的赖 氨酸残基除去乙酰基，所述蛋白底物包括组蛋白、转录因子、α-微管蛋白和 核转运蛋白。

迄今为止已经表征了18种HDAC异形体。关于它们的DNA序列相似 性和它们在细胞内的生物学作用，将它们分类成4个不同的家族。

HDAC1、HDAC2、HDAC8和HDAC3是I类的成员。前3种异形体主 要存在于细胞核中；同时，HDAC3也存在于细胞质中或是膜结合的。

HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC9和HDAC10形成II类。 该类已经进一步分成2个子类：IIa类(HDAC4、5、7和9)和IIb类(HDAC6 和10)。II类酶在有限数目的细胞类型中表达，且在细胞核和细胞质之间穿 梭(即，IIa类)，或者主要是在细胞质中(即，IIb类)(Yang X.J.,等人,Mol.Cell. Biol.,2005,25,2873)。

IV类仅包含一个成员(HDAC11)，同时III类（也称为抗衰老酶）由NAD⁺依赖性的酶组成。I、II和IV类酶的共同特征在于它们的锌依赖性的性质。 已经证实HDAC抑制剂(HDACi)为转化的细胞体外和体内的生长停止、分 化和细胞凋亡性细胞死亡的有效诱导物。

还证实了HDAC抑制会导致自身免疫疾病和炎性疾病模型中的炎症的 减轻(Leoni F.,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,2002,99,2995)。

已经记载为HDACi的首要化合物之一是众所周知的抗癫痫的丙戊酸， 其抑制I、II和IV类的所有异形体。认识到该家族的酶在癌症发展中的重要 作用以后，众多研究组以及制药公司进行了许多目的在于发现有效HDACi 的努力。

最初被称作SAHA(辛二酰苯胺异羟肟酸)的伏林司他是在2006年被 FDA批准用于治疗患者的罕见癌症（皮肤T-细胞淋巴瘤）的第一类小分子 异羟肟酸盐衍生物HDACi，所述患者已经接受至少一种先前的全身性治疗 (Grant S.,等人,Nature Rev.Drug Discov.,2007,6,21)。SAHA是一种抑制I 和II类的有效HDACi，成为目前处于临床试验中的绝大部分的HDACi(Paris  M.,等人,J.Med.Chem.,2008,51,1505)。

实际上，根据它们的结构，可以将不同家族的抑制剂分组为4个主族：

a)短链脂肪酸(例如，丁酸钠、苯基丁酸盐、pivanex(丁酸新戊酰氧基 甲酯、AN-9)和丙戊酸)；

b)异羟肟酸盐(例如，SAHA、贝林司他(PXD101)、帕比司他(LBH589)、 达西司他(LAQ-824)和曲古抑菌素)；

c)环状衍生物(例如，罗米地新或FK-228)；

d)苯甲酰胺(例如，恩替司他(MS-275)、莫西司他(MGCD-0103)和乙酰 基地那林(CI-994))。

已经进行了一些涉及联合治疗的临床试验，以评估与标准化学治疗剂 (例如，多西他赛和伏林司他)组合的广谱HDACi在具有晚期和复发的肺癌、 膀胱癌或前列腺癌的患者中的效力(临床试验NCT00565227)。约13年前， 已经将HDAC假定为治疗寄生虫感染(例如，疟原虫属感染)的潜在靶标。如 果得自科学共同体的大多数努力已经致力于选择性的HDACi的鉴别，仍然 存在对pan抑制剂的大量医学需求，因为已经证实，不同的癌症疾病不会涉 及相同的HDAC异形体。此外，关于特定HDAC异形体向特定癌症的评估， 科学共同体也分裂(Giannini G.,等人,Future Medicinal Chemistry,2012,4, 11,1439-1460)。实际上，HDAC1在前列腺癌(Halkidou K.,等人,Prostate, 2004,59,177)和胃癌(Choi J.H.,等人,Jpn.J.Cancer Res.,2001,92,1300)中 被增量调节，HDAC2在胃癌中被增量调节(Song J.,等人,APMIS,2005,113, 264)，HDAC3在肺癌中被增量调节(Bartling B.,等人,Lung Cancer,2005,49, 145)，在口腔鳞状细胞癌中存在升高的HDAC6表达(Sakuma T.,等人,J. Oncol.,2006,29,117)。

还已经记载了HDAC在其它疾病诸如神经变性疾病(Chuang D.M.,等人, Trends in Neuroscience,2009,32,11,591;Sleiman S.F.,等人,Expert Opin. Investig.Drugs,2009,18,5,573)、心脏肥大(Hamamori Y.,等人,J.Clin. Invest.,2003,112,6,824)中的涉及。一篇新近的综述详述了将HDAC抑制视 作它的新方案的疾病(Dinarello C.A.,等人,Mol.Med.,2011,17,333)。

二齿异羟肟酸部分被公认为最好的锌结合基团之一，并且已经开发了许 多携带这样的部分的HDAC抑制剂(Sampath-Kumar A.,等人,Bioorg.Med. Chem.Lett.,2005,15,8,1969)。但是，这样的官能团也已经与差药代动力学 性能(Colletti S.,等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.,2001,11,107)以及与持久的 毒性(Suzuki T.,Cur.Med.Chem.,2005,12,24,2867)相关。因此，已经做出大 量努力来鉴别新的HDACi，所述HDACi可以表现出对生物靶标的高结合亲 和力以及有效细胞活性。

最近公开的一篇综述(Bertrand P.,Eur.J.Med.Chem.,2010,45,2095)评 估了不同的基于非异羟肟酸盐的衍生物的结合亲和力和生物学特性，其中公 开了硫代加合物，从而假定后者可能在蛋白的活性部位内具有完全不同于异 羟肟酸盐类似物之一的取向。

如果已经研究了含有直链硫结合基团的HDACi，但是这样的衍生物到 目前为止尚未进入临床试验。

Bertrand P.也提议，FK228生物活性是由于产生硫代加成化合物1的二 硫键还原，所述硫代加成化合物1是在下面的路线图1中描绘的活性实体。

但是，在US12/845658之前可以质疑FK228的这种作用机理，其假定 另一种代谢物是活性物质。不幸的是，由于没有显示不同的理论化的代谢物 的生物活性，从该工作中不能收集清楚的教导。

已经合成了SAHA的直链硫代类似物(路线图2)(Suzuki T.,等人,Bioorg. Med.Chem.Lett.,2004,14,3313)，且两种化合物表现出类似的HDAC亲和 力。

Suzuki T.,等人进一步公开了更有效的含硫金属结合基团(MBG) HDACi，其携带空间上更受阻的酰胺部分诸如联苯基、苯并呋喃、吲哚或喹 啉，而不是SAHA的苯基(Suzuki T.,等人,J.Med.Chem.,2005,48,1019)。

JP2007238452公开了式2的衍生物，其中相对于羰基酰胺在位置α处的 碳原子被氨基甲酸酯部分取代(即，R²=CO₂R)。

以后还公开了这样的衍生物，报道了CAP基团(Suzuki T.,等人,J.Med. Chem.,2006,49,4809)和/或间隔物(Itoh Y.,等人,J.Med.Chem.,2007,50, 5425)的优化。令人感兴趣的是，这样的衍生物被公开为HDAC6选择性的。 具体地，Itoh Y.公开了携带相对于羰基酰胺在位置α处的中等大小的氨基 取代基的衍生物，其已经被发现是HDAC6选择性的，据推测是因为容纳这 样的基团的疏水袋在其它异形体中的缺失。

还普遍公认，硫代衍生物比它们的异羟肟酸盐相应物的活性低1个Log 单位(Wang D.,等人,J.Org.Chem.,2007,72,5446)。

SAHA已经在局灶性脑缺血模型中表现出有益效果(Faraco G.,等人, Mol.Pharmacol.,2006,70,6,1876)。

因此，在提供新HDAC抑制剂方面仍然存在巨大需求，所述HDAC抑 制剂呈现出对HDAC蛋白的低纳摩尔结合亲和力以及有效细胞活性。

发明内容

现在已经发现，新的硫代衍生物对HDAC具有有效抑制活性。

本发明提供了用于制备抑制HDAC活性的组合物的式(I)的化合物或其 盐、水合物或溶剂合物、它们的互变异构体、它们的几何异构体、它们的光 学活性形式诸如对映异构体、非对映异构体和它们的外消旋体形式、以及它 们的药学上可接受的盐：

其中，

R¹是H、(C₁-C₆)-烷基或芳基；或作为另外一种选择

在n是2或3的情况下，R¹和一个R⁴（各自连接至2个邻近碳原子） 一起形成环丙烷环；

R²是任选地被卤素、苄氧基、(C₁-C₃)-烷基或CF₃取代的苯基；(C₃-C₆)- 环烷基；芳基-(C₁-C₆)-烷基，其中所述芳基任选地被苄氧基、(C₁-C₃)-烷基或 CF₃取代；

R³是H、PO(OH)₂或式(II)的基团

-(CO)-R⁷   式II

R⁷是(C₁-C₇)-烷基、(C₁-C₆)-烷氧基或-CH(NH₂)R⁸；

R⁸是H或天然_α-氨基酸的侧链；

R⁴和R⁵在任意出现时独立地是H、卤素、(C₁-C₆)-烷基，或作为另外一 种选择，

当n是2或3时，一个R⁴和一个R⁵（各自连接至2个邻近碳原子）一 起形成环丙烷环；

R⁶是H，或作为另外一种选择，

R²和R⁶一起形成5-6元杂环，所述杂环可以任选地与芳基部分稠合；

-A-E-是-(CO)-(NR⁹)-或-(NR⁹)-(CO)-；

R⁹是H或(C₁-C₃)-烷基；

m是被包含在0-3之间的整数；

n是被包含在0-3之间的整数，前提条件是，当是2或3时，R⁴和R⁵中的每一个在每次出现时可以采取不同的含义；

符号是指，携带所述符号的碳原子可以采取R或S构型；

符号可以不存在，但是如果存在的话，它是指，所述环可以是部分 不饱和的，前提条件是，当携带R⁴的碳原子参与双键时，R⁵不存在。

本发明的一个实施方案是，用作药物的式(I)的化合物。

在另一个实施方案中，所述药物被用于治疗受癌症疾病、炎性疾病、神 经元疾病和寄生虫感染(例如，疟原虫属感染)影响的受试者。

此外，本发明提供了一种用于制备式(I)的化合物的方法，所述方法包括 下述的常规合成方法。

可以如下得到通式(I)的化合物：在极性非质子溶剂中，在有肽偶联领域 的技术人员众所周知的偶联剂存在下，使式(III)的化合物

其中R²、R³和R⁶和m如上所述，

与式(IV)的化合物或它们的有机盐反应，

其中R¹、R⁴和R⁵、-A-E-和n如上所述。

通过使式(I)的化合物（其中R³是如上定义的式(II)的基团，所有其它取 代基和参数如上定义）与氢氧化钠在极性溶剂中反应，可以得到通式(I)的化 合物（其中R3是H）。作为另外一种选择，通过在上述反应中用硫代甲醇钠 替代氢氧化钠，使用描述的操作，可以得到这样的化合物(Wallace O.B.,等 人,Tetrahedron Letters,1998,39,2693)。

可以如下得到通式(III)的化合物：在有自由基引发剂诸如AIBN存在下， 在极性溶剂中，在至多80℃的温度，使式(V)的化合物，

其中R²和R⁶和m如上所述，且其中PG表示氨基保护基，例如，叔丁 氧基羰基，

与式(VI)的化合物反应，

R³SH   式VI

其中R³如上所述。

在所有所述的转化中，根据有机化学中描述的(例如，Greene T.W.和 P.G.M.Wuts“Protective Groups in Organic Synthesis”,J.Wiley&Sons,Inc., 第3版,1999)和本领域技术人员众所周知的非常确定的操作，可以将任意 干扰性反应基团保护，然后去保护。所有所述的转化仅仅是有机化学中描述 的(例如，March J.,“Advanced Organic Chemistry”,J.Wiley&Sons,Inc.,第4 版,1992)和本领域技术人员众所周知的非常确定的操作的例子。

单独的或被包含在更复杂的结构中的术语“(C₁-C_x)-烷基”、“(C₁-C_x)-烷氧 基”和“(C₃-C_x)-环烷基”，其中x是被包含在2-7之间的整数(就环烷基而言， 被包含在4-7之间的整数)，表示具有1-7个碳原子的直链或支链烷基、直链 或支链烷氧基，或具有3-7个碳原子的环烷基。

术语“杂环烷基”和“杂环”表示饱和的或部分不饱和的(但不是芳族的)4、 5、6或7元环，所述环含有至少一个氮原子和任选的一个或多个选自氮、氧 和硫的其它杂原子，所述杂原子可以是相同的或不同的，且所述环可以被氨 基或烷基部分取代。优选的杂环烷基包括氮杂环丁烷、吡咯烷、哌啶、哌嗪、 酮哌嗪、2,5-二酮哌嗪、吗啉和硫代吗啉。6元杂环烷基可以任选地与如下 定义的芳基稠合。优选的这样的稠合的杂环是例如四氢喹啉和四氢异喹啉。

术语“芳基”表示具有单个环(例如，苯基)或多个环的6-14个碳原子的芳 族碳环基团，所述环可以以单键延伸的方式连接或者可以稠合。优选的芳基 包括苯基、萘基、菲基、联苯基等。所述“芳基”可以具有1-3个选自以下的 取代基：羟基、卤素、卤代烷基、氰基、(C₁-C_x)-烷基、(C₁-C_x)-烷氧基、苄 氧基、氨基、氨基烷基或烷基氨基。

术语“氨基”表示基团-NH₂。

术语“烷基氨基”表示基团–NHR，其中R是如上定义的“(C₁-C_x)-烷基”。

术语“氨基烷基”表示如上定义的(C₁-C_x)-烷基，其被氨基取代。

术语“卤代烷基”表示CF₃或CHF₂部分，或表示如前定义的含有CF₃或 CHF₂部分的烷基。

术语“芳基-(C₁-C₆)-烷基”表示如上定义的烷基，其具有一个如上定义的 芳基取代基。优选的芳基-(C₁-C₆)-烷基包括苄基、苯乙基、二苯基甲基等。

表述“天然的α-氨基酸”表示处于所有可能的异构形式的20种天然氨基 酸，且由甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬氨 酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、赖氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、 脯氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、色氨酸、精氨酸和酪氨酸组成。

术语癌症是指这样的恶性肿瘤：其侵入和破坏周围组织，且可能形成转 移灶，并最终可以杀死宿主。

“药学上可接受的盐”表示下面鉴别出的式(I)的化合物的盐，其保留希望 的生物活性。这样的盐的例子包括，但不限于：与无机酸(例如盐酸、氢溴 酸、硫酸、磷酸、硝酸等)形成的酸加成盐，和与有机酸形成的盐，所述有 机酸例如醋酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、苹果酸、富马酸、马来酸、抗坏血 酸、苯甲酸、鞣酸、双羟萘酸、海藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、甲苯磺酸、萘 二磺酸、甲磺酸和聚-半乳糖醛酸。

我们已经发现，根据本发明制备的衍生物(I)和它们的药学上可接受的盐 是有用的药剂，其可用于治疗由HDAC介导的疾病状态、障碍和病理学状 况；尤其是用于治疗癌症疾病、炎性疾病、神经元疾病和寄生虫感染(例如， 疟原虫属感染)。

所述药物组合物含有至少一种式(I)化合物作为活性成分，例如以会产生 显著的治疗效果的量。本发明所涵盖的组合物是完全常规的，且可通过制药 工业常用的方法得到，例如，在下述文献中例证的那些：Remington's  Pharmaceutical Science Handbook,Mack Pub.N.Y.–最新版。根据选择的给药 途径，所述组合物将是适合口服、胃肠外或局部给药的固体或液体形式。根 据本发明的组合物含有活性成分以及至少一种药学上可接受的媒介物或赋 形剂。这些可以是特别有用的制剂辅佐剂，例如增溶剂、分散剂、助悬剂和 乳化剂。

通常，以“治疗有效量”施用本发明的化合物。实际施用的化合物的量通 常由医师考虑相关的情况来确定，所述情况包括：待治疗的病症、选择的给 药途径、施用的实际化合物、药物组合、单个患者的年龄、体重、应答、患 者的征状的严重程度等。对于任意化合物，在细胞培养试验中或在动物模型 （通常是小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗或猪）中，可以初步估计治疗有效剂量。 动物模型也可以用于确定适当的浓度范围和给药途径。然后可以使用这样的 信息来确定在人类中有用的剂量和给药途径。在计算人等效剂量(HED)时， 推荐使用在工业和评论者指南（Guidance for Industry and Reviewers）文件 (2002,美国食品和药品管理局,Rockville,Maryland,USA)中提供的换算表。

通常，有效剂量是0.01mg/kg至100mg/kg，优选地0.05mg/kg至50 mg/kg。对于任意化合物，在细胞培养试验中或在动物模型（通常是小鼠、 大鼠、豚鼠、兔、狗或猪）中，可以初步估计治疗有效剂量。对于人受试者 而言精确的有效剂量取决于：疾病状态的严重性、受试者的一般健康、受试 者的年龄、体重和性别、饮食、给药时间和频率、药物组合、反应敏感性和 对治疗的耐受性/应答。该量可以通过例行试验来确定，且是在临床医师的判 断内。

所述组合物可以单独地施用给患者，或可以与其它药剂、药物或激素联 合施用。

所述药剂也可以含有药学上可接受的载体，用于施用所述治疗剂。这样 的载体包括抗体和其它多肽、基因和其它治疗剂诸如脂质体，前提条件是， 所述载体不会诱导对接受所述组合物的个体有害的抗体的生成，且可以没有 不适当的毒性地施用。

合适的载体可以是大的、缓慢代谢的大分子（诸如蛋白、多糖、聚乳酸、 聚乙醇酸、聚合的氨基酸、氨基酸共聚物）和无活性的病毒颗粒。

在Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.,N.J.1991)中，可 以得到药学上可接受的载体的彻底讨论。

在治疗组合物中的药学上可接受的载体可以另外含有液体，诸如水、盐 水、甘油和乙醇。

另外，辅助物质（诸如润湿剂或乳化剂）、pH缓冲物质等可以存在于 这样的组合物中。这样的载体使药物组合物能配制为片剂、丸剂、糖衣丸、 胶囊、液体、凝胶、糖浆剂、软膏、混悬液等，用于患者摄入。

配制后，本发明的组合物可以直接地施用给受试者。要治疗的受试者可 以是动物；具体地，可以治疗人受试者。

本发明的药剂可以通过任意数目的途径施用，所述途径包括，但不限于： 口服、静脉内的、肌肉内的、动脉内的、骨髓内的、鞘内的、心室内的、透 皮的或经皮的给药、皮下的、腹膜内的、鼻内的、肠内的、局部的、舌下的、 阴道内的或直肠的方式。

用于口服给药的组合物可以是大量液体溶液或混悬液或整装散剂。但 是，更常见地，所述组合物存在于单位剂型中，以便于准确地定量给药。术 语“单位剂型”表示物理上离散的单位，其适合作为用于人受试者和其它哺乳 动物的单元剂量，每个单位含有经计算会产生希望的治疗效果的预定量的活 性物质，以及合适的药物赋形剂。典型的单位剂型包括再填充的、预测量的 安瓿或注射器（在液体组合物的情况下），或者丸剂、片剂、胶囊等（在固 体组合物的情况下）。在这样的组合物中，本发明化合物通常是小量组分(约 0.1至约50重量%或优选约1至约40重量%)，余量为对于形成希望的定量 给药形式而言有帮助的各种媒介物或载体和加工助剂。剂量方案可以是单次 给药方案或多次给药方案。

如上公开的，由于它们的HDAC抑制性能，本发明的化合物可用作用 于治疗障碍的药物，在所述障碍中，这样的抑制会导致改善患者的健康。具 体地，患者遭受癌症和炎性疾病。

目标组合物可以与式(I)的化合物一起含有其它已知的活性物质。

本发明的另一个目的是，一种制备药物组合物的方法，其特征在于，混 合一种或多种式(I)的化合物和合适的赋形剂、稳定剂和/或药学上可接受的稀 释剂。

本发明的一个实施方案是，前面描述的式(I)的化合物，其中n是1或2。

本发明的一个优选实施方案是，前面描述的式(I)的化合物，其中R³是 如上所述的式(II)的基团。

根据本发明的另一个实施方案，要治疗的癌症是选自以下的原发性肿 瘤：肉瘤、癌、黑素瘤、骨肿瘤、神经内分泌肿瘤、淋巴样白血病、髓样白 血病、单核细胞性白血病、巨核细胞白血病、急性前髓细胞白血病或霍奇金 病。

上述肉瘤和癌由以下组成：乳腺癌；肺癌，包括非小细胞肺癌(NSCLC) 和小细胞肺癌(SCLC)；胃肠癌，包括食道癌、胃癌、小肠癌、大肠癌、直肠 癌和结肠癌；神经胶质瘤，包括胶质母细胞瘤；卵巢癌；宫颈癌；子宫内膜 癌；间皮瘤；肾癌；前列腺癌；腹膜癌；胸膜癌；面颈癌；膀胱癌；脑癌； 和皮肤或眼的癌症。

所述肿瘤还可以表示儿科癌症。例如根据本发明可以治疗的或者可以延 迟病症进展的儿科癌症选自：急性成淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、 肾上腺皮质癌、星形细胞瘤、膀胱癌、脑干神经胶质瘤、中枢神经系统非典 型畸胎样/杆状癌、脑癌、中枢神经系统胚胎癌、脑癌、星形细胞瘤、颅咽管 瘤、室管膜母细胞瘤、室管膜瘤、儿童髓母细胞瘤、髓上皮瘤、中间分化的 松果体实质癌、幕上原始神经外胚层癌和松果体母细胞瘤、乳腺癌、支气管 癌、类癌癌症、宫颈癌、脊索瘤、结直肠癌、食道癌、颅外胚细胞癌、胃癌、 神经胶质瘤、肝细胞(肝)癌、霍奇金淋巴瘤、肾癌、喉头癌、白血病、急性 淋巴母细胞/髓样白血病、肝癌、非霍奇金淋巴瘤、髓母细胞瘤、间皮瘤、多 发性内分泌肿瘤综合征、鼻咽癌、口癌、卵巢癌、胰腺癌、乳头状瘤病、肾 细胞癌、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、皮肤癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺 癌和阴道癌。

本发明的另一个实施方案由选自以下的化合物组成：(S)-6-氧代-哌啶-2- 甲酸((S)-6-巯基-1-苯基氨甲酰基-己基)-酰胺、(S)-6-氧代-哌啶-2-甲酸((S)-1- 环戊基氨甲酰基-6-巯基-己基)-酰胺、(S)-6-氧代-哌啶-2-甲酸[(S)-1-(3-苄氧基 -苄基氨甲酰基)-6-巯基-己基]-酰胺、(S)-6-氧代-哌啶-2-甲酸[(S)-6-巯基-1-(4- 三氟甲基-苄基氨甲酰基)-己基]-酰胺、(S)-4-氧代-氮杂环丁烷-2-甲酸((S)-6- 巯基-1-苯基氨甲酰基-己基)-酰胺、(3S,4S)-2-氧代-4-苯基-吡咯烷-3-甲酸 ((S)-6-巯基-1-苯基氨甲酰基-己基)-酰胺、(3R,4R)-2-氧代-4-苯基-吡咯烷-3-甲 酸((S)-6-巯基-1-苯基氨甲酰基-己基)-酰胺、(3R,4S)-2-氧代-4-苯基-吡咯烷-3- 甲酸((S)-6-巯基-1-苯基氨甲酰基-己基)-酰胺、(3S,4R)-2-氧代-4-苯基-吡咯烷 -3-甲酸((S)-6-巯基-1-苯基氨甲酰基-己基)-酰胺、(S)-6-氧代-哌啶-2-甲酸 [(S)-1-(3,4-二氢-1H-异喹啉-2-羰基)-6-巯基-己基]-酰胺、(R)-5-氧代-吡咯烷-2- 甲酸((S)-6-巯基-1-苯基氨甲酰基-己基)-酰胺、(S)-6-氧代-哌啶-2-甲酸[(S)-6- 巯基-1-(2-间甲苯基-乙基氨甲酰基)-己基]-酰胺、(R)-2-氧代-哌啶-3-甲酸 ((S)-6-巯基-1-苯基氨甲酰基-己基)-酰胺、(S)-2-氧代-哌啶-3-甲酸((S)-6-巯基 -1-苯基氨甲酰基-己基)-酰胺、(R)-6-氧代-哌啶-2-甲酸((S)-6-巯基-1-苯基氨甲 酰基-己基)-酰胺、(S)-6-氧代-1,2,3,6-四氢-吡啶-2-甲酸((S)-6-巯基-1-苯基氨甲 酰基-己基)-酰胺、(S)-2-氧代-3-氮杂-二环[4.1.0]庚烷-4-甲酸((S)-6-巯基-1-苯 基氨甲酰基-己基)-酰胺、(S)-6-氧代-1,2,5,6-四氢-吡啶-2-甲酸((S)-6-巯基-1- 苯基氨甲酰基-己基)-酰胺、(S)-4-氧代-3-氮杂-二环[4.1.0]庚烷-2-甲酸((S)-6- 巯基-1-苯基氨甲酰基-己基)-酰胺、6-氧代-1,6-二氢-吡啶-2-甲酸((S)-6-巯基-1- 苯基氨甲酰基-己基)-酰胺、(S)-6-氧代-哌啶-2-甲酸((S)-5-巯基-1-苯基氨甲酰 基-戊基)-酰胺、(S)-6-氧代-哌啶-2-甲酸((S)-7-巯基-1-苯基氨甲酰基-庚基)-酰 胺、(S)-1-甲基-6-氧代-哌啶-2-甲酸((S)-6-巯基-1-苯基氨甲酰基-己基)-酰胺、 (S)-6-氧代-哌啶-2-甲酸((S)-6-巯基-1-间甲苯基氨甲酰基-己基)-酰胺,和(S)-6- 氧代-哌啶-2-甲酸((S)-6-巯基-1-对甲苯基氨甲酰基-己基)-酰胺和对应的前 药，其中R³如关于式(I)的化合物所述，但是不是H。

本发明的另一个实施方案由选自以下的化合物组成：硫代乙酸 S-{(S)-6-[((S)-4-氧代-氮杂环丁烷-2-羰基)-氨基]-6-苯基氨甲酰基-己基}酯、硫 代乙酸S-[(S)-6-[((S)-6-氧代-哌啶-2-羰基)-氨基]-6-(4-三氟甲基-苄基氨甲酰 基)-己基]酯、硫代乙酸S-{(S)-6-(3-苄氧基-苄基氨甲酰基)-6-[((S)-6-氧代-哌 啶-2-羰基)-氨基]-己基}酯、硫代乙酸S-{(S)-7-(3,4-二氢-1H-异喹啉-2-基)-7- 氧代-6-[((S)-6-氧代-哌啶-2-羰基)-氨基]-庚基}酯、硫代乙酸S-[(S)-6-[((S)-6- 氧代-哌啶-2-羰基)-氨基]-6-(2-间甲苯基-乙基氨甲酰基)-己基]酯、硫代乙酸 S-{(S)-6-[((R)-6-氧代-哌啶-2-羰基)-氨基]-6-苯基氨甲酰基-己基}酯、硫代乙 酸S-{(S)-6-[((S)-6-氧代-哌啶-2-羰基)-氨基]-6-苯基氨甲酰基-己基}酯、硫代 乙酸S-{(S)-6-[((S)-6-氧代-哌啶-2-羰基)-氨基]-6-对甲苯基氨甲酰基-己基} 酯、硫代乙酸S-{(S)-6-[((S)-6-氧代-哌啶-2-羰基)-氨基]-6-间甲苯基氨甲酰基- 己基}酯、硫代乙酸S-{(S)-6-[((S)-6-氧代-哌啶-2-羰基)-氨基]-6-环戊基氨甲 酰基-己基}酯、硫代乙酸S-{(S)-6-[((3R*,4S*)-2-氧代-4-苯基-吡咯烷-3-羰基)- 氨基]-6-苯基氨甲酰基-己基}酯、硫代乙酸S-{(S)-6-[((3R*,4R*)-2-氧代-4-苯 基-吡咯烷-3-羰基)-氨基]-6-苯基氨甲酰基-己基}酯、硫代乙酸 S-{(S)-6-[((R)-5-氧代-吡咯烷-2-羰基)-氨基]-6-苯基氨甲酰基-己基}酯、硫代 乙酸S-{(S)-6-[(R*)-(2-氧代-哌啶-3-羰基)-氨基]-6-苯基氨甲酰基-己基}酯、 (S)-6-氧代-哌啶-2-甲酸((S)-6-巯基-1-苯基氨甲酰基-己基)-酰胺、(S)-6-氧代- 哌啶-2-甲酸((S)-1-环戊基氨甲酰基-6-巯基-己基)-酰胺、(S)-6-氧代-哌啶-2-甲 酸[(S)-1-(3-苄氧基-苄基氨甲酰基)-6-巯基-己基]-酰胺、(S)-6-氧代-哌啶-2-甲 酸[(S)-6-巯基-1-(4-三氟甲基-苄基氨甲酰基)-己基]-酰胺、(S)-4-氧代-氮杂环 丁烷-2-甲酸((S)-6-巯基-1-苯基氨甲酰基-己基)-酰胺、(3S,4S)-2-氧代-4-苯基- 吡咯烷-3-甲酸((S)-6-巯基-1-苯基氨甲酰基-己基)-酰胺、(3R,4R)-2-氧代-4-苯 基-吡咯烷-3-甲酸((S)-6-巯基-1-苯基氨甲酰基-己基)-酰胺、(3R,4S)-2-氧代-4- 苯基-吡咯烷-3-甲酸((S)-6-巯基-1-苯基氨甲酰基-己基)-酰胺、(3S,4R)-2-氧代 -4-苯基-吡咯烷-3-甲酸((S)-6-巯基-1-苯基氨甲酰基-己基)-酰胺、(S)-6-氧代- 哌啶-2-甲酸[(S)-1-(3,4-二氢-1H-异喹啉-2-羰基)-6-巯基-己基]-酰胺、(R)-5-氧 代-吡咯烷-2-甲酸((S)-6-巯基-1-苯基氨甲酰基-己基)-酰胺、(S)-6-氧代-哌啶-2- 甲酸[(S)-6-巯基-1-(2-间甲苯基-乙基氨甲酰基)-己基]-酰胺、(R)-2-氧代-哌啶 -3-甲酸((S)-6-巯基-1-苯基氨甲酰基-己基)-酰胺、(S)-2-氧代-哌啶-3-甲酸 ((S)-6-巯基-1-苯基氨甲酰基-己基)-酰胺、(R)-6-氧代-哌啶-2-甲酸((S)-6-巯基 -1-苯基氨甲酰基-己基)-酰胺、硫代碳酸乙基酯{(S)-6-[((S)-6-氧代-哌啶-2-羰 基)-氨基]-6-苯基氨甲酰基-己基}酯、硫代异丁酸S-{(S)-6-[((S)-6-氧代-哌啶 -2-羰基)-氨基]-6-苯基氨甲酰基-己基}酯、硫代乙酸S-{(S)-6-[((S)-5-氧代-吡 咯烷-2-羰基)-氨基]-6-苯基氨甲酰基-己基}酯、硫代乙酸S-{(S)-6-[((S)-5-氧代 -吡咯烷-2-羰基)-氨基]-6-间甲苯基氨甲酰基-己基}酯、硫代乙酸 S-{(S)-6-[((R)-1-甲基-5-氧代-吡咯烷-2-羰基)-氨基]-6-苯基氨甲酰基-己基} 酯、硫代碳酸乙基酯{(S)-6-[((R)-5-氧代-吡咯烷-2-羰基)-氨基]-6-苯基氨甲酰 基-己基}酯、硫代乙酸S-{(S)-6-[((R)-5-氧代-吡咯烷-2-羰基)-氨基]-6-间甲苯 基氨甲酰基-己基}酯、硫代乙酸S-{(S)-6-[((R)-1-甲基-5-氧代-吡咯烷-2-羰基)- 氨基]-6-间甲苯基氨甲酰基-己基}酯、硫代乙酸S-[(S)-6-[((R)-5-氧代-吡咯烷 -2-羰基)-氨基]-6-(3-三氟甲基-苯基氨甲酰基)-己基]酯、硫代乙酸 S-{(S)-6-[((S)-1-甲基-6-氧代-哌啶-2-羰基)-氨基]-6-苯基氨甲酰基-己基}酯、 (S)-1-甲基-6-氧代-哌啶-2-甲酸((S)-6-巯基-1-苯基氨甲酰基-己基)-酰胺、 (S)-6-氧代-哌啶-2-甲酸((S)-6-巯基-1-间甲苯基氨甲酰基-己基)-酰胺、(S)-6- 氧代-哌啶-2-甲酸((S)-6-巯基-1-对甲苯基氨甲酰基-己基)-酰胺,和硫代乙酸 S-{(S)-6-[((S)-6-氧代-1,2,3,6-四氢-吡啶-2-羰基)-氨基]-6-苯基氨甲酰基-己基} 酯。

附图说明

图1：用实施例14的化合物处理以后，NCI-H460细胞的细胞质和细胞 核提取物的蛋白质印迹分析。

下述解释性实施例绝不是本发明意图保护的穷尽列表。

实施例

缩写：

AcOEt：乙酸乙酯

AIBN：偶氮二异丁腈

DCM：二氯甲烷

DIPEA：二异丙基乙胺

DMF：二甲基甲酰胺

EDCI：1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺

EtOH：乙醇

Et₂O：乙醚

HPLC：高效液相色谱法

IPA：异丙醇

MeOH：甲醇

NaHCO₃：碳酸氢钠

Na₂SO₄：硫酸钠

NEt₃：三乙胺

PyBOP：(苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲基氨基)-鏻六氟磷酸盐)

RT：室温

SAc：硫代乙酰基

TFA：三氟乙酸

TLC：薄层色谱法

一般评论：使用用于操作空气敏感的化合物的标准技术，在氩气正压下 从试剂和玻璃器皿排除水分，在火焰干燥的玻璃器皿中运行所有非水性反 应。通过穿过干燥柱(Solvent Delivery System)过滤，得到无水THF、甲苯、 Et₂O和DCM；将其它溶剂在使用之前在无水氩气正压下蒸馏，并通过标准 方法干燥。将商业级试剂不经进一步纯化地使用。用指定的溶剂系统，在 230-400目硅胶上进行快速色谱法。在预包被的、玻璃衬底的硅胶平板(Merck 60F₂₅₄)上进行薄层色谱法。如下进行显影：在短波长紫外线下，和/或通过将 平板浸入硫酸铈/钼酸铵、高锰酸钾或茴香醛乙醇溶液的H₂SO₄水溶液中， 随后用热枪炭化。作为另外一种选择，通过在碘显影室中将它暴露于碘蒸汽， 可以将TLC染色。使用电喷射(ES)技术，在AEI-MS902或MS-50波谱仪上 进行低和高分辨率质量分析。在300或500MHz在Gemini波谱仪(Varian) 上记录核磁共振波谱。使用电喷射(ES)技术，在Waters ZQ2000波谱仪上进 行质量分析。在LC-Waters仪器(HPLC Waters Alliance2695,ZQ2000MS和 PDA-UV检测器2996)上进行LCMS分析。

实施例1

硫代乙酸S-{(S)-6-[((S)-4-氧代-氮杂环丁烷-2-羰基)-氨基]-6-苯基氨甲酰基-己基}酯

A：苯胺，PyBOP，DIPEA，DMF和DCM，室温；B：AcSH，AIBN， 二噁烷，75℃；C：TFA，DCM，0℃至室温；

D：(S)-4-氧代-氮杂环丁烷-2-甲酸，PyBOP，NEt₃，DMF和DCM， 室温

路线图1

步骤A:((S)-1-苯基氨甲酰基-己-5-烯基)-氨基甲酸叔丁酯

将(S)-2-叔丁氧基羰基氨基-庚-6-烯酸(5.24mmol)、DIPEA(15.7mmol) 和苯胺(5.76mmol)在DCM(70ml)中的溶液在室温搅拌20分钟，然后加入 PyBOP(5.24mmol)和无水DMF(5ml)。将反应混合物在室温搅拌2小时。 在减压下除去溶剂，并将粗制的反应混合物用AcOEt稀释，用5%Na₂CO₃、 水洗涤，然后用5%柠檬酸水溶液洗涤，最后用盐水洗涤。在减压下除去溶 剂和在硅胶上纯化(正己烷/AcOEt:9/1)以后，得到期望的加合物。

收率：85%。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)：1.13(m,2H),1.14(s,9H),1.60(m,2H), 2.01(m,2H),4.05(m,1H),4.94(m,2H),5.77(m,1H),7.02(m,2H),7.29(t, 2H),7.59(d,2H),9.92(s,1H)。

ESIMS m/z341.2(M+Na)⁺。

步骤B:硫代乙酸S-((S)-6-叔丁氧基羰基氨基-6-苯基氨甲酰基-己基)酯

在75℃，向((S)-1-苯基氨甲酰基-己-5-烯基)-氨基甲酸叔丁酯(250mg, 0.78mmol)、硫代乙酸(564μl,7.8mmol)在脱气的二噁烷中的搅拌溶液中， 加入AIBN(129mg,0.78mmol)。将反应混合物搅拌1小时。将反应混合物 冷却至0℃，并在搅拌下加入过量的环己烯，将后者维持20分钟。将反应混 合物在减压下浓缩，并将得到的粗产物用己烷冲洗多次，得到期望的加合物。

收率：81%。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)：1.30(m,4H),1.36(s,9H),1.47(m,2H), 1.56(m,2H),2.29(s,3H),2.79(t,2H),4.02(m,1H),6.96(d,1H),7.02(t,1H), 7.28(t,2H),7.57(d,2H),9.89(s,1H)。

ESIMS m/z417.2(M+Na)⁺。

步骤C:硫代乙酸S-((S)-6-氨基-6-苯基氨甲酰基-己基)酯

在0℃，向硫代乙酸S-((S)-6-叔丁氧基羰基氨基-6-苯基氨甲酰基-己基) 酯在DCM中的搅拌溶液中，缓慢地加入TFA。然后将反应混合物温热至室 温，并搅拌过夜。在减压下除去溶剂，得到作为三氟乙酸盐的期望的加合物， 将其不经任何纯化用于下一步。

步骤D:硫代乙酸S-{(S)-6-[((S)-4-氧代-氮杂环丁烷-2-羰基)-氨基]-6-苯 基氨甲酰基-己基}酯

向在步骤C中得到的三氟乙酸盐(305mg,0.75mmol)在DCM(10ml)中 的溶液中，加入NEt₃(312μl,2.24mmol)、(S)-4-氧代-氮杂环丁烷-2-甲酸(90 mg,0.79mmol)、PyBOP(408mg,0.79mmol)和DMF(1.7ml)。将反应混合物 搅拌过夜，然后用AcOEt稀释，用水、5%Na₂CO₃水溶液、盐水、5%柠檬 酸溶液和再次用盐水洗涤。使用AcOEt作为洗脱液，通过硅胶上的色谱法纯 化粗制物质，得到作为白色固体的期望的加合物。

收率：42%

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)：1.31(m,4H),1.48(m,2H),1.64(m,2H), 2.29(s,3H),2.67(dt,1H),2.79(t,2H),3.09(dd,1H),4.06(dd,1H),4.42(m, 1H),7.03(t,1H),7.28(t,2H),7.57(d,2H),8.12(s,1H),8.38(d,1H),10.07(s, 1H)。

ESIMS m/z392.0(M+H)⁺;ESIMS m/z504.2(M+CF₃COO)^-。

按照在路线图1中描绘的操作，在步骤A中使用适当的胺和在步骤D 中使用足够的酸，合成实施例2-12。

实施例2

硫代乙酸S-[(S)-6-[((S)-6-氧代-哌啶-2-羰基)-氨基]-6-(4-三氟甲基-苄基氨甲酰基)-己基]酯

收率：51%。

¹H NMR(500MHz,CD₂Cl₂)：1.39(m,4H),1.56(m,2H),1.64-1.94(m, 5H),2.05(m,1H),2.24(m,2H),2.32(s,3H),2.84(t,2H),4.00(m,1H),4.46(m, 3H),7.21(m,1H),7.32-7.47(m,4H),7.60(m,2H)。

ESIMS m/z502.09(M+H)⁺。

实施例3

硫代乙酸S-{(S)-6-(3-苄氧基-苄基氨甲酰基)-6-[((S)-6-氧代-哌啶-2-羰基)-氨基]-己基}酯

收率：44%。

¹H NMR(500MHz,CD₂Cl₂)：1.25-1.48(m,4H),1.56(m,2H),1.62-1.97 (m,5H),2.01(m,1H),2.23(m,2H),2.30(s,3H),2.83(t,2H),3.98(m,1H), 4.36(m,2H),4.46(m,1H),5.06(m,2H),6.82-6.92(m,3H),7.02(m,1H),7.25 (t,1H),7.32-7.50(m,5H)。

ESIMS m/z540.17(M+H)⁺。

实施例4

硫代乙酸S-{(S)-7-(3,4-二氢-1H-异喹啉-2-基)-7-氧代-6-[((S)-6-氧代-哌啶-2-羰基)-氨基]-庚基}酯

收率：28%。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)：1.15-1.85(m,13H),2.11(m,2H),2.29(s, 3H),2.79(m,3H),3.69(m,2H),3.91(m,1H),4.45-4.90(m,3H),7.16(s,4H) 7.47(m,1H),8.10(m,1H)。

ESIMS m/z460.14(M+H)⁺。

实施例5

硫代乙酸S-[(S)-6-[((S)-6-氧代-哌啶-2-羰基)-氨基]-6-(2-间甲苯基-乙基氨甲酰基)-己基]酯

收率：27%。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)：1.06-1.32(m,4H),1.36-1.76(m,7H), 1.76-1.88(m,1H),2.10(t,2H),2.26(s,3H),2.30(s,3H),2.65(t,2H),2.78(t, 2H),3.21(m,2H),3.89(m,1H),4.16(m,1H),6.93-7.03(m,2H),7.14(m,1H), 7.50(d,1H),7.86-8.00(m,3H)。

ESIMS m/z462.11(M+H)⁺。

实施例6

硫代乙酸S-{(S)-6-[((R)-1-甲基-5-氧代-吡咯烷-2-羰基)-氨基]-6-间甲苯基氨甲酰基-己基}酯

收率：37%。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)：1.31(m,4H),1.48(m,2H),1.63(m,2H), 1.80(m,1H),2.17(m,3H),2.25(s,3H),2.28(s,3H),2.58(s,3H),2.80(t,2H), 4.13(m,1H),4.37(m,1H),6.85(d,1H),7.16(t,1H),7.36(d,1H),7.40(s,1H), 8.47(d,1H),9.99(s,1H)。

ESIMS m/z433.4(M+H)⁺;546.5(M+CF₃COO)^-。

实施例7

硫代乙酸S-{(S)-6-[((S)-5-氧代-吡咯烷-2-羰基)-氨基]-6-间甲苯基氨甲酰基-己基}酯

收率：53%。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)：1.33(m,4H),1.50(m,2H),1.65(m,2H), 1.88(m,1H),2.11(m,2H),2.25(m,1H),2.27(s,3H),2.31(s,3H),2.81(t,2H), 4.10(m,1H),4.38(m,1H),6.87(d,1H),7.18(t,1H),7.37(d,1H),7.42(s,1H), 7.79(s,1H),8.19(d,1H),9.96(s,1H)。

ESIMS m/z420.3(M+H)⁺。

实施例8

硫代乙酸S-{(S)-6-[((R)-5-氧代-吡咯烷-2-羰基)-氨基]-6-间甲苯基氨甲酰基-己基}酯

收率：43%。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)：1.30(m,4H),1.48(m,2H),1.64(m,2H), 1.84(m,1H),2.10(m,2H),2.25(m,1H),2.25(s,3H),2.28(s,3H),2.79(t,2H), 4.09(m,1H),4.39(m,1H),6.85(d,1H),7.16(t,1H),7.36(d,1H),7.40(s,1H), 7.80(s,1H),8.15(d,1H),9.96(s,1H)。

ESIMS m/z420.3(M+H)⁺。

实施例9

硫代乙酸S-{(S)-6-[((R)-1-甲基-5-氧代-吡咯烷-2-羰基)-氨基]-6-苯基氨甲酰基-己基}酯

收率：36%。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)：1.34(m,4H),1.51(m,2H),1.66(m,2H), 1.82(m,1H),2.22(m,3H),2.31(s,3H),2.61(s,3H),2.82(t,2H),4.14(m,1H), 4.42(m,1H),7.07(t,1H),7.32(t,2H),7.60(d,2H),8.47(d,1H),10.10(s,1H)。

ESIMS m/z420.3(M+H)⁺。

实施例10

硫代乙酸S-{(S)-6-[((S)-6-氧代-1,2,3,6-四氢-吡啶-2-羰基)-氨基]-6-苯基氨甲酰基-己基}酯

收率：64%。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)：1.28(m,4H),1.45(m,2H),1.65(m,2H), 2.28(s,3H),2.55(m,2H),2.78(t,2H),4.08(m,1H),4.38(m,1H),5.66(m,1H), 6.50(m,1H),7.03(t,1H),7.28(t,2H),7.47(m,1H),7.56(d,2H),8.02(d,1H), 10.10(s,1H)。

ESIMS m/z440.1(M+Na)⁺。

实施例11

硫代乙酸S-{(S)-6-[((S)-5-氧代-吡咯烷-2-羰基)-氨基]-6-苯基氨甲酰基-己基}酯

收率：25%。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)：1.32(m,4H),1.48(m,2H),1.63(m,2H), 1.87(m,1H),2.08(m,2H),2.22(m,2H),2.30(s,3H),2.79(t,2H),4.09(m,1H), 4.38(m,1H),7.03(t,1H),7.28(t,2H),7.58(d,1H),7.78(s,1H),8.20(d,1H), 10.03(s,1H)。

ESIMS m/z406.4(M+H)⁺。

实施例12

硫代乙酸S-{(S)-6-[((S)-1-甲基-6-氧代-哌啶-2-羰基)-氨基]-6-苯基氨甲酰基-己基}酯

收率：68%。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)：1.32(m,4H),1.48(m,2H),1.58(m,2H), 1.68(m,2H),1.86(m,2H),2.17(m,2H),2.29(s,3H),2.68(s,3H),2.79(t,2H), 4.07(m,1H),4.43(m,1H),7.03(t,1H),7.28(t,2H),7.58(d,2H),8.35(d,1H), 10.07(s,1H)。

ESIMS m/z433.9(M+H)⁺。

实施例13

硫代乙酸S-{(S)-6-[((R)-6-氧代-哌啶-2-羰基)-氨基]-6-苯基氨甲酰基-己基}酯

A：苯胺，PyBOP，DIPEA，DMF和DCM，室温；B：TFA，DCM，0℃ 至室温；

C：(R)-6-氧代-哌啶-2-甲酸PyBOP，NEt₃，DMF和DCM，室温；

D：AcSH，AIBN，二噁烷，75℃；

路线图2

步骤A:((S)-1-苯基氨甲酰基-己-5-烯基)-氨基甲酸叔丁酯

按照在实施例1中描述的步骤A，得到化合物。

步骤B：(S)-2-氨基-庚-6-烯酸苯基酰胺

在0℃，向((S)-1-苯基氨甲酰基-己-5-烯基)-氨基甲酸叔丁酯(即，实施例 1,步骤A)的搅拌溶液中，缓慢地加入TFA。然后将反应混合物温热至室温， 并搅拌2小时。在减压下除去溶剂，定量地得到作为三氟乙酸盐的期望的加 合物，将其不经任何纯化用于下一步。

步骤C:(R)-6-氧代-哌啶-2-甲酸((S)-1-苯基氨甲酰基-己-5-烯基)-酰胺

在有NEt₃(2.25mmol)存在下，使在步骤A中得到的三氟乙酸盐在 DCM/DMF(10ml,10/2)中的溶液与(R)-6-氧代-哌啶-2-甲酸(0.79mmol)和 PyBOP(0.79mmol)反应2小时。将反应混合物用DCM稀释，并用5% Na₂CO₃、盐水、5%柠檬酸和盐水洗涤。有机相经Na₂SO₄干燥、过滤并在 减压下浓缩。使用AcOEt/MeOH(9/1)作为洗脱液，通过硅胶上的色谱法纯化 粗制的反应混合物，得到作为白色固体的期望的加合物。

收率：85%

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)：1.38(m,2H),1.65(m,5H),1.86(m,1H), 2.03(m,2H),2.11(t,2H),3.96(m,1H),4.44(m,1H),4.96(m,2H),5.77(m, 1H),7.04(t,1H),7.29(t,2H),7.47(d,1H),7.57(d,2H),8.13(d,1H),10.03(s, 1H)。

ESIMS m/z366.3(M+Na)⁺;342.2(M-H)^-。

步骤D:硫代乙酸S-{(S)-6-[((R)-6-氧代-哌啶-2-羰基)-氨基]-6-苯基氨甲 酰基-己基}酯

在75℃，向(R)-6-氧代-哌啶-2-甲酸((S)-1-苯基氨甲酰基-己-5-烯基)-酰胺 (220mg,0.64mmol)、硫代乙酸(460μl,6.4mmol)在脱气的二噁烷(7ml)中的 搅拌溶液中，加入AIBN(105mg,0.64mmol)。搅拌反应混合物，直到通过 TLC分析监测到起始原料的完全转化。将反应混合物冷却至0℃，并在搅拌 下用过量的环己烯淬灭，将后者维持20分钟。在减压下浓缩，并使用己烷 /DCM/IPA:50/40/10作为洗脱液，通过硅胶上的色谱法纯化，得到期望的加 合物。

收率：53%。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)：1.30(m,4H),1.47(m,2H),1.64(m,5H), 1.86(m,1H),2.11(t,2H),2.29(s,3H),2.79(t,2H),3.95(m,1H),4.41(m,1H), 7.03(t,1H),7.29(t,2H),7.48(d,1H),7.57(d,2H),8.14(d,1H),10.05(s,1H)。

ESIMS m/z420.1(M+H)⁺;532.2(M+CF₃COO)⁺。

按照在路线图2中描绘的操作，在步骤A中使用适当的胺和在步骤C 中使用足够的酸，合成实施例14-18。

实施例14

硫代乙酸S-{(S)-6-[((S)-6-氧代-哌啶-2-羰基)-氨基]-6-苯基氨甲酰基-己基}酯

收率：87%。

¹H NMR(200MHz CDCl₃)：1.31(m,4H),1.47(m,2H),1.64(m,5H),1.84 (m,1H),2.09(t,2H),2.29(s,3H),2.79(t,2H),3.95(m,1H),4.37(m,1H),7.03 (t,1H),7.28(t,2H),7.47(d,1H),7.57(d,2H),8.08(d,1H),9.97(s,1H)。

ESIMS m/z420.0(M+H)⁺;532.2(M+CF₃COO)^-。

实施例15

硫代乙酸S-{(S)-6-[((S)-6-氧代-哌啶-2-羰基)-氨基]-6-对甲苯基氨甲酰基-己基}酯

收率：88%。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)：1.30(m,2H),1.47(m,2H),1.64(m,5H), 1.84(m,1H),2.10(t,2H),2.23(s,3H),2.29(s,3H),2.79(t,2H),3.94(m,1H), 4.37(m,1H),7.09(d,2H),7.45(d,2H),7.47(d,1H),8.06(d,1H),9.87(s,1H)。

ESIMS m/z456.6(M+H)⁺。

实施例16

硫代乙酸S-{(S)-6-[((S)-6-氧代-哌啶-2-羰基)-氨基]-6-间甲苯基氨甲酰基-己基}酯

收率：62%。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)：1.31(m,4H),1.47(m,2H),1.61(m,5H), 1.84(m,1H),2.10(t,2H),2.25(s,3H),2.29(s,3H),2.80(t,2H),3.95(m,1H), 4.36(m,1H),6.85(d,1H),7.16(t,1H),7.35(d,1H),7.40(s,1H),7.47(d,1H), 8.09(d,1H),9.90(s,1H)。

ESIMS m/z456.4(M+H)⁺。

实施例17

硫代乙酸S-{(S)-6-[((S)-6-氧代-哌啶-2-羰基)-氨基]-6-环戊基氨甲酰基-己基}酯

收率：51%。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)：1.05-1.90(m,20H),2.10(t,2H),2.30(s, 3H),2.80(t,2H),3.95(m,2H),4.20(m,1H),7.50(d,1H),7.80(s,1H),7.82 (s,1H)。

ESIMS m/z434.38(M+Na)⁺。

实施例18

硫代乙酸S-[(S)-6-[((R)-5-氧代-吡咯烷-2-羰基)-氨基]-6-(3-三氟甲基-苯基氨甲酰基)-己基]酯

收率：84%。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)：1.31(m,4H),1.48(m,2H),1.66(m,2H), 1.84(m,1H),2.28(s,3H),2.25(m,1H),2.10(m,2H),2.79(t,2H),4.09(m,1H), 4.37(m,1H),7.39(d,1H),7.54(t,1H),7.77(d,1H),7.80(s,1H),8.08(s,1H), 8.26(d,1H),10.43(s,1H)。

¹⁹F NMR(282MHz,DMSO-d₆)：-62.97

ESIMS m/z474.3(M+H)⁺;586.3(M+CF₃COO)^-。

实施例19

硫代乙酸S-{(S)-6-[((3R*,4S*)-2-氧代-4-苯基-吡咯烷-3-羰基)-氨基]-6-苯基氨甲酰基-己基}酯

A：PhNH₂，EDCI，HOBT，室温；B：KSAc，EtOH，室温；C：TFA， DCM，室温；D：(3R*，4S*)-2-氧代-苯基-吡咯烷-3-甲酸，PyBOP，DIPEA， 室温；E：NaOH，EtOH，室温

路线图3

步骤A:((S)-6-溴-1-苯基氨甲酰基-己基)-氨基甲酸叔丁酯

将EDCI(2.10g,11.1mmol)和苯胺(0.68ml,7.5mmol)加入7.4mmol的 (S)-7-溴-2-叔丁氧基羰基氨基-庚酸(Gupta P.K.,等人,Bioorg.Med.Chem. Lett.,2010,20,23,7067)在THF(70ml)中的溶液中，并将反应混合物在室温 搅拌过夜。在减压下除去溶剂，并将粗制的反应混合物用AcOEt稀释，用水 洗涤，然后用10%柠檬酸水溶液洗涤，最后用饱和的NaHCO₃洗涤。在减 压下除去溶剂和在硅胶上纯化(正己烷/AcOEt:1/9)以后，得到期望的加合物。

收率：91%。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃)：1.38-1.48(m,14H),1.75-2.00(m,3H),3.48(t, 2H),4.30(m,1H),5.40(m,1H),6.50(m,1H),7.12(t,1H),7.33(t,2H),7.60(d, 2H)。

ESIMS m/z421.21(M+Na)⁺;423.21(M+Na)⁺。

步骤B:硫代乙酸S-((S)-6-叔丁氧基羰基氨基-6-苯基氨甲酰基-己基)酯

将硫代乙酸钾(9.7mmol)加入((S)-6-溴-1-苯基氨甲酰基-己基)-氨基甲酸 叔丁酯(6.5mmol)在EtOH(40ml)中的溶液中。将反应混合物在室温搅拌过 夜。在减压下除去溶剂，并将得到的沉淀物倒入水中，并用AcOEt萃取2 次。将有机层用盐水洗涤，并经Na₂SO₄干燥，然后蒸发，得到期望的加合 物。

收率：97%

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)：1.45-1.50(m,13H)1.65-1.55(m,3H),2.10(t, 3H),2.74(m,1H),2.84(t,2H),4.17(s,1H),5.04(s,1H),7.10(t,1H),7.30(t, 1H),7.52(d,2H)。

ESIMS m/z417.41(M+Na)⁺。

步骤C:硫代乙酸S-((S)-6-氨基-6-苯基氨甲酰基-己基)酯-三氟乙酸盐

将三氟乙酸(61mmol)加入硫代乙酸S-((S)-6-叔丁氧基羰基氨基-6-苯基 氨甲酰基-己基)酯(6.10mmol)在DCM(30ml)中的溶液中。将反应混合物在 室温搅拌5小时，然后在减压下浓缩。将得到的粗制的反应混合物在Et₂O 中溶解2次，以彻底除去过量的三氟乙酸。得到作为淡红色油的期望的加合 物。

收率：定量

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)：1.20-2.00(m,8H),2.31(s,3H),2.80(t, 2H),4.05(m,1H),7.05(t,1H),7.30(t,2H),7.40(m,3H),7.58(d,2H),9.85 (s,1H)。

步骤D:硫代乙酸S-{(S)-6-[(2-氧代-4-苯基-吡咯烷-3-羰基)-氨基]-6-苯 基氨甲酰基-己基}酯

将硫代乙酸S-((S)-6-氨基-6-苯基氨甲酰基-己基)酯-三氟乙酸盐(1.03 mmol)、DIPEA(3.08mmol)和PyBOP(1.03mmol)加入(3R*,4S*)-2-氧代-4- 苯基-吡咯烷-3-甲酸在DCM/DMF:5/9中的溶液中。将得到的反应混合物在 室温搅拌过夜。在减压下除去溶剂以后，将得到的固体倒入水中，并用AcOEt 萃取2次。然后将有机层用NaHCO₃、水和盐水洗涤，然后经Na₂SO₄干燥 并在减压下浓缩，得到油。将后者通过硅胶色谱法部分地纯化，然后进行 HPLC纯化。

收率：12%。

¹H NMR(500MHz,丙酮-d₆)：1.30-1.80(m,8H),2.28(s,3H),2.81(t,2H), 3,51(t,1H),3.75(d,1H),3.87(m,1H),4.31(m,1H),4.54(m,1H),7.00-7.40(m, 8H),7.53(bs,1H),7.84(m,2H),7.89(d,1H),9.80(bs,1H)。

ESIMS m/z482.06(M+H)⁺。

按照在路线图3中描绘的操作，在步骤A中使用适当的胺和在步骤D 中使用足够的酸，合成实施例20-22。

实施例20

硫代乙酸S-{(S)-6-[((3R*,4R*)-2-氧代-4-苯基-吡咯烷-3-羰基)-氨基]-6-苯基氨甲酰基-己基}酯

在步骤D中，反应酸为2-氧代-4-苯基-吡咯烷-3-甲酸的顺式外消旋的 (即，“3R*,4R*)混合物。

收率：60%。

¹H NMR(300MHz,丙酮-d₆)：1.35-2.00(m,8H),2.28(s,3H),2.84(t,2H), 3,40(t,1H),3.59(d,1H),3.78(m,1H),4.13(m,1H),4.48(m,1H),7.00-7.40(m, 9H),7.63(m,2H),7.89(d,1H),9.25(bs,1H)。

ESIMS m/z482.06(M+H)⁺。

实施例21

硫代乙酸S-{(S)-6-[((R)-5-氧代-吡咯烷-2-羰基)-氨基]-6-苯基氨甲酰基-己基}酯

收率：35%。

¹H NMR(500MHz,CD₃OD)：1.20-2.00(m,10H),2.18(m,2H),2.29(s, 3H),2.80(t,2H),4.07(m,1H),4.40(m,1H),7.04(t,2H),7.29(t,2H),7.57(d, 1H),7.58(d,2H),8.10(d,1H),9.90(s,1H)。

ESIMS m/z428.17(M+Na)⁺。

实施例22

硫代乙酸S-{(S)-6-[(R*)-(2-氧代-哌啶-3-羰基)-氨基]-6-苯基氨甲酰基-己基}酯

收率：60%。

¹H NMR(500MHz,CD₃OD)：1.42-1,19(m,10H),2.29(s,3H),2.55(t,2H), 2,80(t,2H),3.35(m,2H),3.40(m,2H),4.53(m,2H),7.12(t,1H),7.33(t,2H), 7.60(d,2H)。

ESIMS m/z442.14(M+Na)⁺。

实施例23

(S)-6-氧代-哌啶-2-甲酸((S)-6-巯基-1-苯基氨甲酰基-己基)-酰胺

将NaOH的2N溶液(7.0mmol)加入硫代乙酸S-{(S)-6-[((S)-6-氧代-哌啶 -2-羰基)-氨基]-6-苯基氨甲酰基-己基}酯(0.95mmol)在EtOH(13ml)中的溶 液中。将反应混合物在室温搅拌过夜，然后倒入水中，并用AcOEt萃取，用 水、盐水洗涤，最后经Na₂SO₄干燥。在减压下除去溶剂，得到期望的加合 物，将其通过HPLC进行纯化。

收率：20%。

¹H NMR(500MHz,CD₃OD)：1.50(m,4H),1.68(m,2H),1.80(m,2H), 1.95(m,3H),2.10(m,1H),2.38(m,2H),2.55(t,2H),4.15(t,1H),4.53(m,1H), 7.12(t,1H),7.33(t,2H),7.60(d,2H)。

ESIMS m/z400.40(M+Na)⁺;376.34(M-H)^-。

按照在路线图4中描绘的操作，使用适当的起始原料，合成实施例24-40。

实施例24

(S)-6-氧代-哌啶-2-甲酸((S)-1-环戊基氨甲酰基-6-巯基-己基)-酰胺

起始原料是实施例17之一。

收率：44%。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)：1.05-1.90(m,20H),2.12(t,2H),2.21(t, 1H),2.45(m,2H),3.92(m,1H),3.97(m,1H),4.21(m,1H),7.55(d,1H),7.80 (s,1H),7.82(s,1H)。

ESIMS m/z392.2(M+Na)⁺;368.1(M-H)^-。

实施例25

(S)-6-氧代-哌啶-2-甲酸[(S)-1-(3-苄氧基-苄基氨甲酰基)-6-巯基-己基]-酰胺

起始原料是实施例3之一。

收率：32%。

¹H NMR(500MHz,CD₂Cl₂)：1.20-1.48(m,4H),1.48-2.02(m,8H),2.21 (m,2H),2.49(m,2H),3.20-3.42(m,2H),4.51(m,1H),5.04(s,2H),6.80-6.95 (m,3H),7.23(t,1H),7.28-7.50(m,5H),7.64(s,1H),7.75(d,1H)。

ESIMS m/z498.35(M+H)⁺。

实施例26

(S)-6-氧代-哌啶-2-甲酸[(S)-6-巯基-1-(4-三氟甲基-苄基氨甲酰基)-己基]-酰胺

起始原料是实施例2之一。

收率：33%。

¹H NMR(500MHz,CD₂Cl₂)：1.38(m,4H),1.52-2.12(m,9H),2.23(m, 2H),2.50(m,2H),3.98(m,1H),4.45(m,3H),7.20(m,1H),7.28-7.72(m,6H)。

ESIMS m/z460.14(M+H)⁺。

实施例27

(S)-4-氧代-氮杂环丁烷-2-甲酸((S)-6-巯基-1-苯基氨甲酰基-己基)-酰胺

起始原料是实施例1之一。

收率：56%。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)：1.34(m,4H),1.57(m,4H),2.22(t,1H), 2.47(q,1H),2.66(m,2H),3.10(dd,1H),4.07(m,1H),4.43(m,1H),7.04(t, 1H),7.29(t,2H),7.58(d,2H),8.15(s,1H),8.43(d,1H),10.11(s,1H)。

ESIMS m/z372.2(M+Na)⁺;348.2(M-H)-。

实施例28

(3S,4S)-2-氧代-4-苯基-吡咯烷-3-甲酸((S)-6-巯基-1-苯基氨甲酰基-己基)-酰胺

起始原料是实施例20之一。水解后，通过硅胶上的快速色谱法，纯化2 种硫醇盐衍生物的非对映异构体混合物，得到每种纯的异构体。

收率：44%。

¹H NMR(500MHz,丙酮-d₆)：1.35-2.00(m,8H),2.42(t,2H),3,40(t,1H), 3.59(d,1H),3.78(m,1H),4.13(m,1H),4.48(m,1H),7.00-7.40(m,9H),7.63 (m,2H),7.89(d,1H),9.25(bs,1H)。

ESIMS m/z462.27(M+Na)⁺。

实施例29

(3R,4R)-2-氧代-4-苯基-吡咯烷-3-甲酸((S)-6-巯基-1-苯基氨甲酰基-己基)-酰胺

根据实施例28的操作纯化以后，得到实施例29。

收率：37%。

¹H NMR(500MHz,丙酮-d₆)：1.35-2.00(m,8H),2.42(t,2H),3.51(t,1H), 3.75(d,1H),3.87(m,1H),4.31(m,1H),4.54(m,1H),7.00-7.40(m,9H),7.63 (m,2H),7.89(d,1H),9.25(bs,1H)。

ESIMS m/z462.27(M+Na)⁺。

实施例30

(3R,4S)-2-氧代-4-苯基-吡咯烷-3-甲酸((S)-6-巯基-1-苯基氨甲酰基-己基)-酰胺

起始原料是实施例19之一。水解后，通过硅胶上的快速色谱法纯化2 种硫醇盐衍生物的非对映异构体混合物，得到纯的异构体。

收率：40%。

¹H NMR(500MHz,丙酮-d₆)：1.30-1.80(m,8H),2.42(t,2H),3,51(t,1H), 3.75(d,1H),3.87(m,1H),4.31(m,1H),4.54(m,1H),7.00-7.40(m,8H),7.53 (bs,1H),7.84(m,2H),7.89(d,1H),9.80(bs,1H)。

ESIMS m/z462.81(M+Na)⁺。

实施例31

(3S,4R)-2-氧代-4-苯基-吡咯烷-3-甲酸((S)-6-巯基-1-苯基氨甲酰基-己基)-酰胺

根据实施例30的操作纯化以后，得到实施例31。

收率：37%。

¹H NMR(500MHz,CD₃OD)：1.35-2.40(m,8H),2.43(m,2H),3.48(t,1H), 3.80(m,2H),4.22(m,1H),4.53(m,1H),7.09(m,2H),7.30(m,4H),7.36(m, 4H),7.68(m,2H)。

ESIMS m/z462.27(M+Na)⁺。

实施例32

(S)-6-氧代-哌啶-2-甲酸[(S)-1-(3,4-二氢-1H-异喹啉-2-羰基)-6-巯基-己基]-酰胺

起始原料是实施例4之一。

收率：37%。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)：1.10-1.90(m,13H),2.05-2.23(m,2H), 2.35-3.00(m,4H),3.60-4.10(m,3H),4.48-4.86(m,3H),7.17(s,4H),7.49(m, 1H),8.10(m,4H)。

ESIMS m/z418.05(M+H)⁺。

实施例33

(R)-5-氧代-吡咯烷-2-甲酸((S)-6-巯基-1-苯基氨甲酰基-己基)-酰胺

起始原料是实施例21之一。

收率：42%。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)：1.20-2.00(m,10H),2.18(m,2H),2.21(t, 1H),2.45(m,1H),4.05(m,1H),4.40(m,1H),7.04(t,1H),7.29(t,2H),7.55(d, 1H),7.58(d,2H),8.08(d,1H),9.98(s,1H)。

ESIMS m/z364.28(M+H)⁺。

实施例34

(S)-6-氧代-哌啶-2-甲酸[(S)-6-巯基-1-(2-间甲苯基-乙基氨甲酰基)-己基]-酰胺

起始原料是实施例5之一。

收率：41%。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)：1.10-1.34(m,4H),1.42-1.76(m,7H),1.83 (m,1H),2.11(t,2H),2.21(t,1H),2.27(s,3H),2.44(m,2H),2.66(t,2H),3.23 (m,2H),3.91(m,1H),4.19(m,1H),6.90-7.08(m,2H),7.16(t,1H),7.51(bs, 1H),7.89(d,1H),7.95(t,1H)。

ESIMS m/z420.09(M+H)⁺。

实施例35

(R)-2-氧代-哌啶-3-甲酸((S)-6-巯基-1-苯基氨甲酰基-己基)-酰胺

起始原料是实施例22之一。水解后，通过硅胶上的快速色谱法纯化2 种硫醇盐衍生物的非对映异构体混合物，得到纯的异构体。

收率：39%。

¹H NMR(500MHz,CD₃OD)：1.42-1,19(m,12H),2.55(t,2H),3.35(m, 2H),3.40(m,2H),4.53(m,2H),7.12(t,1H),7.33(t,2H),7.60(d,2H)。

ESIMS m/z400.40(M+Na)⁺。

实施例36

(S)-2-氧代-哌啶-3-甲酸((S)-6-巯基-1-苯基氨甲酰基-己基)-酰胺

根据实施例35的操作纯化以后，得到实施例36。

收率：20%。

¹H NMR(500MHz,CD₃OD)：1.40-2.22(m,12H),2.55(t,2H),3.35(m, 2H),3.42(m,2H),4.53(m,2H),7.09(t,1H),7.29(t,2H),7.68(d,2H)。

ESIMS m/z400.40(M+Na)⁺。

实施例37

(R)-6-氧代-哌啶-2-甲酸((S)-6-巯基-1-苯基氨甲酰基-己基)-酰胺

起始原料是实施例13之一。

收率：82%。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)：1.34(m,4H),1.51(m,2H),1.64(m,5H), 1.87(m,1H),2.11(t,2H),2.22(t,1H),2.44(m,2H),3.96(m,1H),4.43(m,1H), 7.04(t,1H),7.29(t,2H),7.49(d,1H),7.57(d,2H),8.13(d,1H),10.04(s,1H)。

ESIMS m/z400.2(M+Na)⁺;376.2(M-H)-。

实施例38

(S)-6-氧代-哌啶-2-甲酸((S)-6-巯基-1-间甲苯基氨甲酰基-己基)-酰胺

起始原料是实施例16之一。

收率：25%。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)：1.34(m,4H),1.51(m,2H),1.64(m,5H), 1.85(m,1H),2.10(t,2H),2.20(t,1H)2.25(s,3H),2.44(m,2H),3.95(m,1H), 4.38(m,1H),6.85(d,1H),7.16(t,1H),7.36(d,1H),7.41(s,1H),7.48(d,1H), 8.06(d,1H),9.89(s,1H)。

ESIMS m/z414.3(M+Na)⁺;390.4(M-H)-。

实施例39

(S)-6-氧代-哌啶-2-甲酸((S)-6-巯基-1-对甲苯基氨甲酰基-己基)-酰胺

起始原料是实施例15之一。

收率：53%。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)：1.33(m,4H),1.51(m,2H),1.60(m,5H), 1.83(m,1H),2.10(t,2H),2.21(t,1H),2.23(s,3H),2.43(m,2H),3.95(m,1H), 4.37(m,1H),7.09(d,2H),7.45(d,2H),7.48(d,1H),8.08(d,1H),9.89(s,1H)。

ESIMS m/z414.4(M+Na)⁺;390.3(M-H)-。

实施例40

(S)-1-甲基-6-氧代-哌啶-2-甲酸((S)-6-巯基-1-苯基氨甲酰基-己基)-酰胺

起始原料是实施例12之一。

收率：28%。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)：1.34(m,4H),1.49(m,2H),1.57(m,3H), 1.66(m,2H),1.88(m,2H),2.17(m,2H),2.67(s,3H),2.80(t,2H),4.08(m,1H), 4.42(m,1H),7.02(t,1H),7.26(t,2H),7.56(d,2H),8.33(d,1H),10.05(s,1H)。

ESIMS m/z392.0(M+H)⁺。

实施例41

硫代碳酸乙基酯{(S)-6-[((S)-6-氧代-哌啶-2-羰基)-氨基]-6-苯基氨甲酰基-己基}酯

向(S)-6-氧代-哌啶-2-甲酸((S)-6-巯基-1-苯基氨甲酰基-己基)-酰胺(0.21 mmol)在DCM(20ml)中的溶液中，加入NEt₃(0.23mmol)和氯甲酸乙酯(0.23 mmol)。将反应混合物在室温搅拌2小时。将反应混合物在减压下浓缩，并 使用AcOEt/MeOH:80/20作为洗脱液，通过硅胶上的色谱法纯化粗产物。

收率：74%。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)：1.20(t,3H),1.25-1.45(m,4H),1.52-1.80 (m,7H),1.87(m,1H),2.11(t,2H),2.82(t,2H),3.97(m,1H),4.21(m,4H),3.47 (q,2H),4.41(m,1H),7.05(t,1H),7.30(t,2H),7.48(bs,1H),7.58(d,2H),8.10 (d,1H),9.99(s,1H)。

ESIMS m/z450.15(M+H)⁺。

按照实施例41的操作，使用(R)-5-氧代-吡咯烷-2-甲酸((S)-6-巯基-1-苯基 氨甲酰基-己基)-酰胺替代(S)-6-氧代-哌啶-2-甲酸((S)-6-巯基-1-苯基氨甲酰基 -己基)-酰胺，合成实施例42。

实施例42

硫代碳酸乙基酯{(S)-6-[((R)-5-氧代-吡咯烷-2-羰基)-氨基]-6-苯基氨甲酰基-己基}酯

收率：82%。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)：1.18(t,3H),1.33(m,4H),1.6(m,4H), 1.85(m,1H),2.10(m,2H),2.25(m,1H),2.79(t,2H),4.09(m,1H),4.20(q,2H), 4.42(m,1H),7.03(t,1H),7.28(t,2H),7.57(d,2H),7.82(s,1H),8.20(d,1H), 10.05(s,1H)。

ESIMS m/z436.3(M+H)⁺。

实施例43

硫代异丁酸S-{(S)-6-[((S)-6-氧代-哌啶-2-羰基)-氨基]-6-苯基氨甲酰基- 己基}酯

按照在实施例30中描述的操作，但是使用异丁酰氯替代氯甲酸乙酯，

合成该化合物。

收率：42%。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)：1.04(t,6H),1.22-1.44(m,4H),1.46-1.77 (m,6H),1.93(m,1H),2.06(m,1H),2.20(m,1H),2.37(m,1H),2.48(m,4H), 3.47(m,1H),4.32(m,1H),4.81(m,1H),7.04(t,1H),7.29(t,2H),7.57(d,2H), 8.33(d,1H),9.99(s,1H)。

ESIMS m/z448.24(M+H)⁺。

化合物A

硫代乙酸S-(6-苯基氨甲酰基-己基)酯

作为在涉及实施例14的化合物的体内实验中的对比实施例(表8)，试验 了该商购可得的衍生物，其不呈现在支架侧链上的内酰胺-羰基氨基部分。

生物学

实施例44

HDAC酶测定

在有发荧光的四肽RHKKAc(得自p53残基379-382)底物(10μM)存在 下，针对11种HDAC分离的人异形体，进行HDAC绘谱。通过标准纯化， 得到分离的人HDAC，例外是HDAC3，其为人重组蛋白，为在杆状病毒表 达系统中共表达的全长人HDAC3与C-端His-标签和具有N-端GST-标签的 人NCOR2氨基酸395-489的复合物。将每种化合物溶解在DMSO中，并将 渐进地稀释的溶液用于试验。使用TSA和SAHA作为参考化合物。在它的 脱乙酰化以后，释放荧光团，产生通过荧光计可检测的荧光发射，并通过分 析剂量-响应抑制曲线来确定化合物的IC₅₀值。使用TSA和SAHA作为参考 化合物。

表1

IC₅₀<50nM：+++；50nM<IC₅₀<100nM：++；100nM<IC₅₀<500nM：+

结果

证实了本发明的化合物对所有HDAC异形体都是非常有效的，具有在 低纳摩尔范围内的抑制活性(表1)。考虑到对比衍生物(即，((S)-1-环戊基氨 甲酰基-6-巯基-己基)-氨基甲酸叔丁酯，且报道在Itoh Y.,等人,J.Med.Chem., 2007,50,5425)的生物学性能，这样的发现是惊人的。实际上，如以前报道 的，我们验证和证实了它的HDAC6选择性谱发现，此外，与大多数本文描 述的化合物相比远远更低的对HDAC6的活性。

当将一些上述的衍生物的HDAC抑制谱与对应的异羟肟酸盐类似物之 一进行对比时，我们令人惊讶地发现，与含有异羟肟酸盐锌结合基团的类似 物相比，前一种硫代衍生物至少等效或甚至更有效(表2)。

表2

IC₅₀<50nM：+++；50nM<IC₅₀<100nM：++；100nM<IC₅₀<500nM：+

实施例45

细胞毒性

根据Skehan等人的方法(Skehan P.,等人,J.Natl.Cancer Inst.,1990,82, 13,1107)，并使用SAHA(伏林司他)作为参考化合物，评价了一些本发明的 化合物对NCI-H460非小细胞肺癌和HCT116结肠癌细胞的细胞毒性效应。

在含有10%热灭活的胎牛血清和50μg/ml硫酸庆大霉素的RPMI1640 培养基中培养肿瘤细胞，并在大约10%汇合时接种进96-孔组织培养板中。 允许它们附着和恢复至少24h。然后将不同浓度的本发明的化合物加入每个 孔中，以便限定它们的IC₅₀值(即，抑制50%的细胞存活的浓度)。

将平板在37℃温育24h，此后通过除去上清液和加入PBS，将它们洗 涤3次。然后将平板在37℃温育另外48h。加入200μl PBS和50μl冷的80% TCA，并将平板在冰上温育至少1h。除去TCA，并通过浸入蒸馏水中将平 板洗涤3次。然后将它们在纸上在40℃干燥5min。加入200μl0.4%磺酰罗 丹明B在1%乙酸中的溶液。将平板在室温温育另外30min。除去磺酰罗丹 明B，并通过浸入1%乙酸中而将平板洗涤3次，并在纸上干燥，在40℃干 燥5min。然后加入200μl Tris10mM。将平板在磁力搅拌下保持20min。通 过Multiskan荧光分光计在540nm借助于光密度确定细胞存活。将杀死的细 胞的量计算为相对于对照培养物的磺酰罗丹明B结合的降低百分比。用 “ALLFIT”程序计算IC₅₀值(关于H460细胞系，报道在表3中，关于HCT116 细胞系，报道在表4中)。

结果

本发明的化合物表现出非常好的抑制谱，非常经常地远远好于关于参考 化合物SAHA所观察到的值。

表3

IC₅₀<0.5μM：+++；0.5μM<IC₅₀<1.0μM：++；

1.0μM<IC₅₀<10μM：+

表4

IC₅₀<0.5μM：+++；0.5μM<IC₅₀<1.0μM：++；

1.0μM<IC₅₀<10μM：+

实施例46

在扩展的细胞系组上进一步研究了实施例21的化合物，以便与用作参 考化合物的SAHA对比评估它的细胞毒性。

在含有10%热灭活的胎牛血清和50μg/ml硫酸庆大霉素的RPMI1640 培养基中培养附着的肿瘤细胞(A2780,SKOV-3,MDA-MB436,MCF-7, HSC3)，同时将DMEM用于MDA-MB231细胞系。将大约10%汇合的细胞 接种进96-孔组织培养板中。允许它们附着和恢复至少24h。然后将不同浓 度的本发明的化合物加入每个孔中，以便限定细胞存活抑制IC₅₀。将平板在 37℃温育72h，此后通过除去上清液将它们洗涤3次。加入200μl PBS和 50μl冷的80%TCA，并将平板在冰上温育至少1h。除去TCA，并通过浸 入蒸馏水中将平板洗涤3次。然后将它们在纸上在40℃干燥5min。加入200μl 0.4%磺酰罗丹明B在1%乙酸中的溶液。将平板在室温温育另外30min。除 去磺酰罗丹明B，并通过浸入1%乙酸中而将平板洗涤3次，并在纸上在40 ℃干燥5min。然后加入200μl Tris10mM。将平板在磁力搅拌下保持20min。 通过Multiskan荧光分光计在540nm借助于光密度确定细胞存活。将杀死的 细胞的量计算为相对于对照培养物的磺酰罗丹明B结合的降低百分比。用 “ALLFIT”程序计算IC₅₀值(报道在表5中)。

在含有10%热灭活的胎牛血清和50μg/ml硫酸庆大霉素的RPMI1640 培养基中悬浮培养U937、HUT78和K562，同时在Iscove氏改良的Dulbecco 氏培养基中培养MV4-11细胞。实验操作如上所述，但是借助于在1600x g 离心平板10min(进行操作2次)而除去上清液。

结果报道在表5中。

表5

在表5中报道的结果明确地证实，实施例14的化合物对具有宽细胞系 组具有有效的抗癌性能，同时对比化合物SAHA通常表现出一般低得多的生 物活性。

实施例47

微管蛋白和组蛋白乙酰化

使用如下面报道的不同抗体，进行NCI-H460细胞（其预先与实施例14 的化合物或SAHA一起温育）的细胞质和细胞核提取物的蛋白质印迹分析， 以测量α-微管蛋白和组蛋白乙酰化：

小鼠抗-乙酰基-微管蛋白单克隆抗体(Sigma；目录号T6793)；

小鼠抗-β-肌动蛋白单克隆抗体(Sigma；目录号A5316)；

兔抗-乙酰基-组蛋白H4多克隆抗体(Upstate；目录号06-598)；

小鼠抗-组蛋白H4单克隆抗体(Upstate；目录号07-108)。

使用ECL Plus Western印迹检测试剂(得自Amersham Biosciences)进行实 验，并使用计算机化的磷酸图像分析仪(PhosphoImager;Molecular Dynamics, Sunnyvale,CA,U.S.A.)分析带的强度。

结果

证实了实施例14的化合物会诱导细胞质α-微管蛋白的超乙酰化，其与 用参考化合物SAHA观察到的结果相当。此外，实施例14的化合物在低至 100nM的浓度也会诱导H4超乙酰化，同时SAHA在诱导组蛋白H4乙酰化 方面的有效性低6倍(即，图1和表6)。

表6

实施例48

抗肿瘤活性

将HCT116结肠癌细胞、或NCI-H460NSCLC、或H929多发性骨髓瘤 细胞（都悬浮于0.1ml培养基199中）皮下地(s.c.)接种进CD1裸鼠的右胁 腹(即，5x10⁶个HCT116;3x10⁶个NCI-H460和20x10⁶个H929)。在肿瘤注 射以后3天，根据方案每周5天每天1次持续3周（qd x5/w x3w）开始治 疗(即，如在表6中所报道的)，例外是按照每周每4天1次持续3周（q4d/w  x3w）施用的顺铂。将试验的衍生物作为在PBS/DMSO/聚氧乙烯蓖麻油 (Sigma):85/10/5(体积百分比)中的混悬液来施用。

通过用游标卡尺测量肿瘤直径，根据下式确定抗肿瘤活性：

TV=d²X D/2

其中d和D分别是最短和最长直径。

当肿瘤达到约1000mm³的体积时，通过颈椎脱位处死小鼠。根据下面 报告的式，将药物的效力评估为肿瘤体积抑制：

进行体重记录以评价体重损失，如在以下方程式中所计算的：

$\%\mathrm{BWL}=100-\left[\frac{{\mathrm{BW}}_{{\mathrm{day}}_x}}{{\mathrm{BW}}_{\mathrm{day}1}}\right]\times 100$

其中BW dayx对应于在实验第x天的平均重量，同时BW day1对应于 在实验第1天的平均重量。

结果

在比SAHA的剂量低3倍的剂量，实施例14的化合物在3个实验中表 现出相当的或甚至优良的肿瘤体积抑制。所有动物也非常支持治疗(表7)。

表7

实施例49

抗肿瘤活性

用另一种化合物在发展如上所述的HCT116结肠癌或A2780卵巢癌的小 鼠动物模型上重复实施例48的实验，并口服地施用溶解在PEG200/DMSO/ 聚氧乙烯蓖麻油(Sigma):85/10/5(体积百分比)中的药物。结果报道在表8中。

表8

实施例21的化合物表现出超过它的类似物化合物A（其被剥夺侧链） 的有效生物活性，从而证实了支架的内酰胺-羰基氨基部分的重要性。此外， 实施例21的化合物也在卵巢癌动物模型中表现出强生物活性，其TVI优于 由SAHA产生的TVI。同样重要的是，应当指出，即使在口服施用以后，发 现了有效的生物活性，从而提示对首过代谢的高稳定性。