一种检测纸质食品包装材料中11种荧光增白剂含量的方法

摘要

本发明公开了一种检测纸质食品包装材料中荧光增白剂（FWAs）含量的方法，包括5种二磺酸型FWAs（C.I71、85、90、113，FWA5bm），3种四磺酸型FWAs（C.I24、210、220）和3种六磺酸型FWAs（C.I264、353、357）。其特征在于，所述的方法包括下列步骤：（一）样品的制备；（二）待测物质的提取；（三）脱脂；（四）浓缩；（五）高效液相色谱检测。本发明所提供的方法操作简单，灵敏度高，能同时分离检测11种物质、定性定量分析结果准确、检测限低、分析速度快。

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测纸质食品包装材料中荧光增白剂的方法，特别是以水与有机溶剂的混合溶剂超声提取，利用高效液相色谱法同时检测纸质食品包装材料中11种双三嗪氨基二苯乙烯型荧光增白剂的高通量检测方法，属于食品分析和包装材料领域。  

背景技术

荧光增白剂（简称FWAs）被广泛应用于纸张、纺织品和洗涤剂中来增加商品的白度和亮度，其中，纸张中80%的FWAs为双三嗪氨基二苯乙烯型荧光增白剂（简称DSD-FWAs）。然而，由于有些不法商家将含有大量DSD-FWAs的办公用废纸回收用于纸质食品包装材料的生产，另外有些商家向纸质食品包装材料中非法添加DSD-FWAs，从而给食品安全带来某些隐患。虽然早期的文献报道DSD-FWAs为低毒性物质，但随着工业中DSD-FWAs生产品种的日益增多，越来越多未知毒性数据的DSD-FWAs可能被带入纸质食品包装材料中，研究表明，以C.I 85为代表的DSD-FWAs新品种可能会有提高病毒在人体中传染效率等危害的负面作用(Bing W, et al. Current Microbiology, 2007, 54(1):5-8.)。美国食品药品管理监督局（FDA）和中国国标均规定纸质食品包装材料中仅允许添加C.I 220，并严格规定其限量，而禁止其余DSD-FWAs的添加。 

荧光增白剂的分析方法有薄层色谱法、荧光光度法、紫外分光光度法和高效液相色谱法等。薄层色谱法操作复杂，且其定量能力不足；分子荧光光度法和紫外分光光度法仅能测定FWAs总量，且提取液易受到杂质的干扰，从而导致测定结果偏高；目前测定荧光增白剂的主流方法为离子对高效液相色谱法，如Shu等使用四丁基溴化铵（TBAB）为离子对试剂等度洗脱同时分析4种DSD-FWAs（Shu W C, et al. Journal of Chinese chemical society, 2009,56(4):797-803.）；然而由于DSD-FWAs类化合物结构较为类似，且DSD-FWAs标准品不易获得，有关离子对色谱法对DSD-FWAs分离特性的研究尚不到位，现有国内外检测技术手段还跟不上DSD-FWAs在纸质材料中的实际应用。另外，国内外对于纸质食品包装材料中DSD-FWAs提取的方法多采用提取率相对低的热水萃取法（Jeong S K, et al. Bull. Korean Chem. Soc.2012, 32(3), 3971-3976.），需要研究出一种更高效的提取方法。 

为满足纸质食品包装材料中DSD-FWAs的高通量分析，本发明使用水与有机溶剂的混合溶剂，分3次超声提取，并使用四丁基溴化铵（TBAB）为离子对试剂梯度洗脱分离，建立出一种同时检测纸质食品包装材料中11种DSD型荧光增白剂（FWAs）的高效液相色谱方法。 

发明内容

本发明采用超声提取法，高效液相色谱串联二极管阵列或荧光检测仪同时检测纸质食品包装材料中的11种DSD-FWAs , 包括以下步骤： 

（一）样品的处理

将纸质食品包装材料样品展开成平板状，逐份通过碎纸机将样品粉碎成纸屑；若纸质材料较为柔软（如面巾纸），可取多份样品用剪刀剪成纸屑。再将纸屑转移至高速粉碎机中，以10000 转/min的转速粉碎6次，每次约15s，将纸屑粉碎成纤维状。其中，也可以将纸质食品包装材料样品直接采用剪刀剪成纸屑后检测，但样品均匀度不如经高速粉碎制备的样品。

（二）待测物质的提取 

称取待测均匀样品0.5g于50mL聚丙烯塑料离心管中；拉紧实验室窗帘并关闭实验室日光灯，使实验环境处于照度小于20 Lux的避光状态下。加入25 mL 乙腈/水（2:3,v/v），50℃水浴下超声提取35 min。提取结束后，以3750 转/min的转速离心5 min。转移上清液至50 mL容量瓶中，再于样品中分两次加入12 mL 乙腈/水（2:3,v/v），同上述提取步骤提取10 min，重复两次。合并前后三次的上清液，并用乙腈/水（2:3,v/v）定容至50 mL，涡旋30s以使提取液充分混匀。其中，样品称取量可以为0.5-1.0 g中的一个；提取溶剂中的有机溶剂可以是乙醇、丙酮、甲醇、乙腈或者为几种溶剂的混合体；提取溶剂中含有机溶剂的比例可以10～90％之间的任何一个，但以40%含水量为最佳。

（三）提取液的脱脂 

将步骤（二）所得提取液转移至5 mL玻璃试管中，加入0.5 mL正己烷，充分涡旋30s以使样品提取液充分脱脂。静置2 min后，使用1 mL吸管小心移去正己烷层，并将剩余清液转移至EP管中，以12000 r/min的速度离心5 min，取上清液供HPLC分析。

（四）提取液的浓缩 

检测机构若需要更低的检出限，则将（二）所得的提取液浓缩，经（三）脱脂后再分析；准确移取25 mL步骤（二）所得提取液至鸡心瓶中，于50℃下减压旋转蒸发至近干。分次加入0.5 mL乙腈/水（2:3,v/v）润洗瓶身，并将润洗液转移至玻璃试管中。加入1 mL乙腈/水（2:3,v/v）至鸡心瓶中，用吸管反复润洗瓶身，并小心将润洗液转移至5 mL 玻璃试管中；继续分两次各加入0.5 mL乙腈/水（2:3,v/v）润洗鸡心瓶，合并润洗液至5 mL 玻璃试管中。使用乙腈/水（2:3,v/v）定容至2 mL后，重复步骤（三），得到溶液待HPLC分析。其中，润洗瓶身时加入乙腈/水（2:3,v/v）的量可以为0.5-1.0 mL的任一个。

（五）仪器条件 

色谱柱： Symmetry C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，Waters公司），或ZORBAX Eclipse  C₁₈柱（100 mm×4.6 mm，5 μm，Agilent公司）；柱温：35℃；流速为1.0 mL/min；流动相为(A)甲醇/水，5:95，V:V（含20 mmol/L 四丁基溴化铵），使用前经0.45 μm 滤膜过滤及真空脱气；(B)乙腈/甲醇(2:3,v/v)；进样方式：梯度洗脱，梯度洗脱程序如表1所示。进样体积：20 μL。

表1 流动相的梯度洗脱表 

时间（min）流速（mL/min）A(%)B（%）曲线01.0 2080—21.0 2080平行2.011.0 6040—121.0 7030线性171.0 8020线性191.0 1000线性19.011.0 2080—231.0 2080平行

可采用PDA和FLD检测器串联分析，也可采用各检测器单独分析。使用FLD检测器，激发波长为350 nm，发射波长为430 nm；使用PDA检测器，定量波长为350 nm。

（六）本发明所述的荧光增白剂具有如图1所示的共同的母体结构。其中，11种DSD-FWAs的具体信息及所属类型如表2所示。 

图1 DSD-FWAs的母体结构 

表2 DSD-FWAs标准物质信息

（七）标准曲线的制备

分别准确称取适量11种DSD-FWAs标准品于10 mL容量瓶中，用乙腈/水（2:3,v/v）溶解后定容至刻度，充分混匀得到标准储备液，于-18℃冰箱中放置保存。于避光条件下，分别以11种DSD-FWAs标准储备液配制出20.0 μg/mL 混合标准中间液和1.0 μg/mL的混合标准使用液，再分别取适量混合标准工作液用乙腈/水（2:3,v/v）稀释成25、150、275、400、500 ng/mL的标准曲线系列，按照步骤（五）进行进样分析。

（八）定量方法 

HPLC进样分析后，以标准曲线溶液的峰面积为Y值，浓度为X（ng/mL）值，进行标准曲线拟合，得出各物质标准曲线Y=AX+B；样品的测定结果按式（1）计算：

  …                  …（1）

式中：

w   ──样品中某一DSD-FWAs的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；

Y   ──样液中目标物的峰面积；

V  ──样品提取液的体积，单位为毫升（mL）；

B  ──该物质标准曲线的截距；

A  ──该物质标准曲线的斜率；

m  ──样品称样量，单位为克（g）；

w₀ ── 空白对照试验值，单位为毫克每千克（mg/kg）。

本发明所提供的方法操作简单，灵敏度高，能同时分离检测11种物质、定性定量分析结果准确、检测限低、分析时间快。 

附图说明

图1是使用PDA检测器分析11种DSD-FWAs混标（500 ng/mL）色谱图； 

图2是使用荧光检测器分析11种DSD-FWAs混标色谱图（100 ng/mL）。

具体实施方式

实验仪器及材料： 

LC-20AT液相色谱仪（日本岛津公司，配置有 SPD-M20A二极管阵列检测器和RF-10Axl荧光检测器）；Symmetry C₁₈色谱柱（250 mm×4.6mm，5 μm，Waters公司）；G-560E型漩涡混合器（美国Scientific Industries公司）； KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，超声最大功率为100kHz）；Microfuge型高速离心机（美国Beckman公司，配置转速约为5000 转/min、可容纳50 mL塑料离心管的转头和转速为10,000 转/min以上、可容纳2.0 mL 塑料离心管的转头）；办公用碎纸机，可将纸张粉碎成2 mm×6 mm的纸屑；高速粉碎机，转速为10000 r/min；CP225D电子天平（准确至0.01mg，德国Sartorious公司，称量标准品）；YP202电子天平（上海商品公司，称量样品）；旋转蒸发仪，含循环水式多用真空泵。50 mL 聚丙烯离心管（Corning）、50 mL容量瓶、5 mL玻璃试管、250 mL鸡心瓶，25 mL移液管，2.0 mL EP管，2.0 mL 进样瓶，5 mL 塑料吸管和1 mL塑料吸管，100和1000 μL移液器各一把，手术剪刀1把。

纸质食品包装材料(包括纸巾、纸杯、纸碗、纸袋等)购自当地超市及农贸市场。四丁基溴化铵为分析纯级（中国国药集团上海化学试剂有限公司）；乙腈、甲醇均为色谱纯级（Fisher公司）；正己烷为色谱纯级（Merck公司）；实验用水为符合GB/T 6682规定的一级水。 

所有的标准溶液用乙腈/水（2:3,v/v）溶解，并于4℃下避光储存。 

实施例1：纸巾中荧光增白剂含量的检测

（一）样品的制备

取纸巾样品用剪刀剪成1×1 cm²纸屑。将纸屑全部转移至高速粉碎机中，盖紧粉碎机盖子，以10000 转/min的转速粉碎6次，每次约15s，将纸屑粉碎成纤维状，每次粉碎后需使用勺子将纸屑碎末搅匀。样品在室温下置于黑暗处保存，备用。

（二）待测物质的提取 

称取0.5g粉碎均匀的纸巾样品至50 mL聚丙烯塑料离心管中；拉紧实验室窗帘并关闭实验室日光灯，使实验环境处于避光状态。加入25 mL 乙腈/水（2:3,v/v），50℃水浴下超声提取35 min。提取结束后，以3750转/min的转速离心5 min。转移上清液至50 mL容量瓶中，再于样品中分两次加入12 mL 乙腈/水（2:3,v/v），同上述提取步骤提取10 min，重复两次。合并前后三次的上清液，并用乙腈/水（2:3,v/v）定容至50 mL，充分涡旋混匀后，于黑暗处保存。

（三）提取液的脱脂 

取2 mL 步骤（二）所得提取液至5 mL 玻璃刻度试管中，加入0.5 mL 正己烷，充分涡旋30 s以使脱脂充分。静置2 min，使用1 mL吸管小心移去上层正己烷层，将下层清液转移至EP管中，以10000 r/min的转速离心5 min，小心将上清液转移至进样瓶中，待HPLC分析。

（四）高效液相色谱-二极管阵列联用分析 

 将步骤（三）所得清液通过高效液相色谱-二极管阵列联用仪进行检测，高效液相色谱-二极管阵列联用仪所需条件如下：

色谱柱： symmetry C₁₈柱（250×4.6 mm，5 μm），Waters公司；柱温：35℃；总流速为1.0 mL/min；流动相为(A)甲醇/水，5:95，V:V（含20 mmol/L 四丁基溴化铵），使用前经0.45 μm 滤膜过滤及真空脱气；(B)乙腈/甲醇(2:3,v/v)；进样方式：梯度洗脱，梯度洗脱程序如表1所示。进样体积：20 μL。PDA检测器定量波长为350 nm。

（五）标准曲线的制备 

分别准确称取适量11种FWAs标准品于10 mL容量瓶中，用乙腈/水（2:3,v/v）溶解后定容至刻度，充分混匀得到标准储备液，于-24℃冰箱中放置保存。于避光条件下，分别以11种FWAs标准储备液配制出20.0 μg/mL 混合标准中间液和1.0 μg/mL的混合标准使用液，再分别取适量混合标准工作液用乙腈/水（2:3,v/v）稀释成25、150、275、400、500 ng/mL的标准曲线系列，按照步骤（四）进行处理分析。

（六）定量方法 

HPLC进样分析后，以标准曲线溶液的峰面积为Y值，浓度为X（ng/mL）值，进行标准曲线拟合，得出各物质标准回归方程Y=AX+B；样品的测定结果按式（1）计算，对于部分测定结果超出标曲线性范围的样品，将进样溶液稀释至标曲线性范围后进样分析。通过结果分析，11种DSD-FWAs的回收率皆在83.3%~103%之间，重复测定的RSD低于9.51%，显示方法的准确度和精密度良好。11种FWAs的回归方程、相关系数、检出限和定量限如表3所示。结果表明，11种FWAs在25~500 ng/mL范围线性关系良好，相关系数R都在0.9986以上。在30份纸巾样品中共有5份检出含有DSD-FWAs，其中有4份含有C.I 220，含量在2.9~846 mg/kg之间；2份检出含有C.I 113，含量在4.51~14.0 mg/kg之间；另有一份餐馆用餐巾纸检出含有C.I 210、28和353，含量分别为13.0、146和64.0 mg/kg。

表3 11种FWAs的回归方程、相关系数、检出限和定量限（PDA检测） 

DSD-FWAs回归方程相关系数（R）仪器检出限（ng/mL）检出限（mg/kg）定量限（mg/kg）C.I 220y = 46.173x - 116.510.9998 121.34.2C.I 24y = 46.856x - 286.470.9999 121.24.1C.I 210y = 42.282x - 386.80.9992 151.54.8C.I 85y = 81.922x + 30.6540.9986 111.13.6C.I 113y = 45.512x - 114.50.9998 161.65.2C.I 264y = 31.366x - 288.710.9999 161.65.4C.I 353y = 28.849x - 265.830.9993 161.65.2C.I 357y = 32.928x - 357.440.9997 151.55.0 FWA 5bmy = 57.944x - 200.910.9999 131.34.3C.I 90y = 48.63x - 147.71.0000 182.0 6.0 C.I 71y = 59.055x - 164.610.9996 131.34.2

实施例2：纸杯中荧光增白剂含量的检测

（一）样品的制备

取纸杯样品展开成平板状，逐份通过碎纸机将纸杯粉碎成纸屑。将纸屑全部转移至高速粉碎机中，盖紧粉碎机盖子，以10000 转/min的转速粉碎6次，每次约15s，将纸屑粉碎成纤维状，每次粉碎后需使用勺子将纸屑碎末搅匀。样品在室温下置于黑暗处保存，备用。

（二）待测物质的提取 

称取0.5 g粉碎均匀的纸杯样品至50 mL聚丙烯塑料离心管中；拉紧实验室窗帘并关闭实验室日光灯，使实验环境处于避光状态。加入25 mL 乙腈/水（2:3,v/v），45℃水浴下超声提取35 min。提取结束后，以3750转/min的转速离心5 min。转移上清液至50 mL容量瓶中，再于样品中分两次加入12mL 乙腈/水（2:3,v/v），同上述提取步骤提取10 min，重复两次。合并前后三次的上清液，并用乙腈/水（2:3,v/v）定容至50 mL，充分涡旋混匀后，于黑暗处保存。

（三）提取液的浓缩 

准确移取25 mL步骤（二）所得提取液至鸡心瓶中，将溶液在50℃下减压旋转蒸发至近干。加入1 mL 乙腈/水（2:3,v/v）至鸡心瓶中，用吸管反复润洗瓶身，并小心将润洗液转移至5mL 玻璃试管中；继续分两次各加入0.5 mL 乙腈/水（2:3,v/v）润洗鸡心瓶，合并润洗液至5 mL 玻璃试管中。使用乙腈/水（2:3,v/v）定容至2 mL，加入0.5 mL 正己烷，充分涡旋30s以使脱脂充分。静置2 min，分层后，使用吸管小心移去上层正己烷层，将下层液体转移至EP管中，10000转/min的转速下离心5 min。小心将液体转移至进样瓶中，待HPLC分析。

（四）高效液相色谱-荧光检测仪分析 

 将步骤（三）所得清液通过高效液相色谱-荧光检测仪进行检测，高效液相色谱-荧光检测仪所需条件如下：

色谱柱： symmetry C₁₈柱（250×4.6 mm，5μm，Waters）；柱温：35℃；流速为1.0 mL/min；流动相为(A)甲醇/水，5:95，V:V（含20 mmol/L 四丁基溴化铵），使用前经0.45um 滤膜过滤及真空脱气；(B)乙腈/甲醇(2:3,v/v)；进样方式：梯度洗脱，梯度洗脱程序如表1所示。进样体积：20 μL。FLD检测器：激发波长为350nm，发射波长为430nm。

（五）标准曲线的制备 

分别准确称取适量11种FWAs标准品于10 mL容量瓶中，用乙腈/水（2:3,v/v）溶解后定容至刻度，充分混匀得到标准储备液，于-24℃冰箱中放置保存。于避光条件下，分别以11种FWAs标准储备液配制出20.0 μg/mL 混合标准中间液和1.0 μg/mL的混合标准使用液，再分别取适量混合标准工作液用乙腈/水（2:3,v/v）稀释成25、150、275、400、500 ng/mL的标准曲线系列，按照步骤（四）进行处理分析。

（六）定量方法 

HPLC进样分析后，以标准曲线溶液的峰面积为Y值，浓度为X（ng/mL）值，进行标准曲线拟合，得出各物质标准回归方程Y=AX+B；样品的测定结果按式（1）计算，对于部分测定结果超出标曲线性范围的样品，将进样溶液稀释至标曲线性范围后进样分析。通过结果分析，11种FWAs的回收率皆在70.6%~93.1%之间，重复测定的RSD低于10.0%，显示方法的准确度和精密度良好。11种FWAs的回归方程、相关系数、检出限和定量限如表4所示。结果表明，11种FWAs在25~500 ng/mL范围线性关系良好，相关系数R都在0.9993以上。在8份纸杯样品中共有1份检出含有C.I 220，含量为6.36 mg/kg。

 表4 11种FWAs的回归方程、相关系数、检出限和定量限（FLD检测） 

DSD-FWAs回归方程相关系数（R）仪器检出限（ng/mL）检出限（浓缩后，mg/kg）定量限（浓缩后，mg/kg）C.I 220y = 20471x + 2720810.99931.40.0110.037C.I 24y = 19673x + 1939180.99971.60.0130.043C.I 210y = 19326x + 736840.99981.80.0140.047C.I 85y = 25748x + 6816130.99951.20.0100.033C.I 113y = 17673x + 608560.99992.10.0170.057C.I 264y = 17823x - 996810.99992.30.0180.060C.I 353y = 16701x - 753820.99972.40.0190.063C.I 357y = 16694x - 578040.99982.00.0160.053FWA 5bmy = 20379x + 1452650.99961.80.0140.047C.I 90y = 15130x + 268941.00002.00.0160.053C.I 71y = 21398x + 2010660.99971.30.0100.033