一种基于HPLC-DAD法测定甲磺酸伊马替尼含量及其杂质限度的方法

摘要

本发明公开了一种基于HPLC-DAD法测定甲磺酸伊马替尼含量及其杂质限度的方法，采用C18色谱柱，以甲醇—三乙胺水溶液为流动相，所述三乙胺水溶液的体积百分浓度为0.5%～1%，pH值为7.5～11；梯度洗脱，流速为0.8～1.2mL/min，检测波长为200～400nm；所述梯度洗脱的程序为0～55min，65%→15%三乙胺水溶液。此色谱条件下，各组分之间分离度均大于2.0，线性范围9.09～90.92μg·mL-1(r=0.9998)，检测限为0.3ng。该方法简便、准确、灵敏度高、重复性好，避免了使用辛烷基磺酸钠离子对试剂对色谱柱寿命的影响。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于HPLC-DAD法测定甲磺酸伊马替尼含量及其杂质限度的方法。

背景技术

甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate)，化学名为4-[(4-甲基–1-哌嗪)甲基]–N-{4- 甲基-3-[[4-(3-吡啶基)–2-嘧啶基]氨基]苯基}苯甲酰胺甲磺酸盐，商品名为格列卫，其 结构式如下，是瑞士诺华(Novartis)公司研发的酪氨酸激酶抑制剂类药物。其在美国、欧盟 和日本等国获得孤稀药物地位，用于治疗α-干扰素(interfereon–alfa)治疗失败胚细胞危象 病期、加速病期或慢性骨髓性白血病和胃肠道间质细胞瘤。

从张小顺等人关于伊马替尼分析方法的综述中可见，目前国内外对于甲磺酸伊马替尼的 分析方法(HPLC-MS、HPLC-MS-MS、毛细管电泳法、电化学分析方法等)主要集中在血药 浓度及生物利用度上，而对于原料药及有关物质的检测多采用离子对试剂辛烷基磺酸钠溶液 作为缓冲盐，流动相配制复杂，且离子对试剂和固定相结合产生不可逆吸附，进而影响固定 相活性位点，对色谱柱造成不可逆的伤害，会大大缩短色谱柱的使用寿命。离子对试剂对 pH值比较敏感，且离子对试剂的浓度与样品的保留时间有直接的影响，配制流动相时要求 精确度较高，否则直接影响实验的重复性和重现性。最近，Nageswari.A等人利用超高压液 相色谱法测定甲磺酸伊马替尼及其降解产物，但是此法对于仪器要求较高，梯度洗脱程序复 杂，且需要特殊的色谱柱(Waters Acquity UPLC BEH C18(50×2.1mm,1.7μm))。目前各国药 典均未收载其原料和制剂的标准，进口注册标准（JX20040087）和国内关于伊马替尼分析方 法的报道，均采用离子对试剂辛烷基磺酸钠作为缓冲盐。

从现有的专利文献及期刊论文公开的内容来看，目前国内外用于检测伊马替尼的方法主 要是液相法和电位滴定法，所用流动相为辛烷基磺酸钠离子对试剂、或多溶剂组合。研究人 员发现，辛烷基磺酸钠离子对试剂对色谱柱有影响，减少色谱柱的使用寿命。因此针对现有 技术中所存在的技术问题，发明人经过理论分析和实验研究，提供了一种新的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于HPLC-DAD法测定甲磺酸伊马替尼含量及其杂质限度 的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种基于HPLC-DAD法测定甲磺酸伊马替尼含量及其杂质限度的方法，采用C18色谱 柱，以甲醇—三乙胺水溶液为流动相，所述三乙胺水溶液的体积百分浓度为0.5%～1%，pH 值为7.5～11；梯度洗脱，流速为0.8～1.2mL/min，检测波长为200～400nm；所述梯度洗脱的 程序为0～55min，65%→15%三乙胺水溶液。

所述的检测波长优选为268nm。

所述三乙胺水溶液的体积百分浓度优选为0.5%。

所述三乙胺水溶液的pH值优选为8。

所述色谱柱的柱温为25～35℃，进样体积为0.5～20μL。上述柱温优选为30℃，上述进 样体积优选为10μL。

所述流速优选为1.0mL/min。

所述的C18色谱柱为Waters X-Terra RP18色谱柱、Welch Materials Xtimate C18色谱 柱、Phenomenex Gmini C18色谱柱或Waters X-Bridge C18色谱柱。

本发明技术方案中所述的杂质为甲磺酸伊马替尼工艺合成过程中可能产生的六个杂质及 其可降解的产物。其中六个杂质为：杂质A：4-[(哌嗪-1-基)甲基]-N-{4-甲基-3-[[4- (3-吡啶基)嘧啶-2-基]氨基]苯基}苯甲酰胺；杂质B：4-[(4-甲基-1,4-二氧化哌嗪- 1-基)甲基]-N-{4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)嘧啶-2-基]氨基]苯基}苯甲酰胺；杂质 C：4-[(4-甲基-1-氧化哌嗪-1-基)甲基]-N-{4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)嘧啶-2 -基]氨基]苯基}苯甲酰胺；杂质D：4-[(4-甲基-4-氧化哌嗪-1-基)甲基]-N-{4-甲 基-3-[[4-(3-吡啶基)嘧啶-2-基]氨基]苯基}苯甲酰胺；杂质E：1,4-双{4-[4-甲基-3- [[4-(3-吡啶基)嘧啶-2-基]氨基]苯基]氨甲酰基}苄基哌嗪；杂质F：1–[4–甲基哌嗪基]苄 甲酰基-{4-[4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)嘧啶-2-基]氨基]苯基]氨甲酰基}苄基哌嗪。

本发明的有益效果体现在：（1）避免使用辛烷基磺酸钠离子对试剂，减少对色谱柱的损 害，本发明采用甲醇-三乙胺水溶液为流动相，其色谱柱的使用寿命与依照现有技术（采用 离子对试剂辛烷基磺酸钠作为流动相）相比有显著的增加；（2）流动相成分简单、易得； （3）采用梯度洗脱的方法，检测更准确；（4）本发明只需要使用普通的C18色谱柱，可降 低色谱柱造价和检测成本；（5）该方法简便、准确、灵敏度高、重复性好。

附图说明

图1为甲磺酸伊马替尼及其有关物质检查HPLC-DAD色谱图

图2为系统适用性试验HPLC色谱图

1甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate).2杂质B(impurity B).3杂质C(impurity C). 4杂质D(impurity D).5杂质A(impurity A).6杂质E(impurity E).7杂质F(impurity  F)

图3为HPLC法专属性考察图谱

A:酸破坏样品(destroyed by acid)B:碱破坏样品(destroyed by base)C:氧化破坏样品 (destroyed by oxidation)D:光破坏样品(destroyed by strong light)E:高温破坏样品 (destroyed by high temperature)F:未破坏样品(non-destroyed sample)

2杂质B(impurity B).3杂质C(impurity C).4杂质D(impurity D).0未知杂质(unknown  impurity).

图4为专属性试验质谱图

A:酸破坏降解产物杂质B质谱图(Mass spectral data of degradation products found in acid  hydrolysis)B:碱破坏降解产物杂质B质谱图(Mass spectral data of degradation products found  in base hydrolysis)C:氧化破坏降解产物杂质B、C、D质谱图(Mass spectral data of  degradation products found in oxidation)

具体实施方式

该基于HPLC-DAD法测定甲磺酸伊马替尼含量及其杂质限度的方法为：采用C18色谱 柱，以甲醇—三乙胺水溶液为流动相，所述三乙胺水溶液的体积百分浓度为0.5%～1%，pH 值为7.5～11；梯度洗脱，流速为0.8～1.2mL/min，检测波长为200～400nm；所述梯度洗脱的 程序为0～55min，65%→15%三乙胺水溶液。

所述的检测波长优选为268nm。

所述三乙胺水溶液的体积百分浓度优选为0.5%。

所述三乙胺水溶液的pH值优选为8。

所述色谱柱的柱温为25～35℃，进样体积为0.5～20μL。上述柱温优选为30℃，上述进 样体积优选为10μL。

所述流速优选为1.0mL/min。

所述的C18色谱柱为Waters X-Terra RP18色谱柱、Welch Materials Xtimate C18色谱 柱、Phenomenex Gmini C18色谱柱或Waters X-Bridge C18色谱柱。

本发明将对照品、供试品分别溶于甲醇中，得到对照品溶液和供试品溶液，杂质测定采 用主成分自身对照法。得到所需溶液后，采用HPLC-DAD法进行测定，得到样品中伊马替 尼的含量。

本发明所采用的HPLC-DAD法，对高效液相色谱仪和质谱仪没有特殊的限制，采用本 领域技术人员熟知的色谱仪和质谱仪即可。本检测方法中采用C18色谱柱，以甲醇—三乙 胺水溶液为流动相，所述三乙胺水溶液的体积百分浓度为0.5%～1%，pH值为7.5～11；梯度 洗脱，流速为0.8～1.2mL/min，检测波长为200～400nm；所述梯度洗脱的程序为0～55min， 65%→15%三乙胺水溶液。柱温为25～35℃，进样体积为0.5～20μL。

质谱条件：Waters X-Bridge C18(250×4.6mm,5μm)；流动相：甲醇–5mmol·L^-1乙酸 铵水溶液(用氨水调其pH为9.5)，梯度洗脱程序(0–55min,65%→15%乙酸铵水溶液)；流 速：1.0mL·min^-1，检测波长：268nm，流动相pH：9.5，柱温：30℃，进样体积：1μL。电 离源：ESI；电极源极性：正离子全扫描模式；扫描范围m/z100～1000。毛细管电压：3.5 kV；毛细管出口电压：135V；干燥器温度：350℃；干燥器流速：9.0L·min^-1。

发明人应用上述检测方法，取甲磺酸伊马替尼对照品、杂质A、杂质B、杂质C、杂质 D、杂质E、杂质F适量，作为系统适用性试验溶液。结果表明本发明提供的检测方法具有 良好的系统适应性。

本发明考察了本发明提供的检测方法的抗干扰性能，本发明考察了酸、碱、氧化、高 温、光照对该方法的干扰。结果表明，本发明技术能够抗酸、碱、氧化、高温、光照的干 扰，专属性良好。

发明人考察了本发明提供的检测方法的精密度、中间精密度、重复性、稳定性及方法耐 用性，其过程为：

发明人依照上述溶液配制方法得到对照品溶液，取适量溶液，按上述检测方法连续测 定，结果表明，该检测方法精密、可靠；

发明人依照上述溶液配制方法得到对照品溶液和供试品溶液，由不同人员依照上述检测 方法连续多天测定，结果表明，该检测方法中间精密度良好；

发明人将同一批样品依照上述溶液配制方法得到多份供试品溶液，按上述检测方法分别 进样、测定，结果表明，该检测方法重复性良好；

发明人依照上述溶液配制方法得到供试品溶液，按上述检测方法测定24h内样品的峰面 积，结果表明，该检测方法24h内稳定性良好；

发明人选用系统适应性试验溶液，按上述检测方法将所述溶液在设置有不同色谱柱的高 效液相色谱仪上进行检测，结果表明，本发明提供的方法不会受色谱柱的限制，能够较好地 实现甲磺酸伊马替尼和杂质，以及杂质间的分离，说明本发明提供的方法具有较好的适用 性。

本发明实验结果表明，本发明提供的方法得到标准曲线的相关系数R为0.9998，这说明 本发明提供的方法中，甲磺酸伊马替尼的峰面积与其质量浓度间存在良好的线性关系，从而 使得到甲磺酸伊马替尼的含量的检测结果具有较高的准确度。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种检测甲磺酸伊马替尼的方 法进行详细地说明，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

以下实施例中应用的仪器与试药包括：

Waters2695高效液相色谱仪，Waters2487紫外检测器；Agilent1290高效液相色谱仪， Agilent1290DAD检测器，Agilent6538Q-TOF；Sartorius BP-211D型十万分之一电子天 平；美国Millipore公司Milli-Q Academic ZMQ50001超纯水系统。甲醇、乙酸铵、氨水均为 色谱纯(Thermo Fisher Scientific)；三乙胺、磷酸均为分析纯(国药集团化学试剂有限公 司)，水为超纯水。甲磺酸伊马替尼对照品(经标化含量为99.9%，批号：120220)；甲磺 酸伊马替尼原料药样品(批号：120828，120910，121001，1211108，130122)；杂质A：4- [(哌嗪-1-基)甲基]-N-{4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)嘧啶-2-基]氨基]苯基}苯甲酰胺； 杂质B：4-[(4-甲基-1,4-二氧化哌嗪-1-基)甲基]-N-{4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基) 嘧啶-2-基]氨基]苯基}苯甲酰胺；杂质C：4-[(4-甲基-1-氧化哌嗪-1-基)甲基]-N -{4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)嘧啶-2-基]氨基]苯基}苯甲酰胺；杂质D：4-[(4-甲基 -4-氧化哌嗪-1-基)甲基]-N-{4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)嘧啶-2-基]氨基]苯基}苯甲 酰胺；杂质E：1,4-双{4-[4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)嘧啶-2-基]氨基]苯基]氨甲酰 基}苄基哌嗪；杂质F：1–[4–甲基哌嗪基]苄甲酰基-{4-[4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)嘧啶 -2-基]氨基]苯基]氨甲酰基}苄基哌嗪。杂质均为采用本领域技术人员公知的方法自制。

色谱条件：Waters X-Bridge C18(250×4.6mm,5μm)；流动相：甲醇—三乙胺水溶液(5 ml三乙胺加入1000ml水中，用磷酸调其pH为8.0)，梯度洗脱程序(0–55min,65%→15% 三乙胺水溶液)；流速：1.0mL·min^-1，检测波长：268nm，流动相pH：8.0，柱温：30℃， 进样体积：10μL。

质谱条件：Waters X-Bridge C18(250×4.6mm,5μm)；流动相：甲醇–5mmol·L^-1乙酸 铵水溶液(用氨水调其pH为9.5)，梯度洗脱程序(0–55min,65%→15%乙酸铵水溶液)；流 速：1.0mL·min^-1，检测波长：268nm，流动相pH：9.5，柱温：30℃，进样体积：1μL。电 离源：ESI；电极源极性：正离子全扫描模式；扫描范围m/z100～1000。毛细管电压：3.5 kV；毛细管出口电压：135V；干燥器温度：350℃；干燥器流速：9.0L·min^-1。

实施例1

含量测定的对照品及供试品溶液配制：取甲磺酸伊马替尼对照品及样品各25mg分别置 于50mL容量瓶中，用甲醇溶解，溶剂稀释至刻度，摇匀。各取1mL分别置于10mL容量 瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。

有关物质检查的供试品溶液配制：取甲磺酸伊马替尼样品25mg置于50mL容量瓶 中，用甲醇溶解，溶剂稀释至刻度，摇匀。

有关物质检查的对照品溶液配制：取甲磺酸伊马替尼有关物质检查供试品溶液1mL置 于100mL容量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。

实施例2

取甲磺酸伊马替尼对照品按照实施例1项方法配制甲磺酸伊马替尼溶液，取甲磺酸伊马 替尼对照品及单个杂质按实施例3的方法配制成系统适用性试验溶液后，精密量取10μL注入 液相色谱仪，在200nm～400nm范围内进行DAD扫描(见图1)。结果表明甲磺酸伊马替尼 及各杂质均在230nm和268nm处有最大吸收，而三乙胺在230nm下具有一定的吸收，使得基 线噪音显著增加，检测灵敏度降低，故选择268nm作为检测波长。

实施例3

取甲磺酸伊马替尼对照品、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F适量， 精密称定，分别加甲醇超声处理使溶解，用溶剂定量稀释制成每1mL中含0.5mg甲磺酸伊 马替尼，50μg各杂质的混合溶液，作为系统适用性试验溶液。按上述色谱条件进样10μL 分析，甲磺酸伊马替尼的理论塔板数大于10000，各杂质的理论塔板数大于5000，拖尾因子 在0.95～1.05之间，各组分之间分离度均大于2.0(见图2)。

实施例4

将甲磺酸伊马替尼供试品溶液分别用强酸(2mol·L^-1盐酸5mL)、强碱(1mol·L^-1氢氧化钠 溶液5mL)、强氧化剂(5%过氧化氢溶液1mL)、高温(99.7℃水浴)和光照(日光照射60h)进 行破坏性试验制成酸破坏样品、碱破坏样品、氧化破坏样品、光破坏样品和高温破坏样品。 按上述色谱条件进样10μL，记录色谱图至甲磺酸伊马替尼2.5倍保留时间。结果表明：甲磺 酸伊马替尼对高温和光照均较稳定，无杂质生成，而在强酸和强碱条件下产生杂质B及一个 未知小杂质，氧化条件下产生氧化杂质B、C、D，各降解产物均分离度良好(见图3)。

实施例5

取酸、碱、氧化破坏后样品，按上述质谱条件，进样1μL，测得HPLC–MS色谱图(见 图4)。

甲磺酸伊马替尼在酸性和碱性条件下产生相同的降解产物，均为已知杂质B。图4A显 示m/z526的[M+H]⁺离子和564的[M+K]⁺离子，表明其相对分子量为525，与杂质B分子 式C₂₉H₃₁N₇O₃一致；图4B显示与图4A相同的分子离子峰。图4C显示m/z526、510、510 分别为杂质B、C、D的[M+H]⁺离子，表明其相对分子量分别为525、509、509，与杂质B 分子式C₂₉H₃₁N₇O₃，杂质C分子式C₂₉H₃₁N₇O₂，杂质D分子式C₂₉H₃₁N₇O₂一致。

实施例6

精密称取甲磺酸伊马替尼对照品适量，以甲醇定量稀释成每1ml分别含甲磺酸伊马替尼 0.009、0.027、0.045、0.063、0.081、0.090mg的溶液，按上述色谱条件，精密量取10μL分 别注入液相色谱仪，记录色谱图。以峰面积值对浓度进行线性回归，以甲磺酸伊马替尼的峰 面积A为纵坐标，浓度C(μg·mL^-1)为横坐标，计算得回归方程为：A=34628C-40131，r =0.9998。

结果表明：甲磺酸伊马替尼在9.09～90.92μg·mL^-1浓度范围内线性关系良好。

实施例7

取实施例1项下含量测定对照品溶液，精密量取10μL，注入液相色谱仪，连续进样6 次，测得甲磺酸伊马替尼峰面积的RSD=0.4%(n=6)。

实施例8

取同一批号样品，按实施例1的方法平行配制6份供试品溶液，分别进样10μL，记录色 谱图，按外标法以峰面积计算含量结果及RSD，结果含量为99.9%，RSD为0.2%(n=6)，表 明方法重复性良好。

取同一批号样品，由不同分析人员，按实施例1项下方法每天配制两份对照品及供试品 溶液进行测定，连续测定6天，记录色谱图，按外标法以峰面积计算含量结果及RSD，结果 含量为99.9%，RSD为0.3%(n=6)，表明方法精密度良好。

实施例9

取甲磺酸伊马替尼样品，按实施例1项下方法配制供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、 10、12、24h后进样10μL测定，测得甲磺酸伊马替尼峰面积的RSD=0.3%，表明24h内稳 定性良好。

实施例10

取实施例3中溶液逐级稀释，分别进样10μL，记录色谱图。计算其峰高与噪声的比值 (信噪比)，其信噪比(S/N=3)的样品浓度即为检测限浓度；信噪比(S/N=10)的样品浓度即 为定量限浓度；结果见表1。

表1  检测限及定量限

Tab1  Limits of detections and quantifications

实施例11

选用Waters X-Terra RP18(4.6×150mm,5μm)、Welch Materials Xtimate C18(4.6×250 mm,5μm)、Phenomenex Gmini C18(4.6×250mm,5μm)和Waters X-Bridge C18(250×4.6 mm,5μm)共4种不同型号的C18色谱柱，取实施例3中溶液10μL进样，结果表明4种色谱柱 对甲磺酸伊马替尼与各杂质的分离度均大于2.0，各相邻杂质峰之间均能达到有效分离。改 变以下色谱条件(见表2)，考察方法的耐用性。最终确定的色谱条件：流速：1.0mL·min^-1， 检测波长：268nm，柱温：30℃，三乙胺水溶液浓度：0.5%，流动相pH：8.0。

表2  测定条件范围

Tab2  Investigated range of robustness testing

实施例12

按实施例1项下方法配制有关物质测定的对照品及供试品溶液，取对照品溶液10μL注入 液相色谱仪，调正仪器灵敏度，使主成分峰的峰高为记录仪满量程的20～25%；再量取供试 品溶液10μL进样，记录色谱图至主成分峰保留时间的2.5倍。供试品溶液中各杂质峰的峰面 积之和，不得大于对照品溶液主峰的峰面积(总杂质小于1.0%)，单个杂质峰面积不得大于 对照品溶液主峰的峰面积的0.1倍(单个杂质小于0.1%)。取本品3批，按上述方法进行有关 物质检查，结果见表3。

表3  3批样品有关物质检查结果

Tab3  Determination results of related substances

实施例13

按实施例1方法配制含量测定的供试品溶液及对照品溶液，精密量取对照品及供试品溶 液10μL注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积计算甲磺酸伊马替尼的含量。取 本品3批，按上述方法测定，结果见表4。

表4  5批样品含量测定检查结果

Tab5  Determination results of imatinib mesylate

3对本发明技术方案的说明

3.1杂质产生及检测方法确定甲磺酸伊马替尼的六个有关物质均为成品中可能存在的原 料、中间体和降解产物。在强酸、强碱及加热条件下，哌嗪基易被氧化，产生氧化产物杂质 B。而在双氧水条件下，随着温度的升高，哌嗪基被氧化产生B、C、D三个不同的杂质。根 据三批样品和对照品的总杂质面积归一化测定结果与主成分自身对照法测定结果基本一致， 因此本发明技术采用主成分自身对照法测定甲磺酸伊马替尼的有关物质。

3.2流动相选择当流动相选择乙腈为有机相时，各组分均能很好的分离，但是B杂质本身含 有的小杂质不能分离。而选用甲醇为流动相则可以弥补乙腈的缺点，且从经济方面考虑优先 选择甲醇。

3.3耐受性试验试验结果表明流动相pH对各组分的分离产生重要的影响，当pH<7.5时， 杂质D不能得到分离；而pH在7.5～11.0之间时，各组分分离度，理论板数已经达到要 求，考虑到色谱柱的耐受性，选择pH=8.0为最佳pH。三乙胺浓度对各组分峰型产生显著影 响，当三乙胺浓度＜0.5%时，各杂质峰拖尾，当浓度为0.5～1.0%时，各组分的拖尾因 子、分离度及理论板数均已达到要求。因此选择三乙胺浓度为0.5%。

3.4色谱柱使用寿命：依照现有的伊马替尼分析方法，采用离子对试剂辛烷基磺酸钠作为缓 冲盐，色谱柱的使用寿命为2～3年，本发明技术方案采用甲醇—三乙胺水溶液为流动相，色 谱柱的使用寿命为5年。

本技术的关键是一种基于HPLC-DAD法测定甲磺酸伊马替尼及其杂质含量的方法，采 用C18色谱柱，以甲醇—三乙胺水溶液为流动相（体积百分浓度为0.5%～1%），流动相的 pH值为7.5～11，梯度洗脱（洗脱程序为0～55min，65%→15%三乙胺水溶液），流速为 0.8～1.2mL/min，检测波长为268nm。此色谱条件下，各组分之间分离度均大于2.0，线性范 围9.09～90.92μg/mL(r=0.9998)，检测限为0.3ng。