生物碱类化合物在制抗肠道病毒及乙酰胆碱酯酶抑制剂药物中的应用

摘要

本发明公开了生物碱类化合物在制抗肠道病毒及乙酰胆碱酯酶抑制剂药物中的应用。本发明从节菱孢Arthrinium sp.ZSDS1-F3中制备得到三个具有抗乙酰胆碱酯酶和抗病毒活性的化合物1，2和3（如式（Ⅰ）所示，化合物1：R=X；或化合物2：R=Y；或化合物3：R=Z），可用于开发抗病毒和乙酰胆碱酯酶抑制剂药物，因此本发明为开发新的抗病毒和乙酰胆碱酯酶抑制剂药物提供了备选化合物，对开发中国海洋药物资源具有重要的意义。

说明书

技术领域：

本发明属于海洋天然产物领域，具体涉及生物碱类化合物在制抗肠道病毒及乙酰胆碱酯酶抑制剂药物中的应用。 

背景技术：

手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)是由肠道病毒感染引起的常见的传染病，见于全球各地，此病多发生于5岁以内儿童，能引起手掌、脚掌、口腔黏膜处发生疱疹，起病时多有发热，伴有咽部疼痛。一般预后良好，少数病例可累及中枢神经系统，引发心肌炎、无菌性脑膜炎、神经源性肺水肿等严重并发症甚至死亡。此病传染性很强，主要通过粪-口途径以及呼吸道飞沫传播，或经接触患者皮肤、黏膜的疱疹液而感染。全球自20世纪70年代发现肠道病毒(EV71)起，先后有3次大范围的由EV71感染所致的HFMD大流行，特别是1998年台湾地区的大流行，共监测到129106例病例，重症405例，死亡78例。 

同时，老年性痴呆病是一种神经退化性的疾病，严重危害老年人的健康和生活质量，患病后会使病人逐渐丧失学习和记忆能力，产生严重的生活自理障碍并导致死亡。阿尔茨海默病或称老年性痴呆病(Alzheimer’s Disease,AD)是老年性痴呆病的一种主要类型，约有50%属于该类型。AD的发病机理复杂，其病因之一是与乙酰胆碱(Ach)、兴奋性氨基酸等多种神经递质紊乱有关，其中胆碱能系统功能缺陷尤为突出。大量的研究结果表明，通过增强胆碱能系统功能，提高患者脑神经组织中的乙酰胆碱的含量，从而达到改善AD患者的临床症状。乙酰胆碱酯酶抑制剂(AchEI)被认为是至今治疗老年痴呆最有效的药物。 

天然产物及其活性衍生物在药物开发过程中仍然具有不可替代的作用。海洋真菌能产生 多种多样具有不同生理活性的代谢产物，如抗肿瘤、抗病毒、抗细菌、抗真菌、抗虫、酶抑制剂等生物活性。从海洋真菌中寻找活性化合物已经成为天然药物研发的一个热点。 

发明内容：

本发明的第一个目的是提供生物碱类化合物在制抗肠道病毒或乙酰胆碱酯酶抑制剂药物中的应用。 

所述的生物碱类化合物，其结构如式（Ⅰ）： 

式（Ⅰ）中，化合物1：R=X；化合物2：R=Y；化合物3：R=Z。 

通过对式（Ⅰ）中的化合物1，化合物2和化合物3的抗病毒活性评价，发现化合物1对肠道病毒(EV71)具有很强的抑制作用(IC₅₀:0.86μM),与阳性药Ribavirin活性相当(IC₅₀:0.60μM)，可以做为抗人肠道病毒(EV71)药物的先导化合物。通过对化合物1，化合物2和化合物3的抗乙酰胆碱酯酶活性评价，发现化合物1，化合物2和化合物3对乙酰胆碱酯酶都具有抑制作用(IC₅₀均<60μM)，尤其是化合物2对乙酰胆碱酯酶具有很强的抑制作用(IC₅₀:0.81μM),与阳性药Tacrine活性相当(IC₅₀:0.48μM)，可以做为乙酰胆碱酯酶抑制剂药物的先导化合物。 

因此，本发明的第一个目的是提供如式（Ⅰ）所示的化合物1或化合物2或化合物3，或它们的盐在制备乙酰胆碱酯酶抑制剂药物中的应用。 

本发明的第二个目的是提供一种乙酰胆碱酯酶抑制剂药物，其特征在于，包含有效量的作为活性成份的如式（Ⅰ）所示的化合物1或化合物2或化合物3，或它们的盐，和药学上可以接受的载体。 

本发明的第三个目的是提供如式（Ⅰ）所示的化合物1或其盐在制备抗人肠道病毒(EV71)药物中的应用。 

本发明的第四个目的是提供一种抗人肠道病毒药物，其特征在于，包含有效量的作为活性成分的如式（Ⅰ）所示的化合物1或其盐。 

本发明的如式（Ⅰ）所示的化合物1、化合物2和化合物3具有抗乙酰胆碱酯酶活性，化合物1还具有抗人肠道病毒(EV71)活性，可用于开发抗病毒药物和乙酰胆碱酯酶抑制剂药物，因此本发明为开发新的抗病毒药物和乙酰胆碱酯酶抑制剂药物提供了备选化合物，对开发中国海洋药物资源具有重要的意义。 

本发明的节菱孢Arthrinium sp.ZSDS1-F3于2013年12月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中科院微生物研究所，邮编：100101，保藏号为：CGMCC No.8652。 

附图说明：

图1：化合物1主要HMBC和NOESY信息； 

图2：化合物2主要HMBC和NOESY信息； 

图3：化合物1，2和3的CD图谱 

图4：化合物2与乙酰胆碱酯酶(AchE)分子对接图。 

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。 

实施例1：化合物1或化合物2或化合物3的制备和结构鉴定 

一、如式（Ⅰ）所示的化合物1或化合物2或化合物3的制备 

1.微生物培养条件： 

每1000mL培养基是这样配制的：取山梨醇20g，麦芽糖20g，味精10g，蛋白胨3g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.3g，然后溶于适量的水中，用水定容至1000mL，121℃高温灭菌20min，备用。 

将节菱孢Arthrinium sp.ZSDS1-F3接种到上述培养基中，28℃条件下摇床培养3天，得种子培养液，再将种子培养液接种到上述培养基中，28℃条件下摇床培养12天，得到节菱孢Arthrinium sp.ZSDS1-F3的发酵产物。 

2.提取分离： 

将上述节菱孢Arthrinium sp.ZSDS1-F3的发酵产物，以3600rpm离心，得上清发酵液和沉淀菌丝体。上清发酵液用乙酸乙酯等体积萃取3次，乙酸乙酯萃取液在低于40℃减压浓缩得发酵液浸膏；沉淀菌丝体用体积分数85%的丙酮水溶液超声浸提，提取液经减压蒸馏后，再用乙酸乙酯反复萃取三次，乙酸乙酯萃取液在低于40℃下减压浓缩得菌丝体浸膏；合并发酵液浸膏和菌丝体浸膏共计得约95.0g浸膏。该浸膏用300-400目硅胶分离，经拌样、干法装柱后，采用二氯甲烷：甲醇(100:0,99:1,98:2,97:3,95:5,90:10,80:20,50:50,0:100,v/v)梯度洗脱顺序得9个组分(fr1-fr9)。组分fr4（二氯甲烷：甲醇97：3v/v洗脱的组份）经Sephadex LH-20 柱层析，以甲醇为洗脱剂，洗脱纯化后的产物，以230和315nm波长做检测、采用4ml/min的流速，以乙腈：水（50:50,v/v）进行等梯度洗脱进行半制备高效液相分离，HPLC(Sunfire,Prep C₁₈OBD,10×250mm,5μm)，得到化合物1（104.7mg，保留时间t_R10.3min）和化合物3（533.2mg,保留时间t_R16.7min）。组分fr5（二氯甲烷：甲醇95：5v/v洗脱的组份）经Sephadex LH-20柱层析，以甲醇为洗脱剂，洗脱纯化后的产物，以230和315nm波长做检测、采用4ml/min的流速，以乙腈：水（55:45,v/v）进行等梯度洗脱进行半制备高效液相分离，HPLC(Sunfire,Prep C₁₈OBD,10×250mm,5μm)，得到化合物2（8.0mg，保留时间t_R20.5min）。 

二、化合物1和化合物2和化合物3的结构鉴定 

对化合物1和化合物2和化合物3进行质谱（MS）、核磁共振（NMR）、旋光（OR）和圆二色谱（CD）等数据测试，从而确定化合物的化学结构。 

化合物3:淡黄色油状物;低分辨质谱(+)-ESIMS在m/z446[M+H]⁺处出现分子离子峰；¹H和¹³C NMR数据见表1;NMR数据与文献[J.Antibiot.1996,49,693-696,化合物1]报道的基本一致；旋光数据OR(c2.2,MeOH)–56.3°确定化合物3的立体构型亦与文献[J.Antibiot.1996,49,693-696中的化合物1]报道的基本一致，因此化合物3鉴定为与文献[J.Antibiot.1996,49,693-696中的化合物1]中报道的化合物相同。 

化合物1:淡黄色油状物;高分辨质谱HRESIMS m/z462.2125[M–H]^–(calcd for C₂₄H₃₂NO₈),建议分子式为C₂₄H₃₃NO₈；¹H和¹³C NMR数据见表1，化合物1的NMR数据与化合物2的NMR数据有很大的相似，只有部分（环己烷片段）信号不同：¹³C NMR图谱中化合物1的C-20和C-21化学位移相对于化合物3向低场移动，说明化合物1的C-20和C-21 可能连接的基团是羟基，而不再如化合物1的环氧结构。HMBC和¹H-¹H COSY信息证实了化合物1的结构。化合物1的NOESY图谱、旋光数据OR(c1.0,MeOH)–65.5°和圆二色谱数据CD(c0.01,MeOH)(Δε)215(-5.43),266(+0.86),318(+2.57)确定化合物1的立体构型与化合物3旋光数据OR(c2.2,MeOH)–56.3°和CD(c0.01,MeOH)(Δε)215(-2.14),272(+3.43),314(+4.86)一致，为结构崭新的化合物，命名为arthpyrone A。化合物1主要HMBC和NOESY信息见图1，化合物1和化合物3的CD图谱见图3。 

化合物2:淡黄色油状物;高分辨质谱HRESIMS m/z460.2320[M+H]⁺(calcd for C₂₅H₃₄NO₇),建议分子式为C₂₅H₃₃NO₇；¹H和¹³C NMR数据见表1，化合物2的NMR数据与化合物3的NMR数据也有很大的相似，只有部分信号不同：¹H NMR图谱中化合物2相对于化合物3仅在高场区多了一个甲氧基氢信号（δ_H3.10），说明化合物2比化合物3多一个甲氧基，而少一个羟基。HMBC和¹H-¹H COSY信息证实了化合物2的结构。化合物2的NOESY图谱、旋光数据OR(c0.7,MeOH)–68.0°和圆二色谱数据CD(c0.01,MeOH)(Δε)278(+2.57),314(+2.64)确定化合物2的立体构型与化合物3旋光数据OR(c2.2,MeOH)–56.3°和CD(c0.01,MeOH)(Δε)215(-2.14),272(+3.43),314(+4.86)一致，为结构崭新的化合物，命名为arthpyrone B。化合物2主要HMBC和NOESY信息见图2，化合物2和化合物3的CD图谱见图3。 

表1：化合物1,2和3的¹H和¹³C NMR数据(MeOD,500MHz) 

根据以上理化数据分析可知，化合物1和化合物2和化合物3的具体结构如式（Ⅰ）所示。 

式（Ⅰ）中，化合物1：R=X；化合物2：R=Y；化合物3：R=Z。 

实施例2：化合物1和化合物2和化合物3的抗人肠道病毒(EV71)活性的实验数据 

采用国际通用的人肠道病毒(EV71)为筛选模型，以抗病毒药物Ribavirin为阳性对照，试验方法为国际通用的CCK-8法。化合物1和化合物2和化合物3对人肠道病毒(EV71)的抑制活性数据如表2所示。 

表2：化合物1,2和3在对人肠道病毒(EV71)的抑制活性（IC₅₀） 

上述实验结果表明，化合物1对人肠道病毒(EV71)具有很强的抑制作用，且从IC₅₀数值来看，可以认为化合物1对人肠道病毒(EV71)的抑制活性与阳性药Ribavirin相当，可以做为治疗人肠道病毒(EV71)药物开发的先导化合物。对我国海洋微生物药物资源的开发利用具有重要意义。 

实施例3：化合物1、化合物2和化合物3的抗乙酰胆碱酯酶抑制活性的实验数据 

采用改进的Ellman法分析化合物1,2和3对乙酰胆碱酯酶的抑制活性。以乙酰胆碱酯酶 抑制剂药物Tacrine为阳性对照。化合物1、化合物2和化合物3对乙酰胆碱酯酶的抑制活性如表3所示。 

表3：化合物1,2和3在对乙酰胆碱酯酶的抑制活性（IC₅₀） 

上述实验结果表明，化合物1，2和3对乙酰胆碱酯酶的抑制作用虽然弱于抗老年痴呆药物Tacrine，但从IC₅₀数值来看，可以认为具有较强的抗乙酰胆碱酯酶抑制活性。特别是化合物2对乙酰胆碱酯酶的抑制活性与阳性药Tacrine相当，可以做为治疗老年痴呆药物开发的先导化合物。运用AUTODOCK对接与PyMOL观测程序对抑制活性最强的化合物2与AchE(PDB code:1ACJ)进行了分子对接，结果如图4所示。分子对接研究表明，在2-AchE的复合体中，化合物2与乙酰胆碱酯酶活性口袋中的3个氨基酸残基(TYR133,TYR337和GLN71)有氢键作用，对接能为–8.5kcal/kj。这些研究结论为开发乙酰胆碱酯酶抑制剂药物提供了重要依据，同时对我国海洋微生物药物资源的开发利用具有重要意义。