突变检测用探针、突变检测方法、药效评价方法以及突变检测用试剂盒

摘要

本发明提供简便地检测ALK基因的突变、特别是ALK（L1196M）突变型和ALK（C1156Y）突变型的突变检测用探针。本发明涉及用于检测ALK基因的突变的突变检测用探针，其为选自由P1～P4、P7和P8组成的组中的至少一种荧光标记寡核苷酸。

说明书

技术领域

本发明涉及突变检测用探针、突变检测方法、药效评价方法以及 突变检测用试剂盒。

背景技术

作为肺癌的发病原因之一，可列举基因突变。因此，正在推进被 认为参与肺癌发病的基因的确定。作为这种被认为参与肺癌发病的基 因突变，可列举EGFR基因突变和ALK基因突变。

已知ALK（anaplastic lymphoma kinase：间变性淋巴瘤激酶）基因 是编码受体型酪氨酸激酶的基因，在2号染色体内发生倒位时，与 EML4基因融合。认为由于该融合基因（EML4-ALK），产生组成性活 化酪氨酸激酶而导致肺腺癌的发病。由此，正在尝试在肺癌治疗领域 使用ALK抑制剂。作为这种ALK抑制剂，已知克里唑蒂尼（crizotinib）。

但是，对于克里唑蒂尼而言，虽然在初期确认到一定的治疗效果， 但存在药剂的效果不会逐渐上升至所期待的效果以上的情况。

关于这样的抑制活性的表现，发现EML4-ALK内发生的两个基因 突变、即ALK基因的氨基酸序列中第1156位的半胱氨酸置换为酪氨 酸的突变（以下有时称为“ALK（C1156Y）”）和ALK基因的氨基酸 序列中第1196位的亮氨酸置换为蛋氨酸的突变（以下有时称为“ALK （L1196M）”）参与其中（参照非专利文献1）。明确了显示出如下 共同的特性：这些基因突变在EML4-ALK内的克里唑蒂尼结合袋位点 发生，结果使结合袋的形状发生变化，从而使克里唑蒂尼与EML4-ALK 的结合亲和性下降。因此，在使用ALK抑制剂时，检测作为用于预测 其效果的预测因子的这些ALK基因突变的有无变得重要。

另一方面，近年来，作为检测基因突变的检测试验，进行利用熔 解曲线分析（Tm分析）的检测。该方法中，通过PCR法扩增含有突 变的区域后，使用被荧光染料标记的核酸探针进行熔解曲线分析，基 于熔解曲线分析的结果来分析碱基序列的突变（例如，参照专利文献 1）。

专利文献

专利文献1：日本特开2002-119291号公报

非专利文献

非专利文献1：New England Journal of Medicine,Vol.363, pp.1734-1739(2010)

发明内容

发明所要解决的问题

非专利文献1中，通过基于各序列直接检测各基因突变的所谓直 接测序法进行检测，在进行DNA的提取纯化和PCR后，进行测序反 应，必须利用测序仪进行电泳等，耗时耗力或成本高。另外，扩增产 物有可能污染其他的反应（contamination）。此外，难以自动化，不能 同时检测多个核酸序列。

专利文献1中记载了使用被荧光染料标记的核酸探针与靶核酸杂 交并测定荧光染料发光的减少量的方法。但是，在使用被荧光染料标 记的核酸探针与靶核酸杂交并实施荧光染料发光的减少量测定时，并 非任意序列的情况下均能实施，对于每个突变，需要找到合适的序列。

基于这样的现状，为了预测ALK抑制剂的效果等目的，期待开发 用于检测ALK（L1196M）突变型和ALK（C1156Y）突变型的ALK 基因中的突变的有效的技术。

本发明的课题在于，提供能够简便地检测ALK基因中的突变的突 变检测用探针、使用该突变检测用探针的突变检测方法和药效评价方 法、以及突变检测用试剂盒。

用于解决问题的方法

本发明如下。

[1]一种用于检测ALK基因中的突变的突变检测用探针，其为选 自由下述寡核苷酸组成的组中的至少一种荧光标记寡核苷酸：

（P1）寡核苷酸，具有序列号5所示的碱基序列，且3’末端的胞 嘧啶被荧光染料标记；

（P2）寡核苷酸，具有序列号6所示的碱基序列，且3’末端的胞 嘧啶被荧光染料标记；

（P3）寡核苷酸，具有序列号7所示的碱基序列，且5’末端的胞 嘧啶被荧光染料标记；

（P4）寡核苷酸，具有序列号8所示的碱基序列，且3’末端的胞 嘧啶被荧光染料标记；

（P7）寡核苷酸，具有序列号9所示的碱基序列，且5’末端的胞 嘧啶被荧光染料标记；以及

（P8）寡核苷酸，具有序列号10所示的碱基序列，且3’末端的胞 嘧啶被荧光染料标记。

[2]如[1]所述的突变检测用探针，所述荧光标记寡核苷酸在未与 靶序列杂交时发出荧光，并且与靶序列杂交后的荧光强度与未杂交时 的荧光强度相比减少或增加。

[3]如[2]所述的突变检测用探针，所述荧光标记寡核苷酸在未与 靶序列杂交时发出荧光，与靶序列杂交后的荧光强度与未杂交时的荧 光强度相比减少。

[4]如[1]～[3]中任一项所述的突变检测用探针，其为熔解曲线分 析用探针。

[5]一种ALK基因的突变检测方法，包括：使用[1]～[4]中任一项 所述的突变检测用探针，检测序列号1所示的碱基序列的第133位碱 基的突变和序列号3所示的碱基序列的第244位碱基的突变中的至少 一种突变。

[6]如[5]所述的突变检测方法，包括：在同一体系中检测序列号1 所示的碱基序列的第133位碱基的突变和序列号3所示的碱基序列的 第244位碱基的突变中的至少一种突变。

[7]如[5]或[6]所述的突变检测方法，包括：

（I）使[1]～[4]中任一项所述的突变检测用探针和试样中的单链核 酸接触，从而使所述荧光标记寡核苷酸和所述单链核酸杂交而得到杂 交体；

（II）通过改变含有所述杂交体的试样的温度来使所述杂交体解 离，并测定基于所述杂交体的解离的荧光信号的变动；

（III）基于所述荧光信号的变动来测定作为杂交体的解离温度的 Tm值；以及

（IV）基于所述Tm值来检测所述试样中的单链核酸中的ALK基 因的突变的存在。

[8]如[7]所述的突变检测方法，还包括：在得到所述（I）的杂交 体之前或者在得到所述（I）的杂交体的同时扩增核酸。

[9]如[7]所述的突变检测方法，包括：

使用[1]～[4]中任一项所述的突变检测用探针检测序列号1所示的 碱基序列的第133位碱基的突变；以及

使用以下的P5引物和P6引物扩增核酸：

（P5）具有序列号14所示的碱基序列的引物、

（P6）具有序列号15所示的碱基序列的引物。

[10]一种药剂的药效评价方法，包括：通过[5]～[9]中任一项所述 的突变检测方法检测ALK基因中的突变以及基于测得的突变的有无评 价对药剂的耐受性或药剂的药效。

[11]一种检测ALK基因中的突变的突变检测用试剂盒，包含[1]～ [4]中任一项所述的突变检测用探针。

[12]如[11]所述的突变检测用试剂盒，还包含以下引物中的至少 一者：

用于扩增含有与所述P1、P2、P3、P7或P8寡核苷酸杂交的区域 的碱基序列的引物、以及

用于扩增含有与所述P4寡核苷酸杂交的区域的碱基序列的引物。

[13]一种寡核苷酸，其为下述任意一种荧光标记寡核苷酸：

具有序列号5所示的碱基序列且3’末端的胞嘧啶被荧光染料标记 的寡核苷酸；

具有序列号6所示的碱基序列且3’末端的胞嘧啶被荧光染料标记 的寡核苷酸；

具有序列号7所示的碱基序列且5’末端的胞嘧啶被荧光染料标记 的寡核苷酸；

具有序列号8所示的碱基序列且3’末端的胞嘧啶被荧光染料标记 的寡核苷酸；

具有序列号9所示的碱基序列且5’末端的胞嘧啶被荧光染料标记 的寡核苷酸；

具有序列号10所示的碱基序列且3’末端的胞嘧啶荧光染料标记的 寡核苷酸。

发明效果

根据本发明，可以提供能够简便地检测ALK基因中的突变的ALK 基因的突变检测用探针、使用该突变检测用探针的突变检测方法和药 效评价方法、以及突变检测用试剂盒。

附图说明

图1（A）是核酸混合物的熔解曲线的一例，图1（B）是微分熔 解曲线的一例。

图2（A）～（B）是表示本发明实施例1的使用试样ID：A时的 Tm分析结果的曲线图。

图3（A）～（B）是表示本发明实施例1的使用试样ID：B时的 Tm分析结果的曲线图。

图4（A）～（B）是表示本发明实施例1的使用试样ID：C时的 Tm分析结果的曲线图。

图5（A）～（B）是表示本发明实施例1的以全血作为试样时的 Tm分析结果的曲线图。

图6（A）～（D）是表示本发明实施例2的Tm分析结果的曲线 图。

图7是表示本发明比较例1的Tm分析结果的曲线图。

图8是表示本发明比较例2的Tm分析结果的曲线图。

图9是表示本发明比较例3的Tm分析结果的曲线图。

图10是表示本发明实施例3的Tm分析结果的曲线图。

图11是表示本发明比较例4的Tm分析结果的曲线图。

图12是表示本发明实施例4的Tm分析结果的曲线图。

图13是表示本发明实施例5的Tm分析结果的曲线图。

图14是表示本发明比较例5的Tm分析结果的曲线图。

图15是表示本发明比较例6的Tm分析结果的曲线图。

具体实施方式

本发明的ALK基因的突变检测用探针（以下有时仅称为“突变检 测用探针”），以选自由上述P1、P2、P3、P4、P7和P8各荧光标记 寡核苷酸组成的组的至少一种荧光标记寡核苷酸作为突变检测用探 针。

本发明的ALK基因的突变检测方法是包括使用上述突变检测用 探针检测序列号1所示的碱基序列的第133位碱基的突变和序列号3 所示的碱基序列的第244位碱基的突变中的至少一种突变的突变检测 方法。

本发明的药效评价方法是包括通过上述ALK基因的突变检测方 法检测ALK基因中的突变以及基于测得的突变的有无评价对药剂的耐 受性或药剂的药效的药剂的药效评价方法。

另外，本发明的突变检测用试剂盒是包含上述突变检测用探针的 检测ALK基因中的突变的突变检测用试剂盒。

即，在本发明中，通过设计包含与显示突变的碱基对应的碱基且 在特定位置具有荧光标记了的胞嘧啶的荧光标记寡核苷酸作为突变检 测用探针，能够应用于熔解曲线分析等能够自动检测的检测方法，并 且能够实现作为目的的简便地检测ALK基因突变。另外，通过使用该 突变检测用探针，能够简便地进行基于ALK基因突变的药效评价。

本发明的“ALK基因”已公知，其碱基序列相当于NCBI的 Reference Sequence：NC_000002.11中第29415640位碱基～第30144477 位碱基的序列。需要说明的是，在本说明书中，如无特别限定，则“ALK 基因”是指序列号2或序列号4所示的碱基序列。

序列号1的碱基序列是将NCBI的Reference Sequence： NT_022184.15中第8265650位碱基～第8265351位碱基作为第1～300 位碱基、并使与第8265518位碱基对应的第133位碱基为“A（腺嘌呤）” 的突变型碱基序列。

序列号2的碱基序列是将NCBI的Reference Sequence： NT_022184.15中第8265650位碱基～第8265351位碱基作为第1～300 位碱基、并使与第8265518位碱基对应的第133位碱基为“C（胞嘧啶）” 的野生型碱基序列。

另外，序列号3的碱基序列是将NCBI的Reference Sequence： NT_022184.15中第8267388位碱基～第8267089位碱基作为第1～300 位碱基、并使与第8267145位碱基对应的第244位碱基为“A（腺嘌呤）” 的突变型碱基序列。

另外，序列号4的碱基序列是将NCBI的Reference Sequence： NT_022184.15中第8267388位碱基～第8267089位碱基作为第1～300 位碱基、并使与第8267145位碱基对应的第244位碱基为“G（鸟嘌呤）” 的野生型碱基序列。

本发明中，关于作为检测对象的试样中的试样核酸、突变检测用 探针或引物各自的序列，只要没有特殊说明，基于它们彼此互补的关 系所记载的事项对于各个序列和相对于各序列互补的序列也适用。在 将本发明的事项适用于相对于各序列互补的该序列时，在本领域技术 人员的技术常识范围内，在整个说明书中将该互补的序列识别的序列 替换为与对应本说明书中记载的序列互补的序列。

本发明中，“Tm值”是指双链核酸解离的温度（解离温度：Tm）， 通常定义为260nm处的吸光度达到吸光度总上升量的50％时的温度。 即，加热含有双链核酸、例如双链DNA的溶液时，260nm处的吸光度 上升。这是因为，双链DNA中两条链之间的氢键由于加热而打开，从 而解离为单链DNA（DNA的熔解）。而且，当所有的双链DNA解离 而变为单链DNA时，其吸光度显示为加热开始时的吸光度（仅双链 DNA的吸光度）的约1.5倍，由此能够判断熔解结束。Tm值是基于该 现象而设定的。若无特别限定，本发明中的Tm值是指260nm处的吸 光度达到吸光度总上升量的50％时的温度。

本说明书中计算Tm值时，若无特别限定，所得到的Tm值是指使 用软件“Meltcalc99free”（http://www.meltcalc.com/）在设定条件： Oligoconc[μM]0.2、Na eq.[mM]50的条件下计算出的值。该软件是本领 域公知的软件，在Clinical Chemistry Vol.54,No.6,pp.990-999(2008)等 中也被用于探针的设计。

本发明中，关于寡核苷酸的序列，当称为“从3’末端开始数第1～ 3位”时，是将寡核苷酸链的位于3’末端的碱基作为第1位开始数的。 同样，当称为“从5’末端开始数第1～3位”时，是将寡核苷酸链的位 于5’末端的碱基作为第1位开始数的。

本发明中，作为上述荧光标记寡核苷酸中的“寡核苷酸”，除了 寡核苷酸之外，还包括经修饰的寡核苷酸。

作为上述寡核苷酸的构成单元，可列举核糖核苷酸、脱氧核糖核 苷酸、人工核酸等。作为上述人工核酸，可列举DNA、RNA、作为RNA 类似物的LNA（Locked Nucleic Acid）；作为肽核酸的PNA（Peptide  Nucleic Acid）；作为交联核酸的BNA（Bridged Nucleic Acid）等。

上述寡核苷酸可以由上述构成单元中的一种构成单元构成，也可 以由上述构成单元中的多种构成单元构成。

本发明中的杂交可以根据公知的方法或基于其的方法、例如 Molecular Cloning3rd（J.Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Lab.Press， 2001）中记载的方法等进行。该文献通过参考被引入本说明书中。

本说明书中的“步骤”一词，不仅包括独立的步骤，即使在不能 与其他步骤明确区分时只要能达到该步骤预期的目的，则也包括在本 用语之内。

另外，本发明中使用“～”表示的数值范围，表示包含“～”前 后记载的数值分别作为最小值和最大值的范围。

此外，本发明中，组合物中各成分的量，在组合物中存在多种相 当于各成分的物质的情况下，若无特别的限定，则是指组合物中存在 的该多种物质的合计量。

本说明书中的突变是指野生型碱基序列的一部分碱基因置换、缺 失、重复或插入而生成的新的碱基序列。

下面对本发明进行说明。

＜ALK基因突变检测用探针＞

本发明的ALK基因的突变检测用探针（以下也仅称为“突变检测 用探针”）是选自由上述P1、P2、P3、P4、P7和P8组成的组中的至 少一种荧光标记寡核苷酸的用于检测ALK基因的突变的突变检测用探 针。

在ALK基因的野生型中，与序列号1所示的序列中第133位对应 的碱基为C（胞嘧啶），但在突变型中突变为A（腺嘌呤）（以下也称 为“ALK（L1196M）突变型”），该碱基相当于ALK基因的第8265650 位碱基～第8265351位碱基中的第8265518位碱基。

在ALK基因的野生型中，与序列号3所示的序列中的第244位对 应的碱基为G（鸟嘌呤），但在突变型中突变为A（腺嘌呤）（以下也 称为“ALK（C1156Y）突变型”），该碱基相当于ALK基因的第8267388 位碱基～第8267089位碱基中的第8267145位碱基。

上述P1、P2、P3、P7和P8的荧光标记寡核苷酸是能够检测ALK （L1196M）突变的探针，上述P4的荧光标记寡核苷酸是能够检测ALK （C1156Y）突变的探针。通过使用这些荧光标记寡核苷酸突变检测用 探针，能够检测ALK基因中的突变。

将上述P1、P2、P3、P4，P7和P8的荧光标记寡核苷酸的碱基序 列示于表1。

P1的寡核苷酸是与由序列号1所示的碱基序列中第123位～第 139位碱基构成的碱基长度17的碱基序列互补的序列，具有与第123 位碱基对应的碱基为胞嘧啶的碱基序列。P1的荧光标记寡核苷酸中， 作为成为P1的寡核苷酸的3’末端的与序列号1所示的碱基序列的第 123位碱基对应的碱基的胞嘧啶被荧光染料标记。

P2的寡核苷酸是由序列号1所示的碱基序列中第123位～第141 位碱基构成的碱基长度19的碱基序列，具有与第141位碱基对应的碱 基为胞嘧啶的碱基序列。P2的荧光标记寡核苷酸中，作为成为P2的寡 核苷酸的3’末端的与序列号1所示的碱基序列的第141位碱基对应的 碱基的胞嘧啶被荧光染料标记。

P3的寡核苷酸是与由序列号2所示的碱基序列中第123位～第 138位碱基构成的碱基长度16的碱基序列互补的序列，具有与第138 位碱基对应的碱基为胞嘧啶的碱基序列。P3的荧光标记寡核苷酸中， 作为成为P3的寡核苷酸的5’末端的与序列号2所示的碱基序列的第 138位碱基对应的碱基的胞嘧啶被荧光染料标记。

P4的寡核苷酸是由序列号3所示的碱基序列中第235位～第252 位碱基构成的碱基长度18的碱基序列，具有与第252位碱基对应的碱 基为胞嘧啶的碱基序列。P4的荧光标记寡核苷酸中，作为成为P4的寡 核苷酸的3’末端的与序列号3所示的碱基序列的第252位碱基对应的 碱基的胞嘧啶被荧光染料标记。

P7的寡核苷酸是与由序列号1所示的碱基序列中第129位～第 145位碱基构成的碱基长度17的碱基序列互补的序列，具有与第129 位碱基对应的碱基为胞嘧啶的碱基序列。P7的荧光标记寡核苷酸中， 作为成为P7的寡核苷酸的5’末端的与序列号1所示的碱基序列的第 129位碱基对应的碱基的胞嘧啶被荧光染料标记。

P8的寡核苷酸是由序列号1所示的碱基序列中第129位～第146 位碱基构成的碱基长度18的碱基序列，具有与第146位碱基对应的碱 基为胞嘧啶的碱基序列。P8的荧光标记寡核苷酸中，作为成为P8的寡 核苷酸的3’末端的与序列号1所示的碱基序列的第146位碱基对应的 碱基的胞嘧啶被荧光染料标记。

需要说明的是，在表1中，对于P1、P2、P3、P7和P8，将与序 列号1的第133位碱基对应的碱基用大写字母表示。另外，计算与序 列号1的第133位对应的碱基为C（野生型）或A（突变型）的试样核 酸与各荧光标记寡核苷酸的杂交体的Tm值，并一并示出。

此外，表1中，关于P4，将与序列号3的第244位碱基对应的碱 基用大写字母表示。另外，将与序列号3的第244位对应的碱基为G （野生型）或A（突变型）的试样核酸与各荧光标记寡核苷酸的杂交 体的Tm值一并示出。

表1

⊿值：Ｔｍ值之差，下同

需要说明的是，即使是具有本发明的突变检测用探针中的上述P1、 P2、P3、P4、P7和P8的荧光标记寡核苷酸的各碱基序列经延长、缩 短、插入、缺失或置换1个～3个碱基而得到的碱基序列的荧光标记寡 核苷酸，也可能存在能够与本发明的突变检测用探针同样地检测ALK （L1196M）突变或ALK（C1156Y）突变的探针。上述本发明的突变 检测用探针和具有延长、缩短、插入、缺失或置换了1个～3个碱基的 碱基序列的荧光标记寡核苷酸探针中能够检测突变的突变检测用探针 也包括在本发明中。

具有本发明的突变检测用探针中的P1、P2、P3、P7和P8的荧光 标记寡核苷酸的各碱基序列经延长、缩短、插入、缺失或置换1个～3 个碱基而得到的碱基序列的荧光标记寡核苷酸、且识别序列号1中第 133位的突变的探针中能够检测突变的突变检测用探针也包括在本发 明中。

其中，“识别序列号1中第133位的突变”等表述的含义是“与 显示序列号1中第133位的突变的碱基结合”。

具有本发明的突变检测用探针中的P4的荧光标记寡核苷酸的碱 基序列经延长、缩短、插入、缺失或置换1～3个碱基而得到的碱基序 列的荧光标记寡核苷酸、且识别序列号3中第244位的突变的探针中 能够检测突变的突变检测用探针也包括在本发明中。

其中，“识别序列号3中第244位的突变”等表述的含义是“与 显示序列号3中第244位的突变的碱基结合”。

本发明的上述荧光标记寡核苷酸可以是与未与靶序列杂交时的荧 光强度相比、与靶序列杂交时的荧光强度减少（淬灭）或增加的荧光 标记寡核苷酸。也可以是其中与未与靶序列杂交时的荧光强度相比、 与靶序列杂交时的荧光强度减少的荧光标记寡核苷酸。

利用了这样的荧光淬灭现象（Quenching phenomenon）的探针通 常被称为鸟嘌呤淬灭探针，已知所谓的Q Probe（注册商标）。其中， 可列举如下寡核苷酸：将寡核苷酸设计成3’末端或5’末端为胞嘧啶 （C），且该末端的C被荧光染料标记而在靠近鸟嘌呤（G）时发光变 弱。

使用这样的探针时，可以根据信号的变动容易地确认杂交和解离。

需要说明的是，除了使用Q Probe的检测方法之外，还可以使用 公知的检测方式。作为这样的检测方式，可列举Taq-man Probe法、 Hybridization Probe法、Moleculer Beacon法或MGB Probe法等。

作为上述荧光染料，没有特别的限制，可以列举例如荧光素、磷 光体、罗丹明、聚甲炔染料衍生物等。作为这些荧光染料的市售品， 可以列举例如Pacific Blue、BODIPY FL、FluorePrime、Fluoredite、FAM、 Cy3和Cy5、TAMRA等。

荧光标记寡核苷酸的检测条件没有特别的限制，可以根据所使用 的荧光染料适当确定。例如，Pacific Blue可在检测波长445nm～480nm 处检测，TAMRA可在检测波长585nm～700nm处检测，BODIPY FL 可在检测波长520nm～555nm处检测。

使用具有这样的荧光染料的探针时，可以根据各荧光信号的变动 容易地确定杂交和解离。荧光染料与寡核苷酸的结合可以根据通常的 方法、例如日本特开2002-119291号公报等中记载的方法进行。

另外，上述荧光标记寡核苷酸例如也可以在3’末端添加磷酸基团。 通过预先使磷酸基团添加在荧光标记寡核苷酸的3’末端，能够充分抑 制探针本身由于基因扩增反应而延长。如后所述，检测有无突变的DNA （靶DNA）可以通过PCR等基因扩增法来制备。此时，通过使用3’ 末端添加有磷酸基团的荧光标记寡核苷酸，能够使其共存于扩增反应 的反应液中。

另外，通过在3’末端添加上述的标记物质（荧光染料），也能够 得到同样的效果。

上述P1、P2、P3、P7和P8的荧光标记寡核苷酸可以作为检测ALK 基因中的突变、特别是ALK（L1196M）突变型的ALK基因突变检测 用探针使用，另外，ALK基因突变检测用探针可以作为熔解曲线分析 用探针使用。

上述P4的荧光标记寡核苷酸可以作为检测ALK基因中的突变、 特别是ALK（C1156Y）突变型的ALK基因突变检测用探针使用，另 外，ALK基因突变检测用探针可以作为熔解曲线分析用探针使用。

需要说明的是，就上述P1、P2、P3、P7和P8的荧光标记寡核苷 酸而言，上述P1的荧光标记寡核苷酸的与序列号1所示的碱基序列中 第123位碱基对应的碱基为胞嘧啶，上述P2的荧光标记寡核苷酸的与 序列号1所示的碱基序列中第141位碱基对应的碱基为胞嘧啶，上述 P3的荧光标记寡核苷酸的与序列号1所示的碱基序列中第138位碱基 对应的碱基为胞嘧啶，上述P7的荧光标记寡核苷酸的与序列号1所示 的碱基序列中第145位碱基对应的碱基为胞嘧啶，上述P8的荧光标记 寡核苷酸的与序列号1所示的碱基序列中第146位碱基对应的碱基为 胞嘧啶，且该胞嘧啶使用被荧光染料标记的碱基，除此之外，可以根 据作为寡核苷酸的合成方法已知的公知的方法、例如日本特开 2002-119291号公报等中记载的方法制作。

另外，就上述P4的荧光标记寡核苷酸而言，与序列号3所示的碱 基序列中第252位碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶使用被荧光 染料标记的碱基，除此之外，可以根据作为寡核苷酸的合成方法已知 的公知的方法、例如日本特开2002-119291号公报等中记载的方法制 作。

＜引物＞

在后述的ALK基因突变检测方法中，在通过PCR法扩增包含作 为检测对象的ALK基因突变的序列时使用引物。

对于可在本发明中使用的引物，只要能够分别扩增如下核酸则没 有特别限制，所述核酸为：作为目标检测对象的ALK基因突变为ALK （L1196M）突变型时，包含与序列号1所示的碱基序列中第133位碱 基对应的碱基的核酸；和作为目标检测对象的ALK基因突变为ALK （C1156Y）突变型时，包含与序列号3所示的碱基序列中第244位碱 基对应的碱基的核酸。

应用于PCR法的引物只要能够扩增含有与本发明的突变检测用探 针杂交的区域的碱基序列，则没有特别的限制，本领域技术人员例如 可以基于序列号1～序列号4所示的碱基序列适当进行设计。引物的长 度和对于与引物杂交的单链核酸的Tm值可以设定为12mer～40mer和 40℃～70℃、或者16mer～30mer和55℃～60℃。

另外，引物对中各引物的长度可以不同，两引物的Tm值可以大 致相同（或者两引物的Tm值之差在5℃以内）。

本发明的ALK基因突变检测方法为以ALK（L1196M）突变型为 检测对象的ALK基因突变检测方法时，可以使用上述P5和P6作为引 物扩增试样核酸。

上述P5引物能够以具有ALK（L1196M）突变型的碱基序列的核 酸为模板高效地扩增核酸。上述P6引物能够以具有ALK基因野生型 的碱基序列的核酸为模板高效地扩增核酸。因此，将P5和P6引物与 上述P1、P2、P3、P7和P8的荧光标记寡核苷酸一起使用时，能够灵 敏度良好地检测ALK（L1196M）突变型。特别是在与P2的荧光标记 寡核苷酸一起使用时，能够以更高的灵敏度检测ALK（L1196M）突变 型。

需要说的是，在本发明中，有时将核酸扩增反应中具有能与引物 杂交的碱基序列的核酸称为模板核酸。

而且，即使是具有本发明的突变检测用引物中的P5和P6的引物 的各碱基序列经延长、缩短、插入、缺失或置换1～3个碱基而得到的 碱基序列的引物，也可能存在能够与本发明的突变检测用引物同样地 与本发明的突变检测用探针组合使用来检测ALK（L1196M）突变或 ALK（C1156Y）突变的引物。上述本发明的突变检测用引物和具有延 长、缩短、插入、缺失或置换了1个～3个碱基而得到的碱基序列的引 物中，能够与本发明的突变检测用探针组合来检测突变的引物也包括 在本发明的突变检测用引物中。

上述P5引物的碱基序列（序列号14）和P6引物的碱基序列（序 列号15）分别包含与序列号1或序列号2所示的碱基序列的第133位 碱基对应的碱基。由此，能够提高例如具有作为目标的碱基序列的核 酸的扩增效率。

上述P6引物具有与序列号2所示的碱基序列不同的碱基（错配碱 基）。错配碱基是指与G（鸟嘌呤）-C（胞嘧啶）不同的碱基组合或 者与A（腺嘌呤）-T（胸腺嘧啶）不同的碱基组合，具体而言，是指 G-G、G-A、G-T、A-A、A-C、C-T、C-C、T-T碱基组合。

下面例示本发明的突变检测方法中能够用于扩增含有与本发明的 突变检测用探针杂交的区域的碱基序列的引物。需要说明的是，这些 仅仅是示例，对本发明并没有限制。

下面的ALK L1196M-mt-F10是在5’末端侧具有7个碱基的附加序 列、且在3’末端具有相当于序列号1中第133位碱基的“A”的P5引 物。ALK L1196M-WT-F6是在5’末端侧具有6个碱基的附加序列、在 3’末端具有相当于序列号2中第133位碱基的“C”、并且在从3’末端 侧开始第5个碱基的位置具有不同于与序列号2的第128位碱基对应 的碱基的错配碱基（“a”）的P6引物。

表2

名称 序列(5′→3′) mer 序列号 ALK C1156Y-F1 ggactctgtaggctgcagttctc 23 11 ALK C1156Y-R4 tgatcagggcttccatgaggaaatccag 28 12 ALK L1196M F-1 cattggggtgagcctgcaatc 21 13 ALK L1196M-mt-F10 tgcatcaccctgccccggttcatcctgA 28 14 ALK L1196M-WT-F6 ctacgacctgccccggttcaacctgC 26 15 ALK L1196M R-2 cttggcacaacaactgcagcaaagac 26 16 ALK L1196M R-3 ggacggacggaccttggcacaacaactgcagcaaagac 38 17

突变的检测方法只要是利用上述荧光标记核苷酸作为探针的方法 则没有特别的限制。以下，作为将上述荧光标记核苷酸作为探针使用 的突变检测方法的一例，对利用Tm分析的突变检测方法进行说明。

＜突变检测方法＞

本发明的ALK基因突变检测方法包括：至少使用一种上述ALK 基因突变检测用探针来检测ALK基因的突变。

根据本发明的突变检测方法，通过含有至少一种上述突变检测用 探针，能够简便且灵敏度良好地检测ALK基因的突变、特别是ALK （L1196M）突变型和ALK（C1156Y）突变型中的至少一种。

另外，本发明的突变检测方法是ALK基因中的突变的检测方法， 可以包括下述步骤（I）～步骤（IV），也可以包括下述步骤（V）。 需要说明的是，本发明的突变检测方法的特征在于使用上述突变检测 用探针，其他的构成和条件等不受下面记载的限制。

（I）使上述突变检测用探针和试样中的单链核酸接触，从而使上 述荧光标记寡核苷酸和上述单链核酸杂交而得到杂交体。

（II）通过改变含有上述杂交体的试样的温度来使上述杂交体解 离，并测定基于上述杂交体的解离的荧光信号的变动。

（III）基于上述荧光信号的变动来测定作为杂交体的解离温度的 Tm值。

（IV）基于上述Tm值来检测ALK基因中的突变的存在。

（V）基于上述突变的存在来检测上述试样中的单链核酸中具有突 变的单链核酸的丰度比。

另外，在本发明中，在上述步骤（I）～（IV）或上述步骤（I）～ （V）的基础上，还可以包括：在得到步骤（I）的杂交体之前或者在 得到步骤（I）的杂交体的同时扩增核酸。

需要说明的是，（III）中对Tm值的测定，不仅包括测定杂交体 的解离温度，还可以包括测定杂交形成体熔解时随温度而变动的荧光 信号的微分值大小。

在本发明中，试样中的核酸可以是单链核酸也可以是双链核酸。 上述核酸为双链核酸时，例如可列举包括在与上述荧光标记寡核苷酸 杂交之前通过加热使上述试样中的双链核酸熔解（解离）成单链核酸。 通过将双链核酸解离成单链核酸，能够与上述荧光标记寡核苷酸进行 杂交。

在本发明中，作为检测对象的试样中所含的核酸，例如可以是生 物试样中本来含有的核酸，但从能够提高检测精度方面出发，可列举 以生物试样中本来含有的核酸作为模板、通过PCR等使含有ALK基因 的突变位点的区域扩增而得到的扩增产物。扩增产物的长度没有特别 的限制，可以设为例如50mer～1000mer或80mer～200mer。另外，试 样中的核酸也可以是例如通过RT-PCR（Reverse Transcription PCR）由 来源于生物试样的RNA（总RNA、mRNA等）合成的cDNA。

在本发明中，本发明的突变检测用探针相对于上述试样中的核酸 的添加比例（摩尔比）没有特别的限制。可列举相对于试样中的DNA 为例如1倍以下。另外，从确保充分的检测信号的观点出发，可将本 发明的突变检测用探针相对于上述试样中的核酸的添加比例（摩尔比） 设为0.1倍以下。

在此，试样中的核酸例如可以是发生了作为检测目标的突变的检 测对象核酸与未发生上述突变的非检测对象核酸的合计，也可以是含 有发生了作为检测目标的突变的检测对象序列的扩增产物与含有未发 生上述突变的非检测对象序列的扩增产物的合计。需要说明的是，试 样中的核酸中上述检测对象核酸的比例通常是不清楚的，但最终可将 上述突变检测用探针相对于检测对象核酸（含有检测对象序列的扩增 产物）的添加比例（摩尔比）设为10倍以下。另外，可将上述突变检 测用探针相对于检测对象核酸（含有检测对象序列的扩增产物）的添 加比例（摩尔比）设为5倍以下或3倍以下。此外，其下限没有特别 的限制，可设为例如0.001倍以上、0.01倍以上或0.1倍以上。

本发明的突变检测用探针相对于上述DNA的添加比例，例如可以 是相对于双链核酸的摩尔比，也可以是相对于单链核酸的摩尔比。

在本发明中，用于确定Tm值的伴随着温度变化而发生的信号变 动的测定，可以根据前述的原理通过测定260nm的吸光度来进行，但 也可列举：测定基于添加在上述突变检测用探针上的标记的信号的信 号，即，测定根据单链DNA与上述突变检测用探针的杂交体形成的状 态而发生变动的信号。因此，作为上述突变检测用探针，可列举使用 荧光标记寡核苷酸的突变检测用探针。作为上述荧光标记寡核苷酸， 可列举例如：与未与靶序列杂交时的荧光强度相比、与靶序列杂交时 的荧光强度减少（淬灭）的荧光标记寡核苷酸、或者与未与靶序列杂 交时的荧光强度相比、与靶序列杂交时的荧光强度增加的荧光标记寡 核苷酸。

如果是前一种探针，则在与检测对象序列形成杂交体（双链DNA） 时不显示荧光信号或者荧光信号弱，但通过加热使探针解离时显示荧 光信号或者荧光信号增加。

另外，如果是后一种探针，则通过与检测对象序列形成杂交体（双 链DNA）而显示出荧光信号，且通过加热使探针解离时荧光信号减少 （消失）。因此，通过在荧光标记特有的条件（荧光波长等）下检测 基于该荧光标记的荧光信号的变化，能够与上述测定260nm的吸光度 同样地实施熔解的进行以及Tm值的确定。

接着，关于本发明的突变检测方法，列举检测基于荧光染料的信 号变化的方法的具体例来进行说明。需要说明的是，本发明的突变检 测方法的特征在于使用上述突变检测用探针本身，对其他的步骤和条 件没有任何限制。

作为含有成为进行核酸扩增时的模板的核酸的试样，只要是含有 核酸、特别是含ALK基因的核酸的试样则没有特别的限制。例如，可 列举大肠、肺等组织、白血细胞等血细胞、全血、血浆、痰、口腔粘 膜悬浮液、指甲、毛发等体细胞、生殖细胞、乳汁、腹水液、石蜡包 埋组织、胃液、胃清洗液、尿、腹膜液、羊水、细胞培养等任意的源 自或可源自生物学起源的物质。需要说明的是，试样的采集方法、含 有核酸的试样的制备方法等没有限制，可以采用任意现有公知的方法。 另外，作为模板的核酸可以由该起源得到后直接使用，或者也可以在 为了改变该样品的特性而进行预处理之后使用。

例如，在将全血作为试样时，基因组DNA从全血中的分离可以通 过现有公知的方法进行。例如，可以使用市售的基因组DNA分离试剂 盒（商品名GFX Genomic Blood DNA Purification kit；GE Healthcare  Bioscience公司制）等。

接着，向含有分离出的基因组DNA的试样中添加含有上述荧光标 记寡核苷酸的突变检测用探针。

上述突变检测用探针可以添加到含有分离出的基因组DNA的液 体试样中，也可以在适当的溶剂中与基因组DNA混合。作为上述溶剂， 没有特别的限制，例如可列举Tris-HCl等缓冲液、含有KCl、MgCl₂、 MgSO₄、甘油等的溶剂、PCR反应液等现有公知的溶剂。

添加上述突变检测用探针的时机没有特别的限制，例如，在进行 后述的PCR等扩增处理的情况下，可以在扩增处理之后添加到PCR扩 增产物中，也可以在扩增处理之前添加。

这样在利用PCR等的扩增处理之前添加上述检测用探针时，例如， 如前所述，可以在其3’末端添加荧光染料、或者添加磷酸基团。

作为核酸扩增的方法，例如可列举使用聚合酶的方法等。作为其 的示例，可列举PCR法、ICAN法、LAMP法、NASBA法等。在通过 使用聚合酶的方法进行扩增时，可列举在本发明探针存在下进行扩增。 根据所使用的探针和聚合酶来调节扩增的反应条件等对于本领域技术 人员来说是容易的。由此，仅通过在核酸扩增后分析探针的Tm值就能 够判断有无突变，因此，无需对反应结束后的扩增产物进行处理。由 此，不用担心由扩增产物带来的污染。另外，能够通过与扩增所需的 仪器相同的仪器进行检测，因此不需要移动容器，容易自动化。

另外，作为在PCR法中使用的DNA聚合酶，可以没有特别的限 制地使用常用的DNA聚合酶。例如，可列举GeneTaq（Nippon Gene 公司制）、PrimeSTAR MaX DNA Polymerase（Takara bio公司制）、 Taq聚合酶等。

作为聚合酶的使用量，只要是常用的浓度则没有特别的限制。例 如，在使用Taq聚合酶时，可以设定为例如相对于反应溶液量50μl为 0.01U～100U的浓度。由此，具有ALK基因突变的检测灵敏度增高等 倾向。

另外，PCR法可以通过适当选择常用的条件来进行。

此外，在扩增时，也可以通过实时PCR来监测扩增，从而调查试 样中含有的DNA（检测对象序列）的拷贝数。即，随着DNA（检测对 象序列）通过PCR而扩增，形成杂交体的探针的比例增加，因此荧光 强度发生变动。通过对此进行监测，能够检测试样中含有的检测对象 序列（正常DNA或突变型DNA）的拷贝数或丰度比。

在本发明的突变检测方法中，使上述荧光标记寡核苷酸与试样中 的单链核酸接触而使两者杂交。试样中的单链核酸例如可以通过解离 如上得到的PCR扩增产物来制备。

上述PCR扩增产物解离（解离步骤）时的加热温度只要是能够解 离上述扩增产物的温度则没有特别的限制。例如为85℃～95℃。加热 时间也没有特别的限制。加热时间可设为例如1秒～10分钟或者1秒～ 5分钟。

另外，解离后的单链DNA与上述荧光标记寡核苷酸的杂交，例如 可以在上述解离步骤之后、通过使上述解离步骤中的加热温度降低来 进行。作为温度条件，例如为40℃～50℃。

杂交步骤的反应液中各组分的体积或浓度没有特别的限制。作为 具体例，上述反应液中DNA的浓度可设为例如0.01μM～1μM或 0.1μM～0.5μM。上述荧光标记寡核苷酸的浓度为例如满足相对于上述 DNA的添加比例的范围，可设为例如0.001μM～10μM或0.001μM～ 1μM。

然后，缓慢地加热所得到的上述单链DNA与上述荧光标记寡核苷 酸的杂交体，测定伴随着温度上升而发生的荧光信号的变动。例如， 在使用QProbe的情况下，在与单链DNA杂交后的状态下，与解离后 的状态相比荧光强度减少（或淬灭）。因此，例如，只要缓慢地加热 荧光减少（或淬灭）的杂交体并测定伴随温度上升而来的荧光强度的 增加即可。

测定荧光强度的变动时的温度范围没有特别的限制，例如开始温 度可设为室温～85℃或25℃～70℃。结束温度例如可设为40℃～105 ℃。另外，温度的上升速度没有特别的限制，例如可设为0.1℃/秒～20 ℃/秒或0.3℃/秒～5℃/秒。

接着，对上述信号的变动进行分析而确定Tm值（参见图1）。具 体而言，可以由所得到的荧光强度计算出各温度下的微分值（-d荧光 强度/dt），并将显示最低值的温度确定为Tm值。另外，也可以将每单 位时间的荧光强度增加量（荧光强度增加量/t）最高的点确定为Tm值。 此外，作为标记化探针，在不使用淬灭探针、而使用由于形成杂交体 而信号强度增加的探针的情况下，相反地测定荧光强度的减少量即可。

另外，在本发明中，如前所述，加热杂交体并测定伴随温度上升 而发生的荧光信号变动（优选荧光强度的增加），但是，也可以进行 例如测定形成杂交体时的信号变动来代替上述方法。即，也可以测定 使添加了上述探针的试样的温度降低而形成杂交体时伴随上述温度降 低而发生的荧光信号变动。

作为具体例，在使用QProbe的情况下，将上述探针刚添加到试样 中后上述探针处于解离状态，因此荧光强度大，但随着温度的降低而 形成杂交体时，上述荧光减少（或淬灭）。因此，例如缓慢地降低上 述加热的试样的温度并测定伴随温度降低的荧光强度的减少即可。

另一方面，在使用由于形成杂交体而信号增加的标记化探针的情 况下，将上述探针刚添加到试样中后上述探针处于解离状态，因此荧 光强度小（或淬灭），但随着温度的降低而形成杂交体时，荧光强度 增加。因此，例如缓慢地降低上述试样的温度并测定伴随温度降低的 荧光强度的增加即可。

本发明的突变检测方法中，包括检测ALK（L1197M）突变型和 ALK（C1156Y）突变型中的至少一种突变型。即，包括以下的任意一 种方式：

（1）使用作为上述P1、P2、P3、P7和P8的寡核苷酸中的至少 一种的荧光标记寡核苷酸，不使用作为上述P4的寡核苷酸的荧光标记 寡核苷酸，仅检测ALK（L1197M）突变型；

（2）不使用作为上述P1、P2、P3、P7和P8的寡核苷酸中的至 少一种的荧光标记寡核苷酸，而使用作为上述P4的寡核苷酸的荧光标 记寡核苷酸，仅检测ALK（C1156Y）突变型；或

（3）同时使用作为上述P1、P2、P3、P7和P8的寡核苷酸中的 至少一种的荧光标记寡核苷酸和作为上述P4的寡核苷酸的荧光标记寡 核苷酸，检测ALK（L1197M）突变型和ALK（C1156Y）突变型两者。

ALK基因中的多种突变可以通过同一体系检测，也可以通过不同 的体系检测。作为通过同一体系进行检测的检测方法，没有特别的限 制。例如，可以预先混合能够检测各突变的各探针、然后添加到试样 中，也可以向含有单链核酸的试样中连续地添加能够检测各突变的各 探针。

在此，“体系”是指由含有荧光标记寡核苷酸与单链核酸杂交而 成的杂交体的试样形成的1个独立的反应体系。

需要说明的是，关于本突变检测方法中能够使用的各探针和引物 的优选方式或序列，可以适用对上述各探针和引物的说明。

＜药效评价方法＞

本发明的药效评价方法包括：通过上述的突变检测方法检测ALK 基因中的突变、以及基于上述检测结果、即测得的突变的有无评价对 药剂的耐受性或药剂的药效。

上述的突变检测方法使用本发明中的突变检测用探针而灵敏度良 好且简便地检测ALK基因的L1196M突变或C1156Y突变，因此，能 够基于ALK基因中的这些突变灵敏度良好且简便地进行药剂的评价。

另外，能够基于ALK基因中有无突变评价对药剂的耐受性或药剂 的药效。而且，本发明的药效评价方法对于基于ALK基因中有无突变 确定向增加药剂给药量、变更为其他治疗药等转换等疾病治疗方针是 有用的。

此外，作为成为评价对象的药剂，具体而言，可列举以ALK抑制 剂作为有效成分的抗癌药，特别是抗癌药中可列举肺癌治疗用抗癌药、 例如克里唑蒂尼等。

＜突变检测用试剂盒＞

本发明的突变检测用试剂盒包含上述的突变检测用探针。

该突变检测用试剂盒中含有上述突变检测用探针中的至少一种， 由此，能够更简便地进行例如ALK基因的突变的检测。

突变检测用试剂盒可以进一步包含用于扩增含有与上述探针杂交 的区域的碱基序列的引物。

由此，本发明中的突变检测用试剂盒能够精度良好地进行ALK基 因的突变的检测。

关于突变检测用试剂盒中可含有的探针和引物，可以直接适用前 述的说明。

在含有2种以上荧光标记寡核苷酸作为突变检测用探针的情况下， 各荧光标记寡核苷酸可以以混合后的状态含有，也可以各自单独地含 有。

另外，在2种以上的上述探针以混合后的状态包含于上述突变检 测用试剂盒中的情况下，或者将上述突变检测试剂盒中以各自单独的 形式含有的2种以上的探针例如在使用时在同一反应体系中混合并使 用的情况下，优选2种以上的各探针被发光波长彼此不同的荧光染料 标记。

通过这样改变荧光物质の种类，即使在同一反应体系中，也能够 对各探针进行检测。

另外，本发明中的检测用试剂盒中，除了上述探针和上述引物之 外，还可以含有本发明的检测方法中进行核酸扩增所需的试剂类。此 外，探针、引物和其他试剂类可以各自单独地被收容，也可以将它们 的一部分形成混合物。

需要说明的是，“各自单独地收容”是指只要各试剂被分开而能 够维持非接触状态即可，不一定要收容于可独立处理的单独的容器中。

通过含有用于扩增含有突变位点的序列（与探针杂交的区域）的 引物对，例如能够以更高的灵敏度检测突变。

另外，本发明的突变检测用试剂盒可以包括记载了使用上述突变 检测用探针对含有作为检测对象的核酸的试样制作微分熔解曲线并进 行其Tm值分析来检测ALK基因中的突变的使用说明书、或者记载了 检测用试剂盒中包含或可追加包含的各种试剂的使用说明书。

实施例

下面通过实施例详细地说明本发明。但是，本发明不限定于这些 实施例。

[实施例1]

基于含有ALK（L1196M）的突变位点的碱基序列（序列号1）或 含有ALK（C1156Y）的突变位点的碱基序列（序列号3），分别设计 由与序列号1所示的碱基序列的第123位～第139位碱基对应的碱基 构成并且具有与第123位碱基对应且被荧光标记的胞嘧啶的P1荧光标 记寡核苷酸探针3PB-ALKL1196M-mt-R1（序列号5：ALK（L1196M） 突变型检测用）、以及由与序列号3所示的碱基序列的第235位～第 252位碱基对应的碱基构成并且具有与第252位碱基对应且被荧光标记 的胞嘧啶的P4荧光标记寡核苷酸探针3T-ALKC1156Y-mt-F2（序列号 8：ALK（C1156Y）突变型检测用），并根据常规方法制作（参见表3）。 胞嘧啶的标记根据常规方法分别使用Pacific Blue（以下称为“PB”） 或TAMRA进行。需要说明的是，探针中3’末端的括号内表示荧光染 料的种类。表3中示出的碱基序列中大写字母表示突变的位置。下同。

表3

使用下述表4和表5所示的试剂，通过全自动SNPs检查装置（商 品名i-densy（商标）、爱科来公司制）进行PCR和Tm分析，确认了 利用本发明的突变检测用荧光标记寡核苷酸的探针的性能。需要说明 的是，表4和表5中的“％”表示质量％（下同）。

PCR中，在95℃下处理60秒后，以95℃下1秒和61℃下30秒 为一个循环，反复进行50个循环。

Tm分析中，在95℃下处理1秒、在40℃下处理60秒，接着以温 度的上升速度1℃/3秒使温度从40℃上升至75℃，测定这期间荧光强 度的经时变化。关于Tm分析中的激发波长和检测波长，在荧光染料为 Pacific Blue时，分别为365nm～415nm、445nm～480nm，在荧光染料 为TAMRA时，分别为520nm～555nm、585nm～700nm。通过各波长， 分别测定源自荧光标记探针的荧光强度的变化。

表4

＜模板使用质粒时＞

表5

＜模板使用全血时＞

＜核酸混合液＞

核酸混合液中以预定的比例含有：将含有与ALK（L1196M）突 变或ALK（C1156Y）突变的各突变位点对应的序列的序列号18～序列 号21所示的核酸序列（参见表6）插入pUC57的EcoRV位点，接着 用EcoRI处理而得到的质粒Mt（L1196M）、Wt（L1196M）、Mt（C1156Y） 和Wt（C1156Y）。样品A～C中核酸混合液中的质粒的含有比率（每 1μL的拷贝数）记载于表7中。

＜预处理全血＞

将全血10μl添加到70μl稀释液1中，均匀混合后，将该混合液 10μl添加到70μl稀释液2中。将该混合液17μl在95℃下加热10分钟， 得到4μl的预处理后的全血。将该4μl全部添加到反应液中。稀释液1 和稀释液2的组分如表8所示。

表6

表7

表8

通过Tm分析，得到表示探针的荧光值变化量的图2～图5。图2～ 图4分别表示使用含有核酸混合液的试样ID：A～C作为试样时的结果。 图5表示使用全血作为试样时的结果。另外，图2～图5中，（A）示 出有无ALK（L1196M）突变型，（B）示出有无ALK（C1156Y）突 变型。图中，纵轴表示每单位时间的荧光强度变化量(d荧光强度增加 量/t)，横轴表示温度（℃）。

结果，在确认ALK（L1196M）突变型的检测的图2（A）～图5 （A）中，野生型（C/C）在49℃观察到峰，突变型（A/A）在58℃观 察到峰。在确认ALK（C1156Y）突变型的检测的图2（B）～图5（B） 中，野生型（G/G）在51℃观察到峰，突变型（A/A）在58℃观察到峰。 对于将突变型和野生型混合而得到的试样液ID：B，在58℃观察到归 属于ALK（L1196M）突变型的峰，并且在58℃观察到归属于ALK （C1156Y）突变型的峰（参见图3）。

另外明确了：即使将血液样品作为试样时，也能够容易地同时检 测ALK（L1196M）突变型和ALK（C1156Y）突变型。

因此表明：通过将本发明的荧光标记寡核苷酸作为探针使用，能 够同时检测ALK（L1196M）突变型和ALK（C1156Y）突变型。

[实施例2]

作为用于检测ALK（L1196M）突变型的探针，基于含有ALK （L1196M）的突变位点的碱基序列（序列号1），设计由与序列号1 所示的碱基序列的第123位～第141位碱基对应的碱基构成、并且具 有与第141位碱基对应且被荧光标记的胞嘧啶的P2荧光标记寡核苷酸 探针3T-ALKL1196M-mt-F7，并根据常规方法制作（表9）。标记C的 标记根据常规方法使用TAMRA进行。

另外，基于序列号1所示的碱基序列，设计作为具有与序列号1 所示的序列的第133位碱基对应的碱基的P5引物的一例的引物ALK L1196M-mt-F10，基于序列号2所示的碱基序列，设计作为具有与序列 号2所示的序列的第133位碱基对应的碱基且含有错配碱基的P6引物 的引物ALK L1196M-WT-F6，并根据常规方法制作（表10）。需要说 明的是，表10中的下划线表示错配碱基。另外，基于序列号1的序列， 设计反向引物ALK L1196M R-3，根据常规方法制造（表10）。

表9

表10

名称 序列(5′→3′) mer 序列号 ALK L1196M-mt-F10 tgcatcaccctgccccggttcatcctgA 28 14 ALK L1196M-WT-F6 ctacgacctgccccggttcaacctgC 26 15 ALK L1196M R-3 ggacggacggaccttggcacaacaactgcagcaaagac 38 17

使用下述的试剂，通过全自动SNPs检查装置（商品名i-densy（商 标）、爱科来公司制）进行PCR和Tm分析，确认了利用本发明的突 变检测用荧光标记寡核苷酸的探针的性能。

PCR中，在95℃下处理60秒后，以95℃下1秒和52℃下15秒 为一个循环，反复进行50个循环。

Tm分析中，在PCR后，在95℃下处理1秒、在40℃下处理60 秒，接着以温度的上升速度1℃/3秒使温度从40℃上升至75℃，测定 这期间荧光强度的经时变化。Tm分析中的激发波长和检测波长为 520nm～555nm、585nm～700nm（TAMRA）。通过各波长，分别测定 源自荧光标记探针的荧光强度的变化。

表11

＜模板使用质粒时＞

＜核酸混合液＞

核酸混合液中含有与实施例1中使用的质粒相同的质粒Mt （L1196M）或Wt（L1196M）。样品D～G中核酸混合液中的质粒的 含有比率（每1μL的拷贝数）记载于表12中。

表12

通过Tm分析，得到表示探针的荧光值变化量的图6。图6（A） 示出使用样品ID：D时的结果，图6（B）示出使用样品ID：E时的结 果，图6（C）示出使用样品ID：F时的结果，图6（D）示出使用样 品ID：G时的结果。图中，纵轴表示每单位时间的荧光强度变化量(d 荧光强度增加量/t)，横轴表示温度（℃）。

如图6所示，野生型（C/C）在54℃观察到峰，突变型（A/A）在 63℃观察到峰。

因此表明：在将本发明的荧光标记寡核苷酸作为探针使用、并且 使用含有错配碱基的引物（本实施例中野生型核酸序列扩增用引物） 时，即使在突变型含有比率为0.3％（mt0.3％、20000cp/test）的情况 下，也能够容易且高特异性地检测出有无ALK（L1196M）突变型。

[比较例1]

基于含有ALK（L1196M）突变型的碱基序列（序列号1），设计 由与序列号1所示的碱基序列的第126位～第142位碱基对应的碱基 构成、与第141位碱基对应的碱基为胞嘧啶以外并且5’末端的胞嘧啶 被荧光标记的探针3PB-ALKL1196M-mt-F1（序列号22），并根据常规 方法制作（参见表13）。

另外，作为模板核酸，使用具有与序列号1或序列号2所示的碱 基序列互补的碱基序列的模板寡核苷酸（野生型（序列号23）和突变 型（序列号24））。将模板寡核苷酸的序列示于表14。作为样品，单 独使用野生型模板寡核苷酸、单独使用突变型模板寡核苷酸、将野生 型模板寡核苷酸和突变型模板寡核苷酸以1:1（摩尔比，下同）混合使 用。

表13

表14

名称 序列(5′→3′） mer 序列号 WT atgagctccaGcaggatgaaccggggc 27 23 Mt atgagctccaTcaggatgaaccggggc 27 24

使用下述的试剂，通过全自动SNPs检查装置（商品名i-densy（商 标）、爱科来公司制）进行Tm分析，确认了3PB-ALKL1196M-mt-F1 的性能。需要说明的是，表15中，Gene Taq Universal buffer使用Nippon  Gene公司制商品。核酸混合液在调整浓度而达到5μM的模板寡核苷酸 后，将4μL添加到反应液中。

Tm分析中，在95℃下处理1秒、在40℃下处理60秒，接着以温 度的上升速度1℃/3秒使温度从40℃上升至75℃，测定这期间荧光强 度的经时变化。需要说明的是，Tm分析中激发波长和检测波长分别为 365nm～415nm、445nm～480nm（PB）。通过各波长，分别测定源自 荧光标记探针的荧光强度的变化。

表15

通过Tm分析，得到表示探针的荧光值变化量的图7。图中，纵轴 表示每单位时间的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t)，横轴表示温 度（℃）。图中，由方形表示的图案示出仅使用野生型模板寡核苷酸 作为模板核酸时的结果，由菱形表示的图案示出仅使用突变型模板寡 核苷酸作为模板核酸时的结果，由三角形表示的图案示出将野生型模 板寡核苷酸和突变型模板寡核苷酸以1:1混合作为模板核酸使用时的 结果。

在图7中，野生型在51℃观察到峰、ALK（L1196M）突变型在 55℃观察到峰。野生型为100％的情况与ALK（L1196M）突变型为100 ％的情况，与上述计算值不同，Tm值之差仅为4℃，难以将峰区分开。

另外，将突变型和野生型的各模板寡核苷酸1:1作为模板核酸的 情况下，仅在54℃观察到一个宽峰，不能检测ALK（L1196M）突变 型。

[比较例2]

基于含有ALK（L1196M）突变型的碱基序列（序列号1），设计 由与序列号1所示的碱基序列的第126位～第142位碱基对应的碱基 构成、并且成为与第141位碱基对应的碱基以外的碱基的5’末端的胞 嘧啶被荧光标记的探针5T-ALK-L1196M-mt-F5（序列号25），并根据 常规方法制作（参见表16）。

表16

使用下述表17的试剂，通过全自动SNPs检查装置（商品名i-densy （商标）、爱科来公司制）进行PCR和Tm分析，确认了探针 5T-ALK-L1196M-mt-F5的性能。作为模板核酸，使用含有与实施例1 中使用的质粒相同的质粒的核酸混合液。核酸混合液中各质粒的拷贝 数如表18所示。

PCR中，在95℃下处理60秒后，以95℃下1秒和52℃下15秒 为一个循环，反复进行50个循环。作为引物，使用与在实施例2中使 用的引物相同的引物。

Tm分析中，在95℃下处理1秒、在40℃下处理60秒，接着以温 度的上升速度1℃/3秒使温度从40℃上升至75℃，测定这期间荧光强 度的经时变化。

Tm分析中激发波长和检测波长为520nm～555nm、585nm～700nm （TAMRA）。通过各波长，分别测定源自荧光标记探针的荧光强度的 变化。

表17

＜模板使用质粒时＞

表18

通过Tm分析，得到表示探针的荧光值变化量的图8。图中，纵轴 表示每单位时间的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t)，横轴表示温 度（℃）。

如图8所示，即使使用实施例2中使用的高灵敏度检测用的含有 错配碱基的引物，也仅在54℃观察到一个峰，不能检测ALK（L1196M） 突变型。

[比较例3]

基于含有ALK（C1156Y）突变型的碱基序列（序列号3），设计 由与序列号3所示的碱基序列的第229位～第245位碱基对应的碱基 构成、并且成为与第252位碱基对应的碱基以外的碱基的3’末端的胞 嘧啶被荧光标记的探针3T-ALK-C1156Y-mt-F4（序列号26），并根据 常规方法制作（参见表19）。

另外，作为模板核酸，使用具有与序列号3或序列号4所示的碱 基序列互补的碱基序列的模板寡核苷酸（野生型（序列号27）和突变 型（序列号28））。将模板寡核苷酸的序列示于表20中。作为样品， 单独使用野生型模板寡核苷酸、单独使用突变型模板寡核苷酸、将野 生型模板寡核苷酸和突变型模板寡核苷酸以1：1混合使用。

使用上述的探针、模板核酸，将激发波长和检测波长分别设为 520nm～555nm、585nm～700nm，除此之外，与比较例1同样地进行 Tm分析，确认了探针的性能。

表19

名称 序列(5′→3′） mer 序列号 3T-ALK-C1156Y-mt-F4 cgctgcctgaagtgtAc-(TAMRA) 17 26

表20

序列(5’→3’) mer 序列号 gttcagagCacacttcaggcagcgtct 27 27 gttcagagTacacttcaggcagcgtct 27 28

通过Tm分析，得到表示探针的荧光值变化量的图9。图中，纵轴 表示每单位时间的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t)，横轴表示温 度（℃）。图中，由方形表示的图案示出仅使用野生型模板寡核苷酸 作为模板核酸时的结果，由菱形表示的图案示出仅使用突变型模板寡 核苷酸作为模板核酸时的结果，由三角形表示的图案示出将野生型模 板寡核苷酸和突变型模板寡核苷酸以1:1混合作为模板核酸使用时的 结果。

在图9中，ALK（C1156Y）突变型在66℃观察到峰，但是未检测 到野生型的峰，在混合有野生型和突变型的样品的情况下仅检测到一 个峰。因此，不能检测ALK（C1156Y）突变型。

[实施例3]

作为用于检测ALK（L1196M）突变型的探针，基于野生型碱基 序列（序列号2），设计由与序列号2所示的碱基序列的第123位～第 138位碱基对应的碱基构成、并且具有与138位碱基对应且被荧光标记 的胞嘧啶的P3荧光标记寡核苷酸探针5T-ALK-L1196M-R1（序列号7）， 并根据常规方法制作（表21）。标记胞嘧啶的标记根据常规方法进行。

另外，作为模板核酸，使用具有与序列号1或序列号2所示的碱 基序列互补的碱基序列的模板寡核苷酸（野生型（序列号29）和突变 型（序列号30））。将模板寡核苷酸的序列示于表22中。作为样品， 单独使用野生型模板寡核苷酸、单独使用突变型模板寡核苷酸、将野 生型模板寡核苷酸和突变型模板寡核苷酸以1:1混合使用。

使用上述的探针、模板核酸，将激发波长设为520nm～555nm、 将检测波长设为585nm～700nm，分别测定源自荧光标记探针的荧光强 度的变化，除此之外，与实施例1同样地进行Tm分析。

需要说明的是，表22中的“S”和“Y”是相当于除ALK（L1196M） 突变以外的其他突变位点的碱基，“S”表示“g或c”，“Y”表示“t 或c”。

表21

表22

通过Tm分析，得到表示探针的荧光值变化量的图10。图中，纵 轴表示每单位时间的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t)，横轴表示 温度（℃）。图中，由菱形表示的图案示出仅使用野生型模板寡核苷 酸作为模板核酸时的结果，由方形表示的图案示出仅使用突变型模板 寡核苷酸作为模板核酸时的结果，由三角形表示的图案示出将野生型 模板寡核苷酸和突变型模板寡核苷酸以1:1混合作为模板核酸使用时 的结果。

在图10中，野生型在60℃观察到峰，ALK（L1196M）突变型在 54℃观察到峰。即使在将野生型与突变型为1:1的混合液作为样品的情 况下，也观察到能够区分开的54℃和60℃的两个峰，能够良好地检测 有无ALK（L1196M）突变型。

[比较例4]

基于野生型碱基序列（序列号2），设计由与序列号2所示的碱基 序列的第123位～第139位碱基对应的碱基构成、与第138位碱基对 应的碱基为胞嘧啶以外的碱基并且5’末端的胞嘧啶被荧光标记的探针 3T-ALK-L1196M-F5（序列号31），并根据常规方法制作（参见表23）。

另外，作为模板核酸，使用具有与序列号1或序列号2所示的碱 基序列互补的碱基序列的模板寡核苷酸（野生型（序列号32）和突变 型（序列号33））。将模板寡核苷酸的序列示于表24中。作为样品， 单独使用野生型模板寡核苷酸、单独使用突变型模板寡核苷酸、将野 生型模板寡核苷酸和突变型模板寡核苷酸以1:1混合使用。

除了使用上述探针和模板核酸之外，与实施例3同样地进行Tm 分析，确定了探针的性能。

表23

表24

名称 序列(5′→3′) mer 序列号 ALKL1196MWTR atgagctccaGcaggatgaaccggggc 27 32 ALKL1196MmtR atgagctccaTcaggatgaaccggggc 27 33

通过Tm分析，得到表示探针的荧光值变化量的图11。图中，纵 轴表示每单位时间的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t)，横轴表示 温度（℃）。图中，由菱形表示的图案示出仅使用野生型模板寡核苷 酸作为模板核酸时的结果，由方形表示的图案示出仅使用突变型模板 寡核苷酸作为模板核酸时的结果，由三角形表示的图案示出将野生型 模板寡核苷酸和突变型模板寡核苷酸以1:1混合作为模板核酸使用时 的结果。

在图11中，野生型在66℃观察到峰，突变型在55℃观察到峰， 但在将野生型与突变型为1:1的混合液作为样品的情况下，探针的反应 性弱，难以充分地检测表示突变型的峰。

[实施例4和实施例5]

作为实施例4的用于检测ALK（L1196M）突变型的探针，基于 野生型碱基序列（序列号2），设计由与序列号2所示的碱基序列的第 129位～第145位碱基对应的碱基构成、并且具有与145位碱基对应且 被荧光标记的胞嘧啶的P7荧光标记寡核苷酸探针 5T-ALK-L1196M-mtR5（序列号9），并根据常规方法制作（表25）。 标记胞嘧啶的标记根据常规方法进行。

另外，作为模板核酸，使用具有与序列号1或序列号2所示的碱 基序列互补的碱基序列的模板寡核苷酸（野生型（序列号34）和突变 型（序列号35））。将模板寡核苷酸的序列示于表26中。作为样品， 单独使用野生型模板寡核苷酸、单独使用突变型模板寡核苷酸、或者 将野生型模板寡核苷酸和突变型模板寡核苷酸以1:1混合使用。

表25

表26

名称 序列(5′→3′） 序列号 ALK WT2souhosa1306 tcctgCtggagctcatggc 34 ALK mt2souhosa1306 tcctgAtggagctcatggc 35

另外，作为实施例5的用于检测ALK（L1196M）突变型的探针， 基于野生型碱基序列（序列号2），设计由与序列号2所示的碱基序列 的第133位～第141位碱基对应的碱基构成、并且具有与第141位碱 基对应且被荧光标记的胞嘧啶的P8荧光标记寡核苷酸探针 3T-ALK-L1196M-WTF12（序列号10），并根据常规方法制作（表27）。 标记胞嘧啶的标记根据常规方法进行。

另外，作为模板核酸，使用具有与序列号1或序列号2所示的碱 基序列互补的碱基序列的模板寡核苷酸（野生型（序列号36）和突变 型（序列号37））。将模板寡核苷酸的序列示于表28中。作为样品， 单独使用野生型模板寡核苷酸、单独使用突变型模板寡核苷酸、或者 将野生型模板寡核苷酸和突变型模板寡核苷酸以1:1混合使用。

表27

表28

名称 序列(5′→3′） 序列号 ALK WT3souhosa1306 cgccatgagctccaGcagga 36 ALK mt3souhosa1306 cgccatgagctccaTcagga 37

使用实施例4和实施例5的各探针、各自的模板核酸和以下的反 应试剂，将激发波长设为520nm～555nm、将检测波长设为585nm～ 700nm，分别测定源自荧光标记探针的荧光强度的变化，除此之外，与 实施例1同样地进行Tm分析。表29中，Gene Taq Universal buffer使 用Nippon Gene公司制商品。

表29

通过Tm分析，得到表示探针的荧光值变化量的图12（实施例4） 和图13（实施例5）。图中，纵轴表示每单位时间的荧光强度变化量(d 荧光强度增加量/t)，横轴表示温度（℃）。图中，由菱形表示的图案示 出仅使用野生型模板寡核苷酸作为模板核酸时的结果，由方形表示的 图案示出仅使用突变型模板寡核苷酸作为模板核酸时的结果，由三角 形表示的图案示出将野生型模板寡核苷酸和突变型模板寡核苷酸以1:1 混合作为模板核酸使用时的结果。

实施例4中，如图12所示，野生型在54℃观察到峰，ALK （L1196M）突变型在64℃观察到峰。即使在将野生型与突变型为1:1 的混合液作为样品的情况下，也观察到可区分开的53℃和63℃的两个 峰，能够良好地检测有无ALK（L1196M）突变型。

实施例5中，如图13所示，野生型在70℃观察到峰，ALK（L1196M） 突变型在60℃观察到峰。即使在将野生型与突变型为1:1的混合液作 为样品的情况下，也观察到可区分开的60℃和70℃的两个峰，能够良 好地检测有无ALK（L1196M）突变型。

[比较例5和比较例6]

作为比较例5的用于检测ALK（L1196M）突变型的探针，基于 野生型的碱基序列（序列号2），设计由与序列号2所示的碱基序列的 第124位～第139位碱基对应的碱基构成、并且具有与第139位碱基 对应且被荧光标记的胞嘧啶的荧光标记寡核苷酸探针 3T-ALK-L1196M-mtF9（序列号38），并根据常规方法制作（表30）。 标记胞嘧啶的标记根据常规方法进行。

另外，作为模板核酸，使用具有与序列号1或序列号2所示的碱 基序列互补的碱基序列的模板寡核苷酸（野生型（序列号39）和突变 型（序列号40））。将模板寡核苷酸的序列示于表31中。作为样品， 单独使用野生型模板寡核苷酸、单独使用突变型模板寡核苷酸、将野 生型模板寡核苷酸和突变型模板寡核苷酸以1:1混合使用。

需要说明的是，表31中的“S”和“R”是相当于除ALK（L1196M） 突变以外的其他突变位点的碱基，“S”表示“g或c”，“R”表示“g 或a”。

表30

表31

名称 序列(5′→3′） 序列号 ALK-L1196M WT-R cccccSgccatRagctccaGcaggatgaacSggggcaggg 39 ALK-L1196M mT-R cccccSgccatRagctccaTcaggatgaacSggggcaggg 40

另外，作为比较例6的用于检测ALK（L1196M）突变型的探针， 基于野生型的碱基序列（序列号2），设计由与序列号2所示的碱基序 列的第119位～第136位碱基对应的碱基构成、并且具有与第119位 碱基对应且被荧光标记的胞嘧啶的荧光标记寡核苷酸探针 5T-ALK-L1196M-WTF11（序列号41），并根据常规方法制作（表32）。 标记胞嘧啶的标记根据常规方法进行。

另外，作为模板核酸，使用具有与序列号1或序列号2所示的碱 基序列互补的碱基序列的模板寡核苷酸（野生型（序列号42）和突变 型（序列号43））。将模板寡核苷酸的序列示于表33中。作为样品， 单独使用野生型模板寡核苷酸、单独使用突变型模板寡核苷酸、将野 生型模板寡核苷酸和突变型模板寡核苷酸以1:1混合使用。

使用比较例5和比较例6的探针、各自的模板核酸，将激发波长 设为520nm～555nm、将检测波长设为585nm～700nm，分别测定源自 荧光标记探针的荧光强度的变化，除此之外，与实施例4同样地进行 Tm分析。

表32

表33

名称 序列(5′→3′) 序列号 ALK WT1souhosa1306 gctccaGcaggatgaacggggc 42 ALK mt1souhosa1306 gctccaTcaggatgaaccggggc 43

通过Tm分析，得到表示探针的荧光值变化量的图14（比较例5） 和图15（比较例6）。图中，纵轴表示每单位时间的荧光强度变化量(d 荧光强度增加量/t)，横轴表 示温度（℃）。图中，由菱形表示的图案示出仅使用野生型模板寡核 苷酸作为模板核酸时的结果，由方形表示的图案示出仅使用突变型模 板寡核苷酸作为模板核酸时的结果，由三角形表示的图案示出将野生 型模板寡核苷酸和突变型模板寡核苷酸以1:1混合作为模板核酸使用 时的结果。

比较例5中，如图14所示，野生型在57℃观察到峰，突变型在 60℃观察到峰，但在使用野生型和突变型的混合液的情况下也仅在59 ℃观察到一个峰。

另外，比较例6中，如图15所示，野生型在69℃观察到峰，突变 型在59℃观察到峰，但在使用野生型和突变型的混合液的情况下，清 楚的峰仅为59℃的峰。

因此可知，比较例5和比较例6的探针均不适于检测ALK （L1196M）的突变。

因此，根据本发明，能够同时或分别地灵敏度良好且简便地检测 ALK基因的突变、即ALK（L1196M）突变型和ALK（C1156Y）突变 型。

由此，能够简便地进行基于ALK基因突变的药剂、例如以ALK 抑制剂作为有效成分的抗癌药等药剂的药效评价。