使用荧光染料FITC与MITO鉴定混合精子的方法

摘要

一种使用荧光染料FITC与MITO鉴定混合精子的方法，属精子鉴定方法，将FITC粉末中加入DMSO配置FITC浓储液，将MITO粉末中加入DMSO配置MITO浓储液，HEPES、氯化镁、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、碳酸氢钠、丙酮酸钠、葡萄糖、乳酸钠、牛血清白蛋白和超纯水配置stainingtalp精子染色缓冲液，精子FITC染色、MITO染色，将用FITC染色后的精子与用MITO染色后的精子等量混合，FITC、MITO染色后和FITC染色与MITO染色后的精子等量混合后3h荧光检测。本发明的有益效果是：在不影响精子活力的条件下，只通过两种荧光染光可将形态相近的精子在一定时间内区分出来。

说明书

技术领域

本发明属于一种精子鉴定方法，特别涉及一种使用荧光染料FITC与MITO鉴定混合精子的方法。 

背景技术

不同物种的精子从形态上具有一定差别，可以通过形态进行辨别，但有些物种的精子形态相近、大小、精头部轮廓、尾部的长度仅仅通过显微镜进行辨别具有一定难度，特别是将两种精子混合后很难再区分彼此。目前对于形态相近的精子最好的方法就是通过不同的颜色进行辨别。将不同精子用不同染料染色后混合，可以通过各自的颜色来区分不同的精子，但荧光染料品种很多，由于染料没有特异性，因此混合后的不同精子染色后极易发生串色现象，串色后染成不同颜色的精子就变成同样颜色无法区分；有的对精子活力有影响；有的荧光持续时间短。为此，需要寻找出一种即能不影响精子活力，又可以不串色的将形态相近、无法通过显微镜进行区别的精子进行辨别的方法。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种使用荧光染料FITC与MITO鉴定混合精子的方法，该技术原理是利用FITC可以与精子膜蛋白结合发出黄绿色荧光，MITO与精子线粒体结合发出红色荧光，FITC与MITO对精子活力均无影响，两种不同精子用两种染料各自染色后混合在荧光下可区分两种精子。 

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种使用荧光染料FITC与MITO鉴定混合精子的方法，其特征在于：它包括以下步骤： 

一、配制试剂： 

（1）配置FITC浓储液： 

将FITC粉末中加入DMSO，使其终浓度为0.5M，分装后避光在-20℃保存，使用期限为1年； 

（2）配置MITO浓储液： 

将MITO粉末中加入DMSO,使其终浓度为0.069mM/L，分装后避光在-20℃保存，使用期限为1年； 

（3）配置staining talp精子染色缓冲液： 

二、精子染色： 

（1）精子FITC染色： 

①取500万精子加入5ml的staining talp精子染色缓冲液，使精子终浓度为100万/ml； 

②在步骤①的精子溶液中加入0.75μl的FITC浓储液，使其终浓度为0.077mM/L，轻轻摇动将染色液摇匀； 

③在37℃避光染色40分，将染色的精子轻轻摇晃； 

④染色结束后，1500rpm离心10分，弃上清，再加入5ml staining talp精子染色缓冲液，轻轻摇动； 

⑤1500rpm离心10分，弃上清，再加入5ml staining talp精子染色缓冲液，轻轻摇动； 

⑥1500rpm离心10分，弃上清，加入250μl staining talp精子染色缓冲液； 

（2）精子MITO染色： 

①取500万精子加入5ml的staining talp精子染色缓冲液，使精子终浓度 为100万/ml； 

②在步骤①的精子溶液中加入1.81μl的MITO浓储液，使其终浓度为3.45×10^-5mM/L，轻轻摇动将液体摇匀； 

③在37℃避光染色10分； 

④染色结束后，1500rpm离心10分，弃上清，再加入5ml staining talp精子染色缓冲液，轻轻摇动； 

⑤1500rpm离心10分，弃上清，再加入5ml staining talp精子染色缓冲液，轻轻摇动； 

⑥1500rpm离心10分，弃上清，加入250μl staining talp精子染色缓冲液； 

（3）精子混合： 

将步骤（1）用FITC染色后的精子与步骤（2）用MITO染色后的精子等量混合，放在37℃，3h； 

（4）检测： 

①对步骤（1）用FITC染色后的精子、步骤（2）用MITO染色后的精子进行荧光检测； 

②对步骤（3）FITC染色后的精子与MITO染色后的精子等量混合后3h的混合精子进行荧光检测。 

本发明的有益效果是：在不影响精子活力的条件下，只通过两种荧光染光就可将形态相近的精子在一定时间内区分出来。 

1、使用这两个荧光染料都不影响精子的活力 

  染色前精子活力 染色后精子活力 未染色组 0.65   FITC组 0.65 0.62 MITO组 0.65 0.6

染色组与未染色组的活力差异不显著。 

2、使用这两个荧光染料，不会短时间内串色； 

两种颜色精子以1:1进行混合，混合3h后统计结果 

  统计1 统计2 统计3 总计

绿色精子 52 60 47 159 红色精子 55 52 43 150

混合后3h精子的比例也趋近1:1。 

3、染料短时间内不褪色 

3h精子荧光强度变化 

  1h 2h 3h FITC +++ +++ +++ MITO +++ +++ +++

(注：“+”代表荧光强度） 

附图说明

图1是实施例1的FITC染色后牛精子灰度图； 

图2是实施例1的MITO染色后羊精子灰度图； 

图3是实施例1的FITC染色后的牛精子与MITO染色后的羊精子等量混合后，放在37℃，3h，荧光下观察灰度图； 

图4是实施例2的FITC染色后牛精子灰度图； 

图5是实施例2的MITO染色后牛精子灰度图； 

图6是实施例2的FITC染色后的牛精子与MITO染色后的牛精子等量混合后，放在37℃，3h，荧光下观察灰度图。 

具体实施方式

下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的保护范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定。 

实施例中所用药品FITC粉末、DMSO均购自SIGMA公司，MITO粉末购自INVITROGEN公司，没有特别指出的试剂均为市售产品。 

本发明中出现的英文缩写字母的解释如下： 

1、FITC粉末的英文名称是：Fluorescein isothiocyanate isomer I，sigma，F7250，中文名称是：异硫氰酸荧光素异构体I， 

2、DMSO的英文名称是：DIMETHYL SULPHOXIDE，中文名称是：二甲基亚砜， 

3、MITO粉末的英文名称是：Red FM-Special Packaging,invitrogen，M22425，中文名称是：线粒体红色荧光探针， 

4、HEPES的中文名称是：4-羟乙基哌嗪乙磺酸;N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸。 

实施例1： 

一种使用荧光染料FITC与MITO鉴定混合精子的方法，它包括以下步骤： 

1、配制试剂： 

（1）配置FITC浓储液： 

将FITC粉末中加入DMSO，使其终浓度为0.5M，分装后避光在-20℃保存，使用期限为1年； 

（2）配置MITO浓储液： 

将MITO粉末中加入DMSO,使其终浓度为0.069mM/L，分装后避光在-20℃保存，使用期限为1年； 

（3）配置staining talp精子染色缓冲液： 

2、精子染色： 

（1）牛精子FITC染色： 

①取500万牛精子加入5ml的staining talp精子染色缓冲液，使精子终浓度为100万/ml； 

②在步骤①的精子溶液中加入0.75μl的FITC浓储液，使其终浓度为 0.077mM/L，轻轻摇动将染色液摇匀； 

③在37℃避光染色40分，每隔10分将染色的精子轻轻摇晃； 

④染色结束后，1500rpm离心10分，弃上清，再加入5ml staining talp精子染色缓冲液，轻轻摇动； 

⑤1500rpm离心10分，弃上清，再加入5ml staining talp精子染色缓冲液，轻轻摇动； 

⑥1500rpm离心10分，弃上清，加入250μl staining talp精子染色缓冲液； 

（2）羊精子MITO染色： 

①取500万羊精子加入5ml的staining talp精子染色缓冲液，使精子终浓度为100万/ml； 

②在步骤①的精子溶液中加入1.81μl的MITO浓储液，使其终浓度为3.45×10^-5mM/L，轻轻摇动将液体摇匀； 

③在37℃避光染色10分； 

④染色结束后，1500rpm离心10分，弃上清，再加入5ml staining talp精子染色缓冲液，轻轻摇动； 

⑤1500rpm离心10分，弃上清，再加入5ml staining talp精子染色缓冲液，轻轻摇动； 

⑥1500rpm离心10分，弃上清，加入250μl staining talp精子染色缓冲液； 

（3）、精子混合： 

将步骤（1）用FITC染色后的牛精子与步骤（2）用MITO染色后的羊精子等量混合，放在37℃，3h； 

（4）、检测： 

①对步骤（1）用FITC和步骤（2）用MITO染色后的牛精子和羊精子进行荧光检测；见图1为FITC染色后牛精子，见图2为MITO染色后羊精子； 

②对步骤（3）FITC染色后的牛精子与MITO染色后的羊精子等量混合后，放在37℃，3h，在荧光下进行观察；见图3，绿色的为牛精子，红色的为羊精子。 

实施例2：一种使用荧光染料FITC与MITO鉴定混合精子的方法，它包括以 下步骤： 

1、配制试剂： 

（1）配置FITC浓储液： 

将FITC粉末中加入DMSO，使其终浓度为0.5M，分装后避光在-20℃保存，使用期限为1年； 

（2）配置MITO浓储液： 

将MITO粉末中加入DMSO,使其终浓度为0.069mM/L，分装后避光在-20℃保存，使用期限为1年； 

（3）配置staining talp精子染色缓冲液： 

2、精子染色： 

（1）牛精子FITC染色： 

①取500万牛精子加入5ml的staining talp精子染色缓冲液，使精子终浓度为100万/ml； 

②在步骤①的牛精子溶液中加入0.75μl的FITC浓储液，使其终浓度为0.077mM，轻轻摇动将染色液摇匀； 

③在37℃避光染色40分，每隔10分将染色的牛精子轻轻摇晃； 

④染色结束后，1500rpm离心10分，弃上清，再加入5ml staining talp精子染色缓冲液，轻轻摇动； 

⑤1500rpm离心10分，弃上清，再加入5ml staining talp精子染色缓冲 液，轻轻摇动； 

⑥1500rpm离心10分，弃上清，加入250μl staining talp精子染色缓冲液； 

（2）牛精子MITO染色 

①取500万牛精子加入5ml的staining talp精子染色缓冲液，使精子终浓度为100万/ml； 

②在步骤①的牛精子溶液中加入1.81μl的MITO浓储液，使其终浓度为3.45×10^-5mM，轻轻摇动将液体摇匀； 

③在37℃避光染色10分； 

④染色结束后，1500rpm离心10分，弃上清，再加入5ml staining talp精子染色缓冲液，轻轻摇动； 

⑤1500rpm离心10分，弃上清，再加入5ml staining talp精子染色缓冲液，轻轻摇动； 

⑥1500rpm离心10分，弃上清，加入250μl staining talp精子染色缓冲液； 

3、精子混合 

将步骤（1）用FITC染色后的牛精子与步骤（2）用MITO染色后的牛精子等量混合，放在37℃，3h； 

4、检测 

①FITC、MITO染色后荧光检测；图4为FITC染色后牛精子和图5为MITO染色后牛精子； 

②FITC染色后的牛精子与MITO染色后的牛精子等量混合后，放在37℃，3h，在荧光下进行观察；见图6； 

结论：两种颜色的精子混合3h后仍可以区分，并没有都串成相同的颜色无法分辨。因此，在区分任何相同或不同动物的精子时使用这两种荧光染料，既对精子无害，又可以区分不同和相同精子。