cccDNA标准品及其制备方法、定量检测乙肝病毒cccDNA的方法及试剂盒

摘要

本发明公开了一种cccDNA标准品以及制备方法，cccDNA标准品包括一个单位的HBV基因组DNA和一个重组位点attR。本发明还公开了一种使用上述cccDNA标准品的定量检测乙肝病毒cccDNA的方法和试剂盒。这种定量检测乙肝病毒cccDNA的方法以绿豆核酸酶清除rcDNA干扰的同时，制备HBV微环DNA作为cccDNA标准品，以PCR技术结合荧光标记探针杂交法对乙型肝炎病毒cccDNA进行定量检测，相对于传统的实时荧光定量PCR检测cccDNA，定量精确。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种cccDNA标准品及其制备方法、 定量检测乙肝病毒cccDNA的方法及试剂盒。

背景技术

乙肝病毒（HBV病毒）感染宿主后，HBV病毒松弛环状DNA（rcDNA） 进入宿主细胞细胞核形成的共价闭合环状的超螺旋双链DNA分子基因组，该共 价闭合环状的超螺旋双链DNA分子能形成环状的DNA结构，称为共价键密闭 环状DNA(cccDNA)。cccDNA是乙肝病毒的复制“池”，对cccDNA的准确定 量能辅助对乙肝病毒的诊断。

cccDNA和rcDNA在结构上有很大不同：rcDNA在正链与负链上均有缺口 或缺刻，只是部分区域互补故能形成环状结构，但非超螺旋结构；而cccDNA 两条链均是完整的，二者共价互补，形成超螺旋结构（Nassal,M.(2008).″Hepatitis B viruses:Reverse transcription a different way."Virus Research 134(1-2): 235-249）。由于缺口或缺刻的存在，rcDNA可以被一些核酸酶如外切核酸酶Ⅲ、 绿豆核酸酶等降解成寡核苷酸或单核苷酸，而cccDNA则由于是超螺旋且双链 结构均是完整的，一般不会被上述酶降解。上述差异是设计和建立cccDNA检 测技术的基础。

cccDNA的定性检测：既往绝大多数文献报道的是用Southern blot对cccDNA 进行定性检测，但技术要求较高，敏感度低。近年来，PCR技术对cccDNA进 行检测的技术得到发展。由于PCR技术灵敏度极高，rcDNA和cccDNA的序列 又具有高度的同源性，因此在用PCR技术检测cccDNA时，必须确保只能扩增 cccDNA而rcDNA不被扩增。目前利用rcDNA和cccDNA结构上的差异可以解 决这一问题。由于rcDNA的正链和负链上均存在缺口，故可以设计跨越两个缺 口的引物，使rcDNA不会被扩增，而cccDNA由于是完整的双链结构则可以被 选择性扩增。

cccDNA的定量检测：在定性检测的基础上，可以进一步对cccDNA进行定 量检测。He等建立了实时荧光定量PCR检测cccDNA的方法（Mark A Kay， Cheng-Yi He&Zhi-YingChen.(2010).″A robust system for production of minicircle DNA vectors."Nature Biotechnology 28(12):1287-1289），他们将TaqmanMGB探 针设计在负链缺刻的下游，与负链互补结合。对cccDNA，在上游引物的引导下， Taq酶到达TaqmanMGB探针所结合的位点，利用其5’→3’外切活性将探针 切断，3’端的淬灭基团失去对5’端的发光基团的抑制作用，从而产生荧光信 号。每扩增一个cccDNA分子，就会产生一个荧光信号，PCR仪可对产生的信 号进行实时监测，根据荧光信号的强弱对cccDNA进行定量。

目前最常用的定量检测cccDNA的方法是实时荧光定量PCR检测cccDNA。 如图1所示，该方法由一对跨rcDNA双缺口的特殊引物和一个荧光探针实现。 正义引物P1与负链互补结合，位于正链缺口上游，反义引物P2与正链互补结 合，位于负链缺口下游，rcDNA因为存在缺口而不被扩增，cccDNA则能被选 择性的扩增。在cccDNA负链缺口下游加入一个与负链互补的荧光探针，可实 现荧光定量PCR对cccDNA的定量分析。但是，由于cccDNA阳性标准品获得 困难，多为PCR扩增得到的cccDNA线性双链片段，其构象、链间作用力等理 化特征与天然的cccDNA相差甚远，从而对荧光定量PCR过程和结果造成影响， 使得cccDNA的定量不能精确。

发明内容

基于此，有必要提供一种cccDNA标准品及其制备方法、一种使用该cccDNA 标准品的定量精确的定量检测乙肝病毒cccDNA的方法及试剂盒。

一种cccDNA标准品，所述cccNDA标准品包括一个单位的HBV基因组 DNA和一个重组位点attR。

一种cccDNA标准品的制备方法，包括如下步骤：

首先将一个单位的HBV基因组DNA连接到含有重组位点attB和attP的微 环制备载体上，接着采用微环DNA制备技术，attB和attP重新组合后形成attR， 从而制备出HBV微环DNA，该HBV微环DNA即为所述cccDNA标准品。

在一个实施方式中，所述微环制备载体为微环制备载体ZY781。

一种定量检测乙肝病毒cccDNA的方法，包括如下步骤：

从待测物中提取DNA，并采用绿豆核酸酶去除得到的DNA中的rcDNA， 得到待测DNA样品；

制备cccDNA标准品，所述cccNDA标准品包括一个单位的HBV基因组 DNA和一个重组位点attR；

采用实时荧光定量PCR检测cccDNA的方法，设计跨越rcDNA两个缺刻的 一对引物和一个荧光探针引物，以所述cccDNA标准品制备标准曲线，对所述 待测DNA样品进行cccDNA的定量检测。

在一个实施方式中，还包括从待测物中提取DNA后测定环状DNA的浓度 的步骤。

在一个实施方式中，所述制备cccDNA标准品的步骤具体为：首先将一个 单位的HBV基因组DNA连接到含有重组位点attB和attP的微环制备载体上， 接着采用微环DNA制备技术，attB和attP重新组合后形成attR，从而制备出 HBV微环DNA，该HBV微环DNA即为所述cccDNA标准品。

在一个实施方式中，所述跨越rcDNA两个缺刻的一对引物和一个荧光探针 引物具体为：

上游引物：如SEQ ID No.1所示的DNA序列，

下游引物：如SEQ ID No.2所示的DNA序列，

荧光探针引物：FAM-如SEQ ID No.3所示的DNA序列-TAMRA。

一种定量检测乙肝病毒cccDNA的试剂盒，包括：

质粒提取试剂盒，用于从待测物中提取DNA；

绿豆核酸酶，用于降解rcDNA；

cccDNA标准品，所述cccNDA标准品包括一个单位的HBV基因组DNA 和一个重组位点attR；以及

跨越rcDNA两个缺刻的一对引物和一个荧光探针引物。

在一个实施方式中，所述备cccDNA标准品通过如下步骤制备：首先将一 个单位的HBV基因组DNA连接到含有重组位点attB和attP的微环制备载体上， 接着采用微环DNA制备技术，attB和attP重新组合后形成attR，从而制备出 HBV微环DNA，该HBV微环DNA即为所述cccDNA标准品。

在一个实施方式中，所述跨越rcDNA两个缺刻的一对引物和一个荧光探针 引物具体为：

上游引物：如SEQ ID No.1所示的DNA序列，

下游引物：如SEQ ID No.2所示的DNA序列，

荧光探针引物：FAM-如SEQ ID No.3所示的DNA序列-TAMRA。

这种定量检测乙肝病毒cccDNA的方法能够解决上述实时荧光定量PCR法 检测cccDNA假阳性的问题，以绿豆核酸酶清除rcDNA干扰的同时，制备HBV 微环DNA作为cccDNA标准品，以PCR技术结合荧光标记探针杂交法对乙型 肝炎病毒cccDNA进行定量检测，相对于传统的实时荧光定量PCR检测 cccDNA，定量精确。

附图说明

图1为实时荧光定量PCR检测cccDNA的PCR示意图；

图2为采用微环DNA制备技术制备cccDNA标准品的示意图；

图3为一实施方式的定量检测乙肝病毒cccDNA的方法的流程图。

具体实施方式

如图1所示，传统的采用实时荧光定量PCR检测cccDNA由一对跨rcDNA 双缺口的特殊引物和一个荧光探针实现。正义引物P1与负链互补结合，位于正 链缺口上游，反义引物P2与正链互补结合，位于负链缺口下游，rcDNA因为存 在缺口而不被扩增，cccDNA则能被选择性的扩增。在cccDNA负链缺口下游加 入一个与负链互补的荧光探针，可实现荧光定量PCR对cccDNA的定量分析。

然而，上述实时荧光定量PCR检测cccDNA的方法存在如下缺点：1、在 PCR检测cccDNA时，由于rcDNA的存在，起始模板量不能过高，否则引物P1 与P2对rcDNA的PCR产物自身退火（selfannealing）造成非特异扩增，cccDNA 假阳性出现，假阳性再通过荧光放大使得cccDNA的定量严重偏离实际。2、由 于cccDNA阳性标准品获得困难，多为PCR扩增得到的cccDNA线性双链片段， 其构象、链间作用力等理化特征与天然的cccDNA相差甚远，从而对荧光定量 PCR过程和结果造成影响，使得cccDNA的定量不能精确。

为了能够定量检测乙肝病毒cccDNA，需要提供cccDNA标准品。

提供一种cccDNA标准品，包括一个单位的HBV基因组DNA和一个重组 位点attR。

该cccDNA标准品通过如下方法制备得到。

首先将一个单位的HBV基因组DNA连接到含有重组位点attB和attP的微 环制备载体ZY781上，接着采用微环DNA制备技术（Mark A Kay，Cheng-Yi He& Zhi-Ying Chen.2010），如图2所示，attB和attP重新组合后形成attR，从而制备 出HBV微环DNA。该HBV微环DNA即为本步骤制备的cccDNA标准品。

该HBV微环DNA与乙肝cccDNA相比，仅仅多了一个35碱基的重组位点 attR同时HBV的复制单元被敲除，其理化性质相当于天然cccDNA。

该HBV微环DNA首次作为cccDNA的标准品使用，不同于以往其它技术。 是保证cccDNA精确定量的关键。

制备得到的cccDNA标准品可以转化入能生产重组酶及内切酶的工程菌 ZYCY10P3S2T表达扩增。

此外，还提供一种定量检测乙肝病毒cccDNA的方法，如图3所示，包括 如下步骤。

S10、从待测物中提取DNA，接着采用绿豆核酸酶去除提取得到的DNA中 的rcDNA，得到待测DNA样品。

一般选择质粒提取试剂盒（OMEGA E.Z.N.A.Plasmid Mini Kit）提取血液或 组织中的DNA，其中包括乙肝病毒的rcDNA、cccDNA以及其它DNA。

其具体操作过程参照OMEGA E.Z.N.A.Plasmid Mini Kit操作说明书。

提取完成后测定DNA的浓度，rcDNA、cccDNA为环状，相当于质粒DNA， 任何能测定质粒DNA浓度的仪器或方法都能测定提取的cccDNA。

绿豆核酸酶编号为EC 3.1.30.1，是一种单链特异的DNA和RNA内切酶， 降解DNA和RNA分子3′和5′端的单链突出产生可用于连接平端的DNA或 RNA片段。

由于rcDNA单链缺刻的存在，rcDNA能被绿豆核酸酶降解突出末端，从而 防止荧光定量PCR中由rcDNA扩增出的片段自身退火造成cccDNA假阳性。

而cccDNA中的两条DNA链均是完整的，二者共价互补，形成超螺旋结构。 因此，cccDNA不会被绿豆核酸酶降解。

S20、制备cccDNA标准品。

首先将来自陈志英、何成宜实验室的一个单位的HBV基因组DNA连接到 含有重组位点attB和attP的微环制备载体ZY781上，该载体来源于微环DNA 技术发明人陈志英、何成宜，接着采用微环DNA制备技术（Mark A Kay，Cheng-Yi He&Zhi-Ying Chen.2010），如图2所示，attB和attP重新组合后形成attR，从 而制备出HBV微环DNA。该HBV微环DNA即为本步骤制备的cccDNA标准 品。

该HBV微环DNA与乙肝cccDNA相比，多了一个35碱基的重组位点attR， 同时HBV的复制单元DR1和DR2（Michael Nassal.(2008).“Hepatitis B viruses: Reverse transcription a different way.”Virus Research 134:235-249）被敲除，该 HBV微环DNA不能复制，没有传染性，其理化性质相当于天然cccDNA。

该HBV微环DNA首次作为cccDNA的标准品使用，不同于以往其它技术。 是保证cccDNA精确定量的关键。

制备得到的cccDNA标准品可以转化入能生产重组酶及内切酶的工程菌 ZYCY10P3S2T表达扩增，该菌株来源于微环DNA技术发明人陈志英、何成宜。

S30、cccDNA的定量检测。

采用He等建立了实时荧光定量PCR检测cccDNA的方法（He ML,Wu J， Chen Y，Lin MC，Lau GK，Kung HF.(2002)“A new and sensitive method for the quantification of HBV cccDNA by real-time PCR.Biochem Biophys.”Res Commun 295:1102-1107）

设计跨越rcDNA两个缺刻的一对引物和一个荧光探针引物。

上游引物：5’-GCCCAAGGTCTTACATAA-3’（SEQ ID No.1），下游引物： 5’-CCAAATTCTTTATAAGGGT-3’（SEQ ID No.2），荧光探针引物：5’- FAM-CATCTCTTGTTCATGTCCTACTGTTC（SEQ ID No.3）-TAMRA-3’(FAM: 羧基荧光素，TAMRA:羧基四甲基罗丹明)。

以宝生物（TAKARA）的Premix Ex TaqTM II试剂对S10得到的 DNA样品进行精确定量。简要步骤如下：

第一步：按说明书组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。

第二步：进行Real Time PCR反应。

第三步：实验结果分析。反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解 曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。

每次定量时以精确定量的S20得到的cccDNA标准品制备标准曲线。标准 品的浓度分别为：

5copies/ml    10²copies/ml  10³copies/ml  10⁴copies/ml

10⁵copies/ml  10⁶copies/ml  10⁷copies/ml  10⁸copies/ml。

以每个浓度相应的荧光值计算标准曲线，对cccDNA定量的分辨率及精确 度大大提高。

这种定量检测乙肝病毒cccDNA的方法能够解决上述实时荧光定量PCR法 检测cccDNA假阳性和精确定量困难两大难题，以绿豆核酸酶清除rcDNA干扰 的同时，制备HBV微环DNA作为cccDNA定量标准品，以PCR技术结合荧光 标记探针杂交法对乙型肝炎病毒cccDNA进行定量检测，对科研和临床检测具 有辅助作用。

此外，还提供一种定量检测乙肝病毒cccDNA的试剂盒。

上述定量检测乙肝病毒cccDNA的试剂盒包括：质粒提取试剂盒、绿豆核 酸酶、cccDNA标准品以及跨越rcDNA两个缺刻的一对引物和一个荧光探针引 物。

质粒提取试剂盒用于从待检测血液或组织中提取DNA。

绿豆核酸酶用于降解rcDNA。

cccDNA标准品用于绘制标准曲线，其制备方法如下：

首先将一个单位的HBV基因组DNA连接到含有重组位点attB和attP的微 环制备载体ZY781上，接着采用微环DNA制备技术（Mark A Kay，Cheng-Yi He& Zhi-Ying Chen.2010），如图2所示，attB和attP重新组合后形成attR，从而制备 出HBV微环DNA。该HBV微环DNA即为本步骤制备的cccDNA标准品。

该HBV微环DNA与乙肝cccDNA相比，仅仅多了一个35碱基的重组位点 attR同时HBV的复制单元被敲除，其理化性质相当于天然cccDNA。

该HBV微环DNA首次作为cccDNA的标准品使用，不同于以往其它技术。 是保证cccDNA精确定量的关键。

制备得到的cccDNA标准品可以转化入能生产重组酶及内切酶的工程菌 ZYCY10P3S2T表达扩增。

跨越rcDNA两个缺刻的一对引物和一个荧光探针引物可以根据He等建立 了实时荧光定量PCR检测cccDNA的方法（Mark A Kay，Cheng-Yi He&Zhi-Ying Chen.(2010).″A robust system for production of minicircle DNA vectors."Nature Biotechnology 28(12):1287-1289）设计。

具体的，可以采用如下序列。

上游引物：5’-GCCCAAGGTCTTACATAA-3’（SEQ ID No.1），下游引物： 5’-CCAAATTCTTTATAAGGGT-3’（SEQ ID No.2），荧光探针引物：5’- FAM-CATCTCTTGTTCATGTCCTACTGTTC（SEQ ID No.3）-TAMRA-3’。

采用该定量检测乙肝病毒cccDNA的试剂盒检测乙肝病毒的方法基本与本 发明提供的定量检测乙肝病毒cccDNA的方法相同，在此不再重复。

以上所述实施例仅表达了本发明的一种或几种实施方式，其描述较为具体 和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对 于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若 干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围 应以所附权利要求为准。