肺炎嗜衣原体特异性抗原多肽的制备方法

摘要

本发明公开了肺炎嗜衣原体特异性抗原多肽的制备方法，通过肺炎嗜衣原体蛋白酶样活性因子CPAF(1-250)特异性抗原多肽，含该多肽的融合蛋白，其编码DNA，携带该DNA的重组载体，含该重组载体的转化子，产生抗体的方法，检测或测定抗体的方法和试剂，诊断肺炎嗜衣原体感染的方法和试剂。本发明可用于重组抗原的表达、医学临床病原微生物肺炎嗜衣原体感染者的诊断，特别是体外肺炎嗜衣原体诊断试剂的开发。

说明书

技术领域

本发明涉及肺炎嗜衣原体蛋白酶样活性因子CPAF(1-250)特异性抗原多肽，含该多肽的融合蛋白，其编码DNA，携带该DNA的重组载体，含该重组载体的转化子，产生抗体的方法，检测或测定抗体的方法和试剂，诊断肺炎嗜衣原体感染的方法和试剂。 

背景技术

衣原体是一类严格的真核细胞内寄生具有独特发育周期并能通过细菌滤器的原核细胞型微生物，其中肺炎嗜衣原体(Chlamydia pneumoniae)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis Ct)鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)是重要的人类致病菌。而肺炎嗜衣原体(Chlamydia pneumoniae，Cpn)是于1989年确定的一种严格真核细胞内寄生的原核细胞型微生物，它是重要的人类致病菌，主要引起各种急慢性呼吸系统疾病，同时也是上、下呼吸道感染的重要病原体之一，肺炎和支气管炎最常见，也可引起上呼吸道感染如咽炎、喉炎、鼻窦炎。衣原体肺炎临床表现与其他非典型病原体如支原体、呼吸道病毒感染无明显特异性。衣原体肺炎早期多表现为上呼吸道感染症状，如鼻炎、咽喉痛、声音嘶哑等；发热可伴肌痛、恶寒；这些症状持续数天到数周后好转，部分患者随后出现咳嗽(肺炎嗜衣原体感染呼吸道的主要特点)，及支气管炎、肺炎，表现为双阶段，延长了整个病程。衣原体肺炎区别与支原体肺炎的重要临床表现是大部分衣原体肺炎伴有喉炎；衣原体肺炎较肺炎链球 菌肺炎更易有头痛。肺炎嗜衣原体主要引起人的非典型性肺炎，同时还可致支气管炎、咽炎、鼻窦炎、中耳炎、虹膜炎、肝炎、心肌炎、心内膜炎、脑膜炎、结节性红斑等疾病，也是艾滋病、白血病等继发感染的重要病原菌之一，另外，流行病学和病原学研究认为，肺炎嗜衣原体感染与心血管疾病相关，已引起各国学者的高度重视。 

肺炎嗜衣原体感染在临床没有典型的表现，所以主要的诊断方法主要依靠实验室。可以通过病原体分离培养来直接检出，所以需要核酸检测和血清学实验。但由于肺炎嗜衣原体分离培养方法复杂、费时，而且敏感性不高，一般不用于临床诊断。所以临床上利用免疫荧光试验和酶联免疫吸附试验(ELISA)，而衣原体蛋白酶样活性因子(chlamydial protease-like activity factor，CPAF)做为在衣原体的致病过程中及衣原体与宿主的相互作用中发挥着重要蛋白，被认为是新颖的诊断分子蛋白。 

衣原体蛋白酶样活性因子(chlamydial protease-like activity factor，CPAF)，是目前发现的唯一由衣原体合成并分泌到宿主细胞内的蛋白，在衣原体的致病过程中及衣原体与宿主的相互作用中发挥着重要作用。其存在于被感染的宿主细胞中而由衣原体基因组编码并依赖于衣原体的复制。CPAF具有降解宿主细胞RFX5、USF-1和裂解角蛋白8的蛋白水解活性并且具有很强的免疫活性，在致病过程中起着重要作用。CPAF发挥作用的方式可能代表了衣原体逃避宿主免疫识别从而造成持续感染的一种新机制。因此获得CPAF重组蛋白抗原可以用于的衣原体感染的诊断标准蛋白的研发。 

发明内容

本发明所解决的技术问题在于提供一种肺炎嗜衣原体特异性抗原多肽的制备方法，以解决上述背景技术中的缺点。 

本发明可用于重组抗原的表达、医学临床病原微生物肺炎嗜衣原体感染者的诊断，特别是体外肺炎嗜衣原体诊断试剂的开发。 

为提高肺炎嗜衣原体感染的临床诊断的效率，提高特异性与灵敏度。筛选衣原体蛋白酶样活性因子蛋白序列，得到可能拥有特异性以及效好免疫原性的抗原多肽片段，并将其片段所编码的完整DNA片段构建于原核表达载体中进行重组诱导表达，并通过原核系统进行表达纯化得到蛋白。以及其后用免疫抗原制备单克隆抗体和多克隆，经纯化得到特异性抗体。 

一种肺炎嗜衣原体特异性抗原多肽的制备方法，包括以下步骤： 

(1)抗原片段的获得：利用生物信息学方法，在开始的生物信息资源数据库上收集肺炎嗜衣原体、沙眼衣原体以及鹦鹉热衣原体的衣原体蛋白酶样活性因子的同源蛋白质序列，运用多序列比对程序clustalw进行多序列比对分析，肺炎嗜衣原体、沙眼衣原体以及鹦鹉热衣原体多种同源CPAF蛋白，寻找肺肺炎嗜衣原体最特异性的片段，随后进行抗原表位分析，寻找到了优势特异性CPAF的蛋白表达区段Met1-Ser250，并进一步做原核载体的构建与表达纯化； 

(2)抗原蛋白的获得：从CPAF编码基因调取相对应的基因核酸片段，总长度为750bp，并利用其进行亚克隆构建到原核表达重组质粒pGEX-4T-2中，通过调整诱导表达条件，确定蛋白质表达的最佳条件为：37度1mM IPTG诱导表达4小时之后可以收集菌体，并通过蛋白质纯化，得到高纯度的重组蛋白质，此 蛋白质为N端谷胱转移酶融合蛋白，其重组蛋白通过SDS-PAGE鉴定纯度； 

(3)特异性抗体制备：将原核表达纯化得到的纯度大于95％的重组蛋白除去内毒素，再进行动物免疫，通过三次腹腔注射重组蛋白使小鼠对其产生免疫反应，取小鼠腹水纯化得到抗血清，经过进一步的纯化与分离得到多克隆抗体，将CPAF(1-250)特异性抗原免疫小鼠后，取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，经多次筛选获得阳性的单克隆细胞株，并进行腹水生产和单克隆抗体制备，采用ELISA技术和Western blot技术对制备的单克隆抗体和多克隆抗体进行效价以及特异性的评价，本发明涉及的特异性抗体效价大于1∶20000。 

本发明还提供针对CPAF特异性抗原多肽制备单克隆抗体和多克隆抗体的方法，检测特异性抗体的方法，从而利用CPAF特异性抗原和抗体可检测肺炎嗜衣原体的感染。 

附件1肺炎嗜衣原体CPAF蛋白优势抗原片段 

SEQ-ID-NO1： 

MKKGKLGAIVFGLLFTSSVAGFSKDLTKDNAYQDLNVIEHLISLKYAPLPWKELLFGWDLSQQTQQAR 

LQLVLEEKPTTNYCQKVLSNYVRSLNDYHAGITYRTESAYIPYVLKLSEDGHVFVVDVQTSQGDIYLG 

DEILEVDGMGIREAIESLRFGRGSATDYSAAVRSLTSRSAAFGDAVPSGIAMLKLRRPSGLIRSTPVRWR 

YTPEHIGDFSLVAPLIPEHKPQLPTQSCVLFRSGVNSQSSSSS 

附件2肺炎嗜衣原体CPAF蛋白优势抗原位点分析 

SEQ-ID-NO2：119-DGHVFVVDVQTS-130，Score＝1.228 Length＝12

SEQ-ID-NO3：106-ESAYIPYVLKLS-117，Score＝1.176 Length＝12

SEQ-ID-NO4：215-DFSLVAPLIPEHKPQLPTQSCVLFRSG-241 Score＝1.175 Length＝27

SEQ-ID-NO5：79-TNYCQKVLSNYVRSLNDY-96，Score＝1.166 Length＝18

SEQ-ID-NO6：6-LGAIVFGLLFTSSVAGFS-23，Score＝1.156 Length＝18

SEQ-ID-NO7：66-QARLQLVLEE-75，Score＝1.155 Length＝10

SEQ-ID-NO9：133-DIYLGDEILEV-143，Score＝1.058 Length＝11

SEQ-ID-NO10：195-PSGLIRSTPVRWR-207，Score＝1.092 Length＝13

SEQ-ID-NO11：179-FGDAVPSGIAMLKLR-193，Score＝1.088 Length＝15

附件3肺炎嗜衣原体CPAF基因编码DNA序列.SEQ-ID-NO2： 

ATGAAAAAAGGGAAATTAGGAGCCATAGTTTTTGGCCTTCTATTTACAAGTAGTGTTGCTGGTTTTT 

CTAAGGATTT GACTAAAGACAACGCTTATCAAGATTTAAATGTCATAGAGCATTTAATATCGTTAAA 

ATATGCTCCTTTACCATGGAAGGAACTATTATTTGGTTGGGATTTATCTCAGCAAACACAGCAAGCT 

CGCTTGCAACTGGTCTTAGAAGAAAAACCAACAACCAACTACTGCCAGAAGGTACTCTCTAACTA 

CGTGAGATCATTAAACGATTATCATGCAGGGATTACGTTTTATCGTACTGAAAGTGCGTATATCCCTT 

ACGTATTGAAGTTAAGTGAAGATGGTCATGTCTTTGTAGTCGACGTACAGACTAGCCAAGGGGATA 

TTTACTTAGGGGATGAAATCCTTGAAGTAGATGGAATGGGGATTCGTGAGGCTATCGAAAGCCTTC 

GCTTTGGACGAGGGAGTGCCACAGACTATTCTGCTGCAGTTCGTTCCTTGACATCGCGTTCCGCCG 

CTTTTGGAGATGCGGTTCCTTCAGGAATTGCCATGTTGAAACTTCGCCGACCCAGTGGTTTGATCC 

GTTCGACACCGGTCCGTTGGCGTTATACTCCAGAGCATATCGGAGATTTTTCTTTAGTTGCTCCTTT 

GATTCCTGAACATAAACCTCAATTACCTACACAAAGTTGTGTGCTATTCCGTTCCGGGGTAAATTCA 

CAGTCTTCTAGTAGCTCT 

附件4肺炎嗜衣原体CPAF与沙眼衣原体与鹦鹉热衣原体同源蛋白序列比较.(1)Score＝196bits(499)，Expect＝2e＝55，Method：Compositional matrix adjust.Identities＝105/251(42％)，Positives＝156/251(62％)，Gaps＝7/251(3％)(2)Score＝252bits(644)，Expect＝2e-76，Method：Compositional matrix adjust.Identities＝124/223(56％)，Positives＝157/223(70％)，Gaps＝1/223(0％) 

附件5肺炎嗜衣原体CPAF构建方案序列. 

引物序列： 

CPAF-(1-250)：F’CATGCGAATTCATGAAAAAAGGGAAAT(Bam HI) 

CPAF-(1-250)：R’CATGCCTCGAGAGAGCTACTAGAAGATT(XhoI) 

有益效果： 

本发明提供CPAF特异性抗原多肽，包括抗原多肽的生物信息学筛选方式、利用基因重组技术制备特异性抗原的方法，它不与肺炎嗜衣原体之外的病原菌种属中其它种类的抗体反应，本方法更方便，成本更低。 

具体实施方式

为了使本发明的技术手段、创作特征、工作流程、使用方法达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。 

附件1中. 

根据生物信息学资源库查询得到的肺炎嗜衣原体蛋白酶样活性因子(CPAF)优势抗原肽全部氨基酸序列，Met1-Ser250，共250个残基(SEQ ID NO1)。 

附件2中. 

以生物信息学工具DNAMAN对肺炎嗜衣原体蛋白酶样活性因子(CPAF)优势抗原肽抗原(1-250)氨基酸残基进行抗原表位分析，并进行计分。此段蛋白质序列拥有多于10个抗原表位的氨基酸序列，同时分值较高，是比较良好的抗原区段。 

附件3中. 

此片段编码蛋白质对应的全部核酸序列 

附件4中。 

利用生物信息软件Clustw对6种衣原体CPAF蛋白质做同源比较(1-250)片段进行多序列比较。通过序列比较肺炎嗜衣原体的蛋白质氨基酸与其它同源蛋白的一致性为38％(95/250残基)，而氨基酸的相似性为43％(108./250)。说明其片段是肺炎嗜衣原体比较特异的区段， 与其它的衣原体蛋白质能够很好的进行区分。符合特异性抗原制备的要求。 

(1)肺炎嗜衣原体片段与沙眼衣原体片段同源比较 

(2)肺炎嗜衣原体片段与鹦鹉热衣原体片段同源比较 

附件5中. 

以生物信息学工具DNAMAN设计构建方案，最后制得纯化得到相应片段的重组蛋白。 

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。