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法律状态信息
法律状态
2016-01-20
授权
授权
2014-07-30
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N15/85 申请日:20140417
实质审查的生效
2014-07-02
公开
公开
技术领域
本发明属于水产经济动物基因工程育种技术领域，涉及一种提高鱼类omega-3多不饱和 脂肪酸的方法及应用，具体涉及促进多不饱和脂肪酸合成的两个去饱和酶fat2和fat1重组 基因，涉及这两个重组基因表达载体的制备方法，还涉及这两个重组基因共同配合使用的方 法，以及该方法在鱼类基因工程育种中的用途。
背景技术
Omega-3多不饱和脂肪酸，包括DHA和EPA是一类有利于人体健康的脂肪酸。越来越 多的流行病学和临床调查表明，EPA和DHA对很多疾病有预防和缓解的作用，这些疾病包 括动脉粥样硬化、心血管疾病、中风、神经疾病、肥胖、2型糖尿病、癌症和自身免疫疾病。 但是，包括人类在内的高等动物，缺少omega-3去饱和酶和delta-12去饱和酶，因此失去从 头合成这类脂肪酸的能力(Nakamura,2004)，必需从食物中获取这类脂肪酸。
深海鱼类是omega-3脂肪酸的主要来源。从头合成的长链omega-3多不饱和脂肪酸的主 要来源是海洋中的藻类，海洋鱼类通过摄食这些富含omega-3脂肪酸的海藻，使得omega- 3多不饱和脂肪酸在它们体内积累。目前，海洋渔业资源逐渐地枯竭(FAO,2012)。鱼粉价 格的上升，使得水产养殖中使用植物油脂和植物蛋白替代传统生产中使用的鱼油和鱼粉(Mi ller,2008)。这使得水产养殖鱼类中omega-3脂肪酸含量不断降低。这些矛盾和问题迫使人 们不断寻找和开发新的omega-3脂肪酸的食物来源。
转基因技术作为一种新的育种手段(Chen,1996)(Fu,2005)(Zhu,2000)，可以赋予转基因 动物本身不具备的能力。运用转基因技术促进鱼类多不饱和脂肪酸的合成已经在斑马鱼这种 模式动物中尝试。这些研究的主要策略是通过转基因过表达涉及长链多不饱和脂肪酸合成的 延长酶和去饱和酶(Alimuddin,2005;Alimuddin,2008;Alimuddin,2007;Kabeya,2014)，这些 延长酶和去饱和酶能够以18:2n-6和18:3n-3底物，进一步合成长链的ARA、EPA和DHA 多不饱和脂肪酸。
然而，包括斑马鱼在内的淡水鱼类自身拥有脂肪酸去饱和酶和延长酶(Monroig,2011)。 淡水鱼从食物摄取短链不饱和脂肪酸（如18:2n-6,或18:3n-3）后，它们可以通过去饱和酶和 延长酶生成长链多不饱和脂肪酸（20:4n-6,或20:5n-3）。并且omega-3长链多不饱和脂肪酸E PA和DHA的生成是底物浓度依赖(Senadheera,2011)(Thanuthong,2011)，即18:3n-3浓度依 赖的。在鱼类中过表达脂肪酸去饱和酶和延长酶基因，从而提高长链多不饱和脂肪酸的合成 通路活性，这种策略并不能从根本上解决鱼类缺少从头合成omega-3多不饱和脂肪酸能力的 问题，即不能从头生成18:3n-3的能力。
fat2基因是线虫中的一个delta-12去饱和酶基因，它可以将18:1转化成18:2n-6(Peyou- Ndi,2000)，是一个填补不饱和脂肪酸从头合成通路断裂的一个重要的去饱和酶基因。fat1 基因是在线虫中的一个omega-3去饱和酶，它可以将omega-6不饱和脂肪酸转变成omega- 3不饱和脂肪酸(Spychalla,1997;Kang,2001),如将18:2n-6转变成18:3n-3；20:4n-6转变成2 0:5n-3。因此，我们提出，同时将两个脂肪酸去饱和酶fat2和fat1基因引入鱼类中，可以使 鱼类获得从头合成omega3多不饱和脂肪酸的能力，即从18:1生成18:2n-6，18:2n-6生成1 8:3n-3；通过两个脂肪酸去饱和酶基因的同时配合作用，一方面fat2和fat1为omega-3长链 多不饱和脂肪酸的生成提供更多的18:3n-3底物，另一方面，fat1基因还可以将omega-6长 链多不饱和脂肪酸转变成omega-3长链多不饱和脂肪酸。因此，fat2和fat1重组基因的同时 使用，可以增加鱼类的omega-3脂肪酸含量。这种方法为omega-3多不饱和脂肪酸的获取提 供了新的食物来源。
发明内容
本发明的目的是提供了一种提高鱼类omega-3多不饱和脂肪酸的方法，方法简单，易行， 可获得富含omega-3多不饱和脂肪酸的经济鱼类，适于大规模生产。
本发明的另一个目的是提供了一种提高鱼类omega-3多不饱和脂肪酸的方法的应用，通 过将delta-12去饱和酶fat2基因和omega-3去饱和酶fat1基因通过转基因技术同时引入鱼类 中，这两个基因的配合使用，填补了鱼类omega-3多不饱和脂肪酸合成通路的两处断裂，使 鱼类获得从头合成omega-3多不饱和脂肪酸的能力。其中，鱼类密码子优化的delta-12脂肪 酸去饱和酶（fat2）基因，delta-12去饱和酶可以将18:1转变成18:2n-6，从而填补了鱼类多 不饱和脂肪酸从头合成通路的第一个断裂。omega-3去饱和酶fat1基因可以将18:2n-6和20: 4n-6转化为18:3n-3和20:5n-3，填补了鱼类多不饱和脂肪酸从头合成通路的第二个断裂。
为了实现上述目的，本发明采用了以下技术措施：
设计和获得鱼类密码子优化的delta-12去饱和酶基因，其步骤如下：
1）根据线虫的delta-12去饱和酶基因的氨基酸序列和斑马鱼的密码子偏好，设计鱼类密码 子优化的delta-12去饱和酶fat2基因序列，其序列为SEQ ID NO.1所示，编码的蛋白质序 列为SEQ ID NO.4所示。
2）人工合成鱼类密码子优化delta-12去饱和酶fat2基因序列。
构建fat2和fat1转基因表达载体，其具体步骤如下：
A、构建含有绿色荧光报告元件的转基因表达载体pTol2-CMV-SV40poly(A);CMV:EGFP-S V40poly(A)；
1）获得pTol2-SV40载体
设计含有多克隆位点的自退火引物：
MCS-F：CCGCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCT
MCS-R：CTATTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCAA。
通过PCR自退火获得一段两侧含XhoI和XbaI酶切位点，中间含有SalI、EcoRI、HindI II和BamHI4个酶切位点的片段。用XhoI和XbaI酶切4xKGFP质粒(Distel,2009)，保留 该质粒上的Tol2元件和SV40poly(A)终止序列，将该酶切片段与重叠延伸PCR所的片段连 接，获得pTol2-SV40载体；
2）获得pTol2-CMV-SV40载体
设计扩增CMV启动子，并且两侧附XhoI和SalI位点的引物：
CMV-F：CCGCTCGAGGCGTTATCCCCTGATTCTGT
CMV-R：ACGCGTCGACCGGATCTGACGGTTCACTAA
以质粒pEGFP-N1（Invitrogen）为模板，用引物CMV-F和CMV-R通过PCR扩增出C MV启动子，酶切后插入pTol2-SV40载体，获得pTol2-CMV-SV40载体；
3）获得pTol2-CMV-SV40poly(A);CMV:EGFP-SV40poly(A)载体
设计引物重叠延伸PCR(Heckman,2007)引物：
SP1：GGAAGATCTGCGTTATCCCCTGATTCTGT
SP2：GTCTGGATCACTTGTACAGCTCGTCCATG
SP3：GCTGTACAAGTGATCCAGACATGATAAGATACA
SP4：CCGCTCGAGAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAAC
以质粒pEGFP-C1（Invitrogen）和pCS2+（Invitrogen）为模板，以引物SP1、SP2、SP 3和SP4，通过重叠延伸PCR方法(Heckman,2007)通过两轮PCR获得CMV驱动EGFP表 达，并且末端为SV40poly(A)信号的表达框，将这个表达框用BglII和XhoI酶切位点插入p Tol2-CMV-SV40载体，最终获得pTol2-CMV-SV40poly(A);CMV:EGFP-SV40poly(A)载体； B、构建含有红色荧光报告元件的转基因表达载体pTol2-CMV-SV40poly(A);CMV:mCherry- SV40poly(A)；
设计扩增mCherry阅读框,并且两侧附NheI和XhoI酶切位点引物序列：
Cherry-F：CTAGCTAGCGCCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGG
Cherry-R：CCGCTCGAGAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAAC
以质粒TK5xC(Distel,2009)为模板，用引物Cherry-F和Cherry-R通过PCR扩增出mC herry片段。将PCR片段用NheI和XhoI酶切位点插入pTol2-CMV-SV40poly(A);CMV:EG FP-SV40poly(A)载体，将EGFP阅读框替换成为mCherry阅读框，获得pTol2-CMV-SV40 poly(A);CMV:mCherry-SV40poly(A)表达载体；
C、构建fat2转基因表达载体pCMV:Cel.Fat2,CMV:mCherry；
设计扩增fat2阅读框，并两侧附HindIII和BamHI酶切位点的引物序列：
fat2Fr：CCCAAGCTTGCCGCCACCATGACCATCGCTACCAAAGTG
fat2Re：CGCGGATCCTTACTGTGCCTTCTTTGCC
以质粒fat2_pUC57为模板，用引物fat2Fr和fat2Re通过PCR将fat2基因扩增，通过H indIII和BamHI酶切位点将fat2克隆插入含有红色荧光报告元件的pTol2-CMV-SV40poly (A);CMV:mCherry-SV40poly(A)转基因表达载体；
最终获得pCMV:fat2,CMV:mCherry表达载体，其序列为SED ID NO.2所示。
D、构建fat1转基因表达载体pCMV:fat1;CMV:EGFP,；
设计扩增fat1阅读框，并且两侧附EcoRI and XbaI酶切位点的引物：
fat1Fr：CCGGAATTCGCCGCCACCATGGTCGCTCATTCCAGCGAAG
fat1Re：GCAAAACCGGTGAAAACG
以质粒pCAGGS-fat1(Kang,2004)为模板，用引物fat1Fr和fat1Re通过PCR将fat1基 因扩增，通过EcoRI and XbaI酶切位点将fat1克隆插入含有绿色荧光报告元件的pTol2-C MV-SV40poly(A);CMV:EGFP-SV40poly(A)转基因表达载体，最终获得pCMV:fat1;CMV: EGFP表达载体，其序列为SED ID NO.3所示。
一种提高鱼类omega-3多不饱和脂肪酸的方法，其具体步骤如下：
A、建立fat2和fat1基因的转基因鱼家系，即Tg(CMV:fat2;CMV:mCherry)和Tg(CMV:fat1;C MV:EGFP)：
具体为：通过显微注射法(Zhu,1985)将fat2和fat1转基因表达载体pCMV:fat2,CMV:m Cherry和pCMV:fat1;CMV:EGFP分别导入鱼类受精卵中，筛选出F0代转基因鱼；
所述的表达载体pCMV:fat2,CMV:mCherry的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；
所述的表达载体pCMV:fat1;CMV:EGFP的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示；
B、将步骤A中获得的F0代转基因鱼饲养至性成熟与野生型鱼交配，筛选出F1代转基因鱼， 将F1代转基因鱼再与野生型鱼交配，筛选出F2代转基因鱼；
筛选方法：利用fat2和fat1基因转基因表达载体上存在的红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白报 告基因，方便快捷地初步筛选获得表达fat2和fat1的转基因鱼。通过转基因PCR法和反转 录PCR法进一步确证fat2和fat1的转基因鱼的成功获得;
设计fat2转基因鱼的检测引物：
fat2-F：AGACTATGAGTGGCTGAACG
fat2-R：GGGATGTCCTTTGTCCTTCT
设计fat1转基因鱼的检测引物：
fat1-F：TCTCCGATAATCAGAATCTCAATG
fat1-R：CGAAGAAAGAAAGTGGAACCC
C、步骤B中获得转基因F2或F1代鱼为亲本，杂交筛选出同时表达fat2和fat1的双转基 因鱼即可。
一种提高鱼类omega-3多不饱和脂肪酸的方法在制备富含omega-3多不饱和脂肪酸斑马鱼 中的应用，其步骤如下
将fat2和fat1的双转基因鱼、fat2转基因鱼、fat1转基因鱼和野生型鱼饲养于同一个鱼 缸（鱼塘）中，投喂EPA和DHA低含量的饲料。比较fat2和fat1的双转基因鱼、fat2单转 基因鱼、fat1单转基因鱼和野生型鱼的肌肉组织中脂肪酸组分的差异。
所述的鱼为斑马鱼、黄颡鱼、鲤鱼或团头鲂。
与现有技术相比，本发明专利具有如下优点和效果：
在水产养殖中，投喂高含量鱼油饲料可以获得富含omega-3多不饱和脂肪酸的养殖鱼类。 鱼油来自于海洋捕捞的海水鱼类，随着海洋渔业资源的逐渐枯竭，这种办法显然是不可持续 型的，并且不利于海洋资源保护。
通过转基因过表达涉及长链多不饱和脂肪酸合成的延长酶和去饱和酶，提高鱼类从18: 2n-6和18:3n-3生成20:4n-6和20:5n-3的长链不饱和脂肪酸生成通路活性的这种策略，不能 从根本上解决鱼类缺乏从头生成omega-3多不饱和脂肪酸能力的问题。
本发明专利通过基因工程的方法，即在鱼类中同时引入delat-12去饱和酶fat2基因和o mega-3去饱和酶fat1基因，填补了鱼类omega-3多不饱和脂肪酸从头合成通路的断裂，赋 予鱼类从头合成omega-3多不饱和脂肪酸的能力。这种基因工程育种方法赋予转基因动物新 的能力，并且是一种适应当下资源环境要求的能力的基因工程育种方法。这也体现出基因工 程方法在可持续发展，保护资源方面无法比拟的优势。
另外一方面，本发明专利从根本上解决了鱼类缺乏从头生成omega-3多不饱和脂肪酸能 力的问题。在斑马鱼中通过转基因过表达脂肪酸延长酶和去饱和酶，DHA含量增加10%到 26.8%。而本发明专利中，DHA可增加180%。由此可见，赋予鱼类从头合成omega-3多不 饱和脂肪酸的能力的优势。
附图说明
图1为本发明构建fat2和fat1基因表达载体示意图。
其中A为fat2基因表达载体示意图，B为fat1基因表达载体示意图；CMV真核表达启 动子，fat2为鱼类密码子优化的delta-12脂肪酸去饱和酶基因，mCherry为红色荧光蛋白基 因，SV40poly(A)为稳定mRNA的3’端序列，Tol2为Tol2转座子转座元件。
图2为野生型和转基因斑马鱼胚胎示意图。
其中A为36hpf野生型斑马鱼胚胎，B为红色荧光蛋白标记36hpf的fat2转基因斑马鱼 胚胎，C为绿色荧光蛋白标记36hpf的fat1转基因斑马鱼胚胎，D为红色和绿色荧光蛋白同 时标记的36hpf的fat2和fat1转基因斑马鱼胚胎。
图3为fat2和fat1基因在转基因斑马鱼肌肉组织中的表达。
其中A为fat2基因在Tg(CMV:fat2;CMV:mCherry)转基因斑马鱼肌肉组织中的表达，泳 道1-3：fat2转基因，泳道4：野生型，B为fat1基因在Tg(CMV:fat1;CMV:EGFP)转基因斑 马鱼肌肉组织中的表达，泳道1-3：fat1转基因，泳道4：野生型，C为fat2和fat1基因在T g(CMV:fat1;CMV:EGFP)/Tg(CMV:fat2;CMV:mCherry)双转基因斑马鱼肌肉组织中的表达， 泳道1-3：双转基因，泳道4：野生型。
图4为转基因斑马鱼肌肉组织中的脂肪酸组成。
注：*表示统计学上有显著差异（P<0.05）,***表示统计学上有非常显著性差异（P <0.005）。
图5为fat2和fat1双转基因填补了鱼类中多不饱和脂肪酸从头合成的断裂示意图。
在斑马鱼的体内，脂肪酸去饱和酶fadsd2基因和脂肪酸延长酶elovl2、elovl5基因经 过一系列的连续反应，将18:2n-6和18:3n-3转化成20:4n-6和20:5n-3。20:5n-3生成 22:6n-3可能存在Δ4去饱和酶通路或Δ6去饱和酶通路。fat2可以将18:1转化成18:2n-6，fat1 可以将18:2n-6和20:4n-6转化成18:3n-3和20:5n-3。缺少delta-12去饱和酶fat2和omega-3 去饱和酶fat1基因导致omega-3长链多不饱和脂肪酸合成通路断裂。
具体实施方式
本发明所述的试剂，如未特别说明，均购自生化商店，所述实验步骤，如未特别说明， 均为本领域的常规步骤。
实施例1：
设计和获得鱼类密码子优化的delta-12去饱和酶基因
1）根据线虫的delta-12去饱和酶fat2基因的氨基酸序列(GenBank:AF240777.1)和斑马鱼的 密码子使用偏好，设计鱼类密码子优化的delta-12去饱和酶基因序列，其序列为SEQ ID N O.1所示。
2）鱼类密码子优化delta-12去饱和酶fat2基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示。
3）人工合成鱼类密码子优化delta-12去饱和酶fat2基因序列（上海金斯瑞公司），fat2基因 序列插入到pUC57载体中。
实施例2：
fat2和fat1转基因表达载体的构建：
A、构建含有绿色荧光报告元件的转基因表达载体pTol2-CMV-SV40poly(A);CMV:EGFP-S V40poly(A)
1）获得pTol2-SV40载体
设计含有多克隆位点的自退火引物：
MCS-F：CCGCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCT
MCS-R：CTATTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCAA
通过PCR自退火获得一段两侧含XhoI和XbaI酶切位点，中间含有SalI、EcoRI、Hind III和BamHI4个酶切位点的片段。PCR自退火的条件是：MCS-F和MCS-R按照1：1混 合，各自终浓度为50uM，以0.5℃/30秒的降温速度，从95℃下降至16℃。即95℃维持30 秒，94.5℃维持30秒，94℃维持30秒，温度依次下降至16℃。
用XhoI和XbaI酶切4xKGFP质粒，保留该质粒上的Tol2元件和SV40poly(A)终止序 列，将该酶切片段与自退火所的片段连接，获得pTol2-SV40载体，具体操作：
在37℃水浴条件下，用限制性内切酶XhoI和XbaI(Takara)双酶切4xKGFP质粒中4-6 小时，参照Axygen公司的DNA胶回收试剂盒回收酶切产物。在室温中，将回收的DNA载 体骨架和PCR自退火的多克隆位点片段，用T4连接酶(NEB)连接30分钟，然后将连接产 物转化大肠杆菌TOP10菌株（购自Invitrogen公司）。转化的具体过程为：在冰上将连接产 物加入冰上融解的感受态细胞中，轻混匀；冰浴30分钟；42℃热激90秒，冰浴2分钟； 加入800ul LB培养基，37℃，120rpm培养45分钟；涂平板，37℃培养12-16h（常规方法， 分子克隆实验指南，第二版，J.萨姆布鲁克等著，科学出版社，1993）。
用引物M13-F:GTAAAACGACGGCCAG，和M13-R：CAGGAAACAGCTATGAC进行 PCR筛选阳性克隆，扩增条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，55℃复性30秒， 72℃延伸100秒，30个循环；72℃延伸10分钟；16℃保存。阳性克隆的扩增产物片段 大小为1600bp。将阳性克隆送交上海英俊公司测定，获得pTol2-SV40载体。
2）获得pTol2-CMV-SV40载体
设计扩增CMV启动子，并且两侧附XhoI和SalI位点的引物：
CMV-F：CCGCTCGAGGCGTTATCCCCTGATTCTGT
CMV-R：ACGCGTCGACCGGATCTGACGGTTCACTAA
以质粒pEGFP-N1（Invitrogen）为模板，用引物CMV-F和CMV-R通过PCR扩增出C MV启动子。PCR扩增条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，55℃复性30秒，7 2℃延伸40秒，30个循环；72℃延伸10分钟；16℃保存。扩增产物片段大小为575bp， DNA清洁试剂盒回收（Axygen）PCR产物。
将CMV启动子DNA片段在37℃水浴中用限制性内切酶XhoI和SalI(Takara)双酶切4 -6小时，DNA清洁试剂盒回收（Axygen）酶切产物。
37℃水浴条件下，用限制性内切酶XhoI和SalI(Takara)双酶切pTol2-SV40载体4-6小 时，DNA清洁试剂盒回收（Axygen）酶切产物。
在室温中,将回收的pTol2-SV40载体骨架和CMV启动子DNA片段，用T4连接酶(NE B)连接30分钟，最后将连接产物转化大肠杆菌TOP10菌株。
用引物CMV-N-F:CTCTGCTTATATAGACCTCCCA，和M13-R：CAGGAAACAGCTA TGAC进行PCR筛选阳性克隆，扩增条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，56℃ 复性30秒，72℃延伸60秒，30个循环；72℃延伸10分钟；16℃保存，阳性克隆的 扩增产物片段大小为928bp。将阳性克隆送交上海英俊公司测定，获得pTol2-CMV-SV40载 体。
3）获得pTol2-CMV-SV40poly(A);CMV:EGFP-SV40poly(A)载体。
设计引物重叠延伸PCR引物：
SP1：GGAAGATCTGCGTTATCCCCTGATTCTGT
SP2：GTCTGGATCACTTGTACAGCTCGTCCATG
SP3：GCTGTACAAGTGATCCAGACATGATAAGATACA
SP4：CCGCTCGAGAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAAC
以质粒pEGFP-C1（Invitrogen）和pCS2+（Invitrogen）为模板，以引物SP1、SP2、SP 3和SP4，通过重叠延伸PCR方法，通过两轮PCR获得CMV驱动EGFP表达，并且末端 为SV40poly(A)信号的表达框，将这个表达框用BglII和XhoI酶切位点插入pTol2-CMV-S V40载体，最终获得pTol2-CMV-SV40poly(A);CMV:EGFP-SV40poly(A)载体，具体操作如 下：
以质粒pEGFP-C1（Invitrogen）为模板，用引物SP1和SP2通过PCR扩增出CMV启动 子驱动EGFP表达的DNA序列。PCR扩增条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒， 55℃复性90秒，72℃延伸90秒，30个循环；72℃延伸10分钟；16℃保存。扩增产物 片段大小为1330bp，DNA清洁试剂盒回收（Axygen）PCR产物。
以质粒pCS2+（Invitrogen）为模板，用引物SP3和SP4通过PCR扩增出SV40poly(A) 信号。PCR扩增条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，55℃复性30秒，72℃延 伸20秒，30个循环；72℃延伸10分钟；16℃保存。扩增产物片段大小为196bp，DNA 清洁试剂盒回收（Axygen）PCR产物。
以50ng的CMV启动子驱动EGFP表达的DNA和50ng的SV40poly(A)信号DNA为P CR反应模板，用引物SP1和SP4通过PCR扩增出CMV驱动EGFP表达，并且末端为SV 40poly(A)信号的表达框。PCR扩增条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，58℃ 复性30秒，72℃延伸120秒，30个循环；72℃延伸10分钟；16℃保存。扩增产物片段 大小为1529bp，DNA清洁试剂盒回收（Axygen）PCR产物。
37℃水浴条件下，用限制性内切酶BglII和XhoI(Takara)双酶切CMV驱动EGFP表达， 并且末端为SV40poly(A)信号的表达框的PCR产物4-6小时，DNA清洁试剂盒回收（Axy gen）酶切产物。
37℃水浴条件下，用限制性内切酶BglII和XhoI(Takara)双酶切pTol2-CMV-SV40载体 4-6小时，DNA清洁试剂盒回收（Axygen）酶切产物。在室温中,将回收的pTol2-CMV-SV4 0载体骨架和CMV驱动EGFP表达，并且末端为SV40poly(A)信号的表达框的酶切DNA 片段，用T4连接酶(NEB)连接30分钟，最后将连接产物转化大肠杆菌TOP10菌株。
用引物EGFP-F:GGATGTTGCCGTCCTCCTTG，和M13-R：CAGGAAACAGCTATGA C进行PCR筛选阳性克隆，扩增条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，55℃复 性30秒，72℃延伸90秒，30个循环；72℃延伸10分钟；16℃保存，阳性克隆的扩增 产物片段大小为1300bp。将阳性克隆送交上海英俊公司测定，最终获得pTol2-CMV-SV40 poly(A);CMV:EGFP-SV40poly(A)载体。
B、构建含有红色荧光报告元件的转基因表达载体pTol2-CMV-SV40poly(A);CMV:mCherry- SV40poly(A)
设计扩增mCherry阅读框,并且两侧附NheI和XhoI酶切位点引物序列：
Cherry-F：CTAGCTAGCGCCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGG
Cherry-R：CCGCTCGAGAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAAC
以质粒TK5xC(Distel,2009)为模板，用引物Cherry-F和Cherry-R通过PCR扩增出mC herry片段。将PCR片段用NheI和XhoI酶切位点插入pTol2-CMV-SV40poly(A);CMV:EG FP-SV40poly(A)载体，将EGFP阅读框替换成为mCherry阅读框，获得pTol2-CMV-SV40 poly(A);CMV:mCherry-SV40poly(A)表达载体，具体操作如下：
以质粒TK5xC为模板，用引物Cherry-F和Cherry-R通过PCR扩增出mCherry片段。P CR扩增条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，54℃复性30秒，72℃延伸45秒， 30个循环；72℃延伸10分钟；16℃保存。扩增产物片段大小为720bp，DNA清洁试剂盒 回收（Axygen）PCR产物。
37℃水浴条件下，用限制性内切酶NheI和XhoI(Takara)双酶切mCherry DNA片段4- 6小时，DNA清洁试剂盒回收（Axygen）酶切产物。
37℃水浴条件下，用限制性内切酶NheI和XhoI(Takara)双酶切pTol2-CMV-SV40poly (A);CMV:EGFP-SV40poly(A)载体4-6小时，DNA清洁试剂盒回收（Axygen）酶切产物。
在室温中,将回收的pTol2-CMV-SV40poly(A);CMV:EGFP-SV40poly(A)载体骨架和m Cherry DNA片段，用T4连接酶(NEB)连接30分钟，最后将连接产物转化大肠杆菌TOP10 菌株。
利用引物mCherryN-F:CACGGAGCCCTCCATGTGC，和M13-R：CAGGAAACAGCT ATGAC进行PCR筛选阳性克隆，扩增条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，55℃ 复性30秒，72℃延伸60秒，30个循环；72℃延伸10分钟；16℃保存，阳性克隆的 扩增产物片段大小为970bp。将阳性克隆送交上海英俊公司测定，最终获得pTol2-CMV-SV 40poly(A);CMV:mCherry-SV40poly(A)表达载体。
C、构建fat2转基因表达载体pCMV:fat2,CMV:mCherry,其序列为SED ID NO.2所示；
设计扩增fat2阅读框，并两侧附HindIII和BamHI酶切位点的引物序列：
fat2Fr：CCCAAGCTTGCCGCCACCATGACCATCGCTACCAAAGTG
fat2Re：CGCGGATCCTTACTGTGCCTTCTTTGCC
以质粒fat2_pUC57为模板，用引物fat2Fr和fat2Re通过PCR将fat2基因扩增，通过H indIII和BamHI酶切位点将fat2克隆插入含有红色荧光报告元件的pTol2-CMV-SV40poly (A);CMV:mCherry-SV40poly(A)转基因表达载体，具体操作如下：
以质粒fat2_pUC57为模板，用引物fat2Fr和fat2Re通过PCR将fat2基因扩增，PCR 扩增条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，54℃复性30秒，72℃延伸80秒，3 0个循环；72℃延伸10分钟；16℃保存。扩增产物片段大小为1131bp，DNA清洁试剂盒 回收（Axygen）PCR产物。
在37℃水浴条件下，用限制性内切酶HindIII和BamHI(Takara)双酶切fat2DNA片段 4-6小时，DNA清洁试剂盒回收（Axygen）酶切产物。
在37℃水浴条件下，用限制性内切酶HindIII和BamHI(Takara)双酶切pTol2-CMV-SV 40poly(A);CMV:mCherry-SV40poly(A)载体4-6小时，DNA清洁试剂盒回收（Axygen）酶 切产物。
在室温中,将回收的pTol2-CMV-SV40poly(A);CMV:mCherry-SV40poly(A)载体骨架和f at2DNA片段，用T4连接酶(NEB)连接30分钟，最后将连接产物转化大肠杆菌TOP10菌 株。
用引物M13-F：GTAAAACGACGGCCAG和fat2R:CCCTGGGTCACAGAGGAAGA进 行PCR筛选阳性克隆，扩增条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，54℃复性30 秒，72℃延伸120秒，30个循环；72℃延伸10分钟；16℃保存，阳性克隆的扩增产物 片段大小为1955bp。将阳性克隆送交上海英俊公司测定，最终获得pCMV:fat2,CMV:mCher ry转基因表达载体，其序列为SEQ ID NO.2所示，载体示意图见图1中A。
D、构建fat1转基因表达载体pCMV:Cel.Fat1,CMV:EGFP,其序列为SED ID NO.3所示；
设计扩增fat1阅读框，并且两侧附EcoRI and XbaI酶切位点的引物：
fat1Fr：CCGGAATTCGCCGCCACCATGGTCGCTCATTCCAGCGAAG
fat1Re：GCAAAACCGGTGAAAACG
从质粒pCAGGS-fat1(Kang,2004)为模板，用引物fat1Fr和fat1Re通过PCR将fat1基 因扩增，通过EcoRI and XbaI酶切位点将fat1克隆插入含有绿色荧光报告元件的pTol2-C MV-SV40poly(A);CMV:EGFP-SV40poly(A)转基因表达载体,具体操作如下：
从质粒pCAGGS-fat1为模板，用引物fat1Fr和fat1Re通过PCR将fat1基因扩增，PCR 扩增条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，58℃复性30秒，72℃延伸80秒，3 0个循环；72℃延伸10分钟；16℃保存。扩增产物片段大小为1206bp，DNA清洁试剂盒 回收（Axygen）PCR产物。
在37℃水浴条件下，用限制性内切酶EcoRI and XbaI(Takara)双酶切fat1DNA片段4 -6小时，DNA清洁试剂盒回收（Axygen）酶切产物。
在37℃水浴条件下，用限制性内切酶EcoRI and XbaI(Takara)双酶切pTol2-CMV-SV4 0poly(A);CMV:EGFP-SV40poly(A)载体4-6小时，DNA清洁试剂盒回收（Axygen）酶切 产物。
在室温中,将回收的pTol2-CMV-SV40poly(A);CMV:EGFP-SV40poly(A)载体骨架和fat 1DNA片段，用T4连接酶(NEB)连接30分钟，最后将连接产物转化大肠杆菌TOP10菌株。
利用引物M13-F：GTAAAACGACGGCCAG和fat1-R：TCTCCGATAATCAGAATCTC AATG进行PCR筛选阳性克隆，扩增条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，54℃ 复性30秒，72℃延伸140秒，30个循环；72℃延伸10分钟；16℃保存，阳性克隆的 扩增产物片段大小为2086bp。将阳性克隆送交上海英俊公司测定，最终获得pCMV:fat1,CM V:EGFP转基因表达载体，其序列为SEQ ID NO.3所示，载体示意图见图1中B。
实施例3：
一种提高斑马鱼omega-3多不饱和脂肪酸的方法，其步骤是：
A、建立fat2和fat1基因的转基因斑马鱼家系，即Tg(CMV:fat2,CMV:mCherry)和Tg(CMV:f at1,CMV:EGFP)：
1）通过显微注射法(Zhu,1985)将fat2和fat1转基因表达载体分别导入斑马鱼受精卵中。
将25ng/ul的转基因载体DNA和25ng/ul的Tol2转座酶RNA的混合液注射入1细胞期 的受精的斑马鱼胚胎中，注射24小时后，将表达红色或绿色荧光蛋白的胚胎挑选出来饲养 至性成熟。
2）筛选转基因成功的斑马鱼。
利用fat2和fat1基因转基因表达载体上存在的红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白报告基因， 方便快捷地初步筛选获得表达fat2和fat1的转基因斑马鱼。即将转基因F0代与野生型鱼交 配，获得它们的子代胚胎，将表达红色或绿色荧光蛋白的子代胚胎饲养成熟，获得转基因F 1代转基因鱼(Xiong,2013)。结果见图2中B、C。以相同方法获得F2代转基因鱼。
3）通过反转录PCR法进一步确证fat2和fat1的转基因鱼的成功获得：
设计fat2转基因鱼的检测引物：
fat2-F：AGACTATGAGTGGCTGAACG
fat2-R：GGGATGTCCTTTGTCCTTCT
设计fat1转基因鱼的检测引物：
fat1-F：TCTCCGATAATCAGAATCTCAATG
fat1-R：CGAAGAAAGAAAGTGGAACCC
用Trizol(Invitrogen)提取转基因阳性胚胎的总RNA。37℃水浴条件下用DNase I(Prome ga)酶切总RNA,去除总RNA中的基因组DNA的污染。以Oligod(T)为反转录引物，用反转 录酶ReverTra Ace（TOYOBO）获得cDNA。反应条件为42℃孵育60分钟。PCR检测c DNA中fat2和fat1基因，PCR扩增条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，58℃ 复性30秒，72℃延伸30秒，30个循环；72℃延伸10分钟；16℃保存。扩增产物片段 大小分别为102bp和423bp。结果见图3。
B、以fat2和fat1转基因F2代斑马鱼为亲本，杂交获得同时表达fat2和fat1的双转基因斑 马鱼。通过红色和绿色荧光蛋白以及反转录PCR确定fat2和fat1双转基因斑马鱼的获得。 结果见图2中D和图3中C。
实施例4：一种提高斑马鱼omega-3多不饱和脂肪酸的方法在制备富含omega-3多不饱和 脂肪酸斑马鱼中的应用，其步骤如下：
A、将实施例3中制备的fat2和fat1的双转基因斑马鱼、fat2转基因斑马鱼、fat1转基因斑 马鱼和野生型斑马鱼饲养于同一个鱼缸（鱼塘）中，投喂EPA(0.2%)和DHA(0%)低含量的 饲料。
B、检测转基因斑马鱼肌肉组织中的脂肪酸含量。
在4℃条件下，用含有0.005%丁基羟基甲苯（Sigma）抗氧化剂的氯仿/甲醇（2：1）溶 液抽提斑马鱼肌肉的总脂肪酸，氮气吹走有机溶剂。甲酯化总脂肪酸，即在100℃水浴条件 下，用含有5%硫酸的甲醇溶液处理总脂肪酸1h。
用气象色谱(TRACE GC,Thermo Scientific)定量分析甲酯化的总脂肪酸组分。气象色 谱以FID为检测器，氮气为载气，条件是40℃/分钟的升温速度从50℃升温至170℃，然后 以18℃/分钟的升温速度升温至210℃，210℃维持28分钟。
fat2单转基因斑马鱼肌肉组织中，18:1与野生型相比减少10.3%(25.3%vs.28.2%;P <0.05)，18:2n-6含量与野生型相比增加30.8%(11.9%vs.9.1%;P<0.05)。这表明在斑 马鱼中，Fat2去饱和酶能有效地将18:1转化成为18:2n-6。结果见图4
fat1单转基因斑马鱼肌肉组织中，18:3n-3含量与野生型相比增加52.5%(9.0%vs.5.9%; P<0.005)，20:5n-3含量与野生型相比增加81.3%(2.9%vs.1.6%;P<0.005)，22:6n-3 含量与野生型相比增加135.2%(12.7%vs.5.4%;P<0.005)。同时，18:2n-6含量与野生型相 比减少14.3%(7.8%vs.9.1%;P<0.005)。这表明在斑马鱼中，Fat1去饱和酶能有效地将n -6PUFA转化成为n-3PUFA。结果见图4。
fat2和fat1的双转基因斑马鱼肌肉组织中，18:1含量与野生型相比减少了37.6%(17.6% vs.28.2%;P<0.005)，18:2-6含量与野生型相比没有明显改变(9.7%vs.9.1%;P>0.0 5),但是与fat2单转基因斑马相比，减少了18.5%(9.7%vs.11.9%;P<0.005)，表明部分1 8:2-6被Fat1转化成18:3n-3。18:3n-3含量与野生型相比增加45.8%(8.6%vs.5.9%;P< 0.05)，20:5n-3含量与野生型相比增加68.8%(2.7%vs.1.6%;P<0.005)，22:6n-3含量与 野生型相比增加175.9%(14.9%vs.5.4%;P<0.005)。22:6n-3含量与fat1单独转基因相比 增加了17.3%。这表明，fat2和fat1共同配合使用，能有效提高鱼类体内的omega-3多不饱 和脂肪酸含量。结果见图4。
实施例5：
一种提高鲤鱼、团头鲂或黄颡鱼omega-3多不饱和脂肪酸的方法，其步骤是：
A、建立fat2和fat1基因的转基因鲤鱼、团头鲂或黄颡鱼家系，即Tg(CMV:fat2;CMV:mChe rry)和Tg(CMV:fat1;CMV:EGFP)。
具体为：通过显微注射法(Zhu,1985)将fat2和fat1转基因表达载体（pCMV:fat2,CMV: mCherry和pCMV:fat1;CMV:EGFP表达载体）分别导入鲤鱼、团头鲂或黄颡鱼受精卵中，将 表达红色或绿色荧光蛋白的胚胎挑选出来饲养至性成熟。将这些鱼饲养至性成熟，与野生型 鱼交配，获得它们的子代胚胎(Xiong,2013);
B、利用fat2和fat1基因转基因表达载体上存在的红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白报告基因， 方便快捷地初步筛选获得表达fat2和fat1的转基因鲤鱼、团头鲂或黄颡鱼。即将转基因F0 代与野生型鱼交配，获得它们的子代胚胎，将表达红色或绿色荧光蛋白的子代胚胎饲养成熟， 获得转基因F1代转基因鱼，以相同方法获得F2代转基因鱼。通过转基因PCR法和反转录 PCR法进一步确证fat2和fat1的转基因鱼的成功获得;
设计fat2转基因鱼的检测引物：
fat2-F：AGACTATGAGTGGCTGAACG
fat2-R：GGGATGTCCTTTGTCCTTCT
设计fat1转基因鱼的检测引物：
fat1-F：TCTCCGATAATCAGAATCTCAATG
fat1-R：CGAAGAAAGAAAGTGGAACCC
用Trizol(Invitrogen)提取转基因阳性鲤鱼、团头鲂或黄颡鱼胚胎的总RNA。37℃水浴条件下 用DNase I(Promega)酶切总RNA,去除总RNA中的基因组DNA的污染。以Oligod(T)为反 转录引物，用反转录酶ReverTra Ace（TOYOBO）获得cDNA。反应条件为42℃孵育60分 钟。PCR检测cDNA中fat2和fat1基因，PCR扩增条件为：95℃预变性5分钟；95℃ 变性30秒，58℃复性30秒，72℃延伸30秒，30个循环；72℃延伸10分钟；16℃ 保存。扩增产物片段大小分别为102bp和423bp。
C、以fat2和fat1转基因F2代鱼为亲本，杂交获得同时表达fat2和fat1的双转基因鲤鱼、 团头鲂或黄颡鱼，通过红色和绿色荧光蛋白以及反转录PCR确定fat2和fat1双转基因的获 得。
实施例6：
一种提高鲤鱼、团头鲂或黄颡鱼omega-3多不饱和脂肪酸的方法在制备富含omega-3 多不饱和脂肪酸鲤鱼、团头鲂或黄颡鱼中的应用，其步骤如下：
A、将实施例5中制备的双转基因鲤鱼、团头鲂或黄颡鱼与其对应的野生鱼饲养于同一个鱼 塘中，投喂EPA(0.2%)和DHA(0%)低含量的饲料。
B、检测转基因斑马鱼肌肉组织中的脂肪酸含量。
在4℃条件下，用含有0.005%丁基羟基甲苯（Sigma）抗氧化剂的氯仿/甲醇（2：1）溶液抽 提鲤鱼肌肉的总脂肪酸，氮气吹走有机溶剂。甲酯化总脂肪酸，即在100℃水浴条件下，用 含有5%硫酸的甲醇溶液处理总脂肪酸1h。
用气象色谱(TRACE GC,Thermo Scientific)定量分析甲酯化的总脂肪酸组分。气象色谱以F ID为检测器，氮气为载气，条件是40℃/分钟的升温速度从50℃升温至170℃，然后以18℃ /分钟的升温速度升温至210℃，210℃维持28分钟。
fat2和fat1双转基因鲤鱼肌肉组织中，18:3n-3含量与野生型相比增加6.3倍，20:5n-3 含量与野生型相比增加3.8倍，22:6n-3含量与野生型相比增加57%。
fat2和fat1双转基因团头鲂和黄颡鱼和肌肉组织中，与野生型相比omega-3多不饱和脂 肪酸（22:6n-3）的含量均显著增加。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院水生生物研究所
<120> 一种提高鱼类omega-3多不饱和脂肪酸的方法及应用
<130> 一种提高鱼类omega-3多不饱和脂肪酸的方法及应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 1131
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
atgaccatcg ctaccaaagt gaataccaac aaaaaggatc tggatacaat caaagtgccc 60
gaactgccct ctgtcgctgc cgtgaaggct gccatcccag agcactgttt cgtgaaggac 120
cccctgacaa gcatctctta tctgattaaa gattacgtgc tgctggccgg cctgtatttt 180
gcagtcccct atatcgagca ttacctgggc tggattggtc tgctgggatg gtactgggca 240
atgggcatcg tgggtagcgc tctgttctgt gtcggccacg actgcggaca tggctccttt 300
tcagactatg agtggctgaa cgatctgtgc ggtcacctgg cacatgctcc aatcctggca 360
cctttctggc catggcagaa gtctcacaga cagcaccatc agtacacctc ccacgtggag 420
aaggacaaag gacatccctg ggtcacagag gaagattata acaataggac cgctatcgaa 480
aaatactttg ccgtgatccc catttcaggc tggctgcgct ggaatcctat ctatactatt 540
gtcggactgc ccgacggcag tcacttttgg ccttggagca gactgttcga gacaaccgaa 600
gatagggtga agtgtgctgt gtcaggtgtc gcctgtgcaa tctgcgctta cattgccttt 660
gtgctgtgcg attatagtgt gtacactttc gtcaaatact attacatccc tctgctgttt 720
cagggactga ttctggtgat cattacatat ctgcagcacc agaacgagga catcgaagtg 780
tacgaggccg atgaatgggg tttcgtccgc ggacagactc agacaattga cagacattgg 840
ggttttggac tggataatat catgcacaac attactaatg gccatgtggc ccaccatttc 900
tttttcacaa agatcccaca ctaccatctg ctggaggcaa cccctgctat taagaaagca 960
ctggaaccac tgaaggacac ccagtatgga tacaaaaggg aggtgaacta taattggttt 1020
ttcaagtatc tgcactacaa cgtcaccctg gattacctga ctcataaagc caagggtgtc 1080
ctgcagtata gaagtggcgt ggaagccgca aaggcaaaga aggcacagta a 1131
<210> 2
<211> 8255
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
caggaaacag ctatgaccat gattacgcca agcgcgcaat taaccctcac taaagggaac 60
aaaagctgga gctccaccgc ggcagaggtg taaaaagtac tcaaaaattt tactcaagtg 120
aaagtacaag tacttaggga aaattttact caattaaaag taaaagtatc tggctagaat 180
cttacttgag taaaagtaaa aaagtactcc attaaaattg tacttgagta ttagatctgc 240
gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccatg cattagttat taatagtaat 300
caattacggg gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg 360
taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt 420
atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac 480
ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg 540
acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact 600
ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt 660
ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc 720
ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc 780
gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata 840
taagcagagc tggtttagtg aaccgtcaga tccgctagcg ccgccaccat ggtgagcaag 900
ggcgaggagg ataacatggc catcatcaag gagttcatgc gcttcaaggt gcacatggag 960
ggctccgtga acggccacga gttcgagatc gagggcgagg gcgagggccg cccctacgag 1020
ggcacccaga ccgccaagct gaaggtgacc aagggtggcc ccctgccctt cgcctgggac 1080
atcctgtccc ctcagttcat gtacggctcc aaggcctacg tgaagcaccc cgccgacatc 1140
cccgactact tgaagctgtc cttccccgag ggcttcaagt gggagcgcgt gatgaacttc 1200
gaggacggcg gcgtggtgac cgtgacccag gactcctccc tgcaggacgg cgagttcatc 1260
tacaaggtga agctgcgcgg caccaacttc ccctccgacg gccccgtaat gcagaagaag 1320
accatgggct gggaggcctc ctccgagcgg atgtaccccg aggacggcgc cctgaagggc 1380
gagatcaagc agaggctgaa gctgaaggac ggcggccact acgacgctga ggtcaagacc 1440
acctacaagg ccaagaagcc cgtgcagctg cccggcgcct acaacgtcaa catcaagttg 1500
gacatcacct cccacaacga ggactacacc atcgtggaac agtacgaacg cgccgagggc 1560
cgccactcca ccggcggcat ggacgagctg tacaagtaac tcgaccgatc ctgagaactt 1620
cagggtgagt ttggggaccc ttgattgttc tttctttttc gctattgtaa aattcatgtt 1680
atatggaggg ggcaaagttt tcagggtgtt gtttagaatg ggaagatgtc ccttgtatca 1740
ccatggaccc tcatgataat tttgtttctt tcactttcta ctctgttgac aaccattgtc 1800
tcctcttatt ttcttttcat tttctgtaac tttttcgtta aactttagct tgcatttgta 1860
acgaattttt aaattcactt ttgtttattt gtcagattgt aagtactttc tctaatcact 1920
tttttttcaa ggcaatcagg gtatattata ttgtacttca gcacagtttt agagaacaat 1980
tgttataatt aaatgataag gtagaatatt tctgcatata aattctggct ggcgtggaaa 2040
tattcttatt ggtagaaaca actacaccct ggtcatcatc ctgcctttct ctttatggtt 2100
acaatgatat acactgtttg agatgaggat aaaatactct gagtccaaac cgggcccctc 2160
tgctaaccat gttcatgcct tcttctcttt cctacagctc ctgggcaacg tgctggttgt 2220
tgtgctgtct catcattttg gcaaagaatt aattcctcga cggatcgtag atccagacat 2280
gataagatac attgatgagt ttggacaaac cacaactaga atgcagtgaa aaaaatgctt 2340
tatttgtgaa atttgtgatg ctattgcttt atttgtaacc attataagct gcaataaaca 2400
agttaacaac aacaattgca ttcattttat gtttcaggtt cagggggagg tgtgggaggt 2460
tttttctcga ggcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc atgcattagt 2520
tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga gttccgcgtt 2580
acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg cccattgacg 2640
tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg 2700
gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt 2760
acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg 2820
accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg 2880
gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt 2940
ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac 3000
tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg 3060
tgggaggtct atataagcag agctggttta gtgaaccgtc agatccggtc gacggtatcg 3120
ataagcttgc cgccaccatg accatcgcta ccaaagtgaa taccaacaaa aaggatctgg 3180
atacaatcaa agtgcccgaa ctgccctctg tcgctgccgt gaaggctgcc atcccagagc 3240
actgtttcgt gaaggacccc ctgacaagca tctcttatct gattaaagat tacgtgctgc 3300
tggccggcct gtattttgca gtcccctata tcgagcatta cctgggctgg attggtctgc 3360
tgggatggta ctgggcaatg ggcatcgtgg gtagcgctct gttctgtgtc ggccacgact 3420
gcggacatgg ctccttttca gactatgagt ggctgaacga tctgtgcggt cacctggcac 3480
atgctccaat cctggcacct ttctggccat ggcagaagtc tcacagacag caccatcagt 3540
acacctccca cgtggagaag gacaaaggac atccctgggt cacagaggaa gattataaca 3600
ataggaccgc tatcgaaaaa tactttgccg tgatccccat ttcaggctgg ctgcgctgga 3660
atcctatcta tactattgtc ggactgcccg acggcagtca cttttggcct tggagcagac 3720
tgttcgagac aaccgaagat agggtgaagt gtgctgtgtc aggtgtcgcc tgtgcaatct 3780
gcgcttacat tgcctttgtg ctgtgcgatt atagtgtgta cactttcgtc aaatactatt 3840
acatccctct gctgtttcag ggactgattc tggtgatcat tacatatctg cagcaccaga 3900
acgaggacat cgaagtgtac gaggccgatg aatggggttt cgtccgcgga cagactcaga 3960
caattgacag acattggggt tttggactgg ataatatcat gcacaacatt actaatggcc 4020
atgtggccca ccatttcttt ttcacaaaga tcccacacta ccatctgctg gaggcaaccc 4080
ctgctattaa gaaagcactg gaaccactga aggacaccca gtatggatac aaaagggagg 4140
tgaactataa ttggtttttc aagtatctgc actacaacgt caccctggat tacctgactc 4200
ataaagccaa gggtgtcctg cagtatagaa gtggcgtgga agccgcaaag gcaaagaagg 4260
cacagtaagg atccactagt tctagaacta tagtgagtcg tattactcga ccgatcctga 4320
gaacttcagg gtgagtttgg ggacccttga ttgttctttc tttttcgcta ttgtaaaatt 4380
catgttatat ggagggggca aagttttcag ggtgttgttt agaatgggaa gatgtccctt 4440
gtatcaccat ggaccctcat gataattttg tttctttcac tttctactct gttgacaacc 4500
attgtctcct cttattttct tttcattttc tgtaactttt tcgttaaact ttagcttgca 4560
tttgtaacga atttttaaat tcacttttgt ttatttgtca gattgtaagt actttctcta 4620
atcacttttt tttcaaggca atcagggtat attatattgt acttcagcac agttttagag 4680
aacaattgtt ataattaaat gataaggtag aatatttctg catataaatt ctggctggcg 4740
tggaaatatt cttattggta gaaacaacta caccctggtc atcatcctgc ctttctcttt 4800
atggttacaa tgatatacac tgtttgagat gaggataaaa tactctgagt ccaaaccggg 4860
cccctctgct aaccatgttc atgccttctt ctctttccta cagctcctgg gcaacgtgct 4920
ggttgttgtg ctgtctcatc attttggcaa agaattaatt cctcgacgga tcgtagatcc 4980
agacatgata agatacattg atgagtttgg acaaaccaca actagaatgc agtgaaaaaa 5040
atgctttatt tgtgaaattt gtgatgctat tgctttattt gtaaccatta taagctgcaa 5100
taaacaagtt aacaacaaca attgcattca ttttatgttt caggttcagg gggaggtgtg 5160
ggaggttttt taattcgcgg ccgccaccgc ggattaccct gttatcccta agctccagct 5220
tttgttccct ttagtgaggg ttaattgcgc gtcgagccgg gcccaagtga tctccaaaaa 5280
ataagtactt tttgactgta aataaaattg taaggagtaa aaagtacttt tttttctaaa 5340
aaaatgtaat taagtaaaag taaaagtatt gatttttaat tgtactcaag taaagtaaaa 5400
atccccaaaa ataatactta agtacagtaa tcaagtaaaa ttactcaagt actttacacc 5460
tctgggtacc caattcgccc tatagtgagt cgtattacgc gcgctcactg gccgtcgttt 5520
tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc 5580
cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt 5640
tgcgcagcct gaatggcgaa tggaaattgt aagcgttaat attttgttaa aattcgcgtt 5700
aaatttttgt taaatcagct cattttttaa ccaataggcc gaaatcggca aaatccctta 5760
taaatcaaaa gaatagaccg agatagggtt gagtgttgtt ccagtttgga acaagagtcc 5820
actattaaag aacgtggact ccaacgtcaa agggcgaaaa accgtctatc agggcgatgg 5880
cccactacgt gaaccatcac cctaatcaag ttttttgggg tcgaggtgcc gtaaagcact 5940
aaatcggaac cctaaaggga gcccccgatt tagagcttga cggggaaagc cggcgaacgt 6000
ggcgagaaag gaagggaaga aagcgaaagg agcgggcgct agggcgctgg caagtgtagc 6060
ggtcacgctg cgcgtaacca ccacacccgc cgcgcttaat gcgccgctac agggcgcgtc 6120
aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca 6180
ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa 6240
aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt 6300
ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca 6360
gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag 6420
ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc 6480
ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca 6540
gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt 6600
aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct 6660
gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt 6720
aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga 6780
caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact 6840
tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc 6900
acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga 6960
gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt 7020
agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga 7080
gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact catatatact 7140
ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga 7200
taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt 7260
agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca 7320
aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct 7380
ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta 7440
gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct 7500
aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc 7560
aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca 7620
gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga 7680
aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg 7740
aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt 7800
cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag 7860
cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt 7920
tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt 7980
tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga 8040
ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta 8100
atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa 8160
tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc cggctcgtat 8220
gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcaca 8255
<210> 3
<211> 7695
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
caggaaacag ctatgaccat gattacgcca agcgcgcaat taaccctcac taaagggaac 60
aaaagctgga gctccaccgc ggcagaggtg taaaaagtac tcaaaaattt tactcaagtg 120
aaagtacaag tacttaggga aaattttact caattaaaag taaaagtatc tggctagaat 180
cttacttgag taaaagtaaa aaagtactcc attaaaattg tacttgagta ttagatctgc 240
gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccatg cattagttat taatagtaat 300
caattacggg gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg 360
taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt 420
atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac 480
ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg 540
acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact 600
ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt 660
ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc 720
ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc 780
gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata 840
taagcagagc tggtttagtg aaccgtcaga tccgctagcg ctaccggtcg ccaccatggt 900
gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga 960
cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa 1020
gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt 1080
gaccaccctg acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca 1140
cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa 1200
ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa 1260
ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct 1320
ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat 1380
caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca 1440
ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct 1500
gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct 1560
ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agtgatccag 1620
acatgataag atacattgat gagtttggac aaaccacaac tagaatgcag tgaaaaaaat 1680
gctttatttg tgaaatttgt gatgctattg ctttatttgt aaccattata agctgcaata 1740
aacaagttaa caacaacaat tgcattcatt ttatgtttca ggttcagggg gaggtgtggg 1800
aggttttttc tcgaggcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgccatgcat 1860
tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 1920
cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 1980
gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 2040
atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 2100
aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 2160
catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 2220
catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 2280
atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 2340
ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 2400
acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcagatcc ggtcgacggt 2460
atcgataagc ttgatatcga attcgccgcc accatggtcg ctcattccag cgaagggctg 2520
tccgccacgg ctccggtcac cggcggcgat gtgctggtgg atgcccgtgc atctctggag 2580
gagaaggagg ccccccgcga cgtgaatgca aacactaaac aggccaccac tgaggagccc 2640
cgcatccagt tacccactgt ggatgccttc cgccgcgcaa ttcccgcaca ctgcttcgag 2700
agggacctcg tgaaatcaat caggtatctg gtgcaggact ttgcggcact gacaattctg 2760
tactttgccc ttcccgcctt tgagtacttt ggcctgtttg gttacctggt gtggaacatt 2820
tttatgggcg tttttggctt cgcgctgttc gtcgttggac acgactgtct tcacggctca 2880
ttctccgata atcagaatct caatgatttc attggacata tcgccttcag cccactcttc 2940
tctccctact tcccctggca gaaaagtcac aagctgcacc acgccttcac caaccacatc 3000
gacaaagatc atggacacgt gtggatacag gataaggatt gggaagcaat gcccagctgg 3060
aaaagatggt tcaatcctat tcctttctct ggctggctga aatggttccc tgtgtacact 3120
ctgttcggtt tctgcgatgg atcccacttc tggccttact cctcactgtt tgtgcgcaac 3180
tctgaacgcg ttcagtgtgt aatctctgga atctgctgct gtgtgtgcgc atatattgct 3240
ctaacaattg ctggaagcta ttccaattgg ttctggtact attgggttcc actttctttc 3300
ttcggcttga tgctcgtcat tgttacctat ctgcagcacg tcgacgacgt cgctgaggtg 3360
tacgaggctg atgaatggag cttcgtccgg ggacagaccc agaccatcga tcgttactat 3420
ggcctcggct tggacacaac gatgcaccat atcacagacg gacacgttgc ccaccacttc 3480
ttcaacaaaa tcccacatta ccatctcatc gaagcaaccg aaggtgtcaa aaaggtcttg 3540
gagccgttgt ccgacaccca atacgggtac aaatctcagg tgaactacga tttctttgcc 3600
cggttcctgt ggttcaacta caagctcgac tatctcgttc acaagaccgc cggaatcatg 3660
caattccgaa caactctcga ggagaaggca aaggccaagt gaaagaatat cccgtgccgt 3720
tctagaacta tagtgagtcg tattactcga ccgatcctga gaacttcagg gtgagtttgg 3780
ggacccttga ttgttctttc tttttcgcta ttgtaaaatt catgttatat ggagggggca 3840
aagttttcag ggtgttgttt agaatgggaa gatgtccctt gtatcaccat ggaccctcat 3900
gataattttg tttctttcac tttctactct gttgacaacc attgtctcct cttattttct 3960
tttcattttc tgtaactttt tcgttaaact ttagcttgca tttgtaacga atttttaaat 4020
tcacttttgt ttatttgtca gattgtaagt actttctcta atcacttttt tttcaaggca 4080
atcagggtat attatattgt acttcagcac agttttagag aacaattgtt ataattaaat 4140
gataaggtag aatatttctg catataaatt ctggctggcg tggaaatatt cttattggta 4200
gaaacaacta caccctggtc atcatcctgc ctttctcttt atggttacaa tgatatacac 4260
tgtttgagat gaggataaaa tactctgagt ccaaaccggg cccctctgct aaccatgttc 4320
atgccttctt ctctttccta cagctcctgg gcaacgtgct ggttgttgtg ctgtctcatc 4380
attttggcaa agaattaatt cctcgacgga tcgtagatcc agacatgata agatacattg 4440
atgagtttgg acaaaccaca actagaatgc agtgaaaaaa atgctttatt tgtgaaattt 4500
gtgatgctat tgctttattt gtaaccatta taagctgcaa taaacaagtt aacaacaaca 4560
attgcattca ttttatgttt caggttcagg gggaggtgtg ggaggttttt taattcgcgg 4620
ccgccaccgc ggattaccct gttatcccta agctccagct tttgttccct ttagtgaggg 4680
ttaattgcgc gtcgagccgg gcccaagtga tctccaaaaa ataagtactt tttgactgta 4740
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aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt 5040
aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa 5100
tggaaattgt aagcgttaat attttgttaa aattcgcgtt aaatttttgt taaatcagct 5160
cattttttaa ccaataggcc gaaatcggca aaatccctta taaatcaaaa gaatagaccg 5220
agatagggtt gagtgttgtt ccagtttgga acaagagtcc actattaaag aacgtggact 5280
ccaacgtcaa agggcgaaaa accgtctatc agggcgatgg cccactacgt gaaccatcac 5340
cctaatcaag ttttttgggg tcgaggtgcc gtaaagcact aaatcggaac cctaaaggga 5400
gcccccgatt tagagcttga cggggaaagc cggcgaacgt ggcgagaaag gaagggaaga 5460
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ccacacccgc cgcgcttaat gcgccgctac agggcgcgtc aggtggcact tttcggggaa 5580
atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca 5640
tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc 5700
aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc 5760
acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt 5820
acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt 5880
ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg 5940
ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact 6000
caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg 6060
ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga 6120
aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg 6180
aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa 6240
tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac 6300
aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc 6360
cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca 6420
ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga 6480
gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta 6540
agcattggta actgtcagac caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc 6600
atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc 6660
cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt 6720
cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac 6780
cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct 6840
tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact 6900
tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg 6960
ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata 7020
aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga 7080
cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag 7140
ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg 7200
agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac 7260
ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca 7320
acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg 7380
cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc 7440
gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa 7500
tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt 7560
ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt 7620
aggcacccca ggctttacac tttatgcttc cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg 7680
gataacaatt tcaca 7695
<210> 4
<211> 376
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 4
Met Thr Ile Ala Thr Lys Val Asn Thr Asn Lys Lys Asp Leu Asp Thr
1 5 10 15
Ile Lys Val Pro Glu Leu Pro Ser Val Ala Ala Val Lys Ala Ala Ile
20 25 30
Pro Glu His Cys Phe Val Lys Asp Pro Leu Thr Ser Ile Ser Tyr Leu
35 40 45
Ile Lys Asp Tyr Val Leu Leu Ala Gly Leu Tyr Phe Ala Val Pro Tyr
50 55 60
Ile Glu His Tyr Leu Gly Trp Ile Gly Leu Leu Gly Trp Tyr Trp Ala
65 70 75 80
Met Gly Ile Val Gly Ser Ala Leu Phe Cys Val Gly His Asp Cys Gly
85 90 95
His Gly Ser Phe Ser Asp Tyr Glu Trp Leu Asn Asp Leu Cys Gly His
100 105 110
Leu Ala His Ala Pro Ile Leu Ala Pro Phe Trp Pro Trp Gln Lys Ser
115 120 125
His Arg Gln His His Gln Tyr Thr Ser His Val Glu Lys Asp Lys Gly
130 135 140
His Pro Trp Val Thr Glu Glu Asp Tyr Asn Asn Arg Thr Ala Ile Glu
145 150 155 160
Lys Tyr Phe Ala Val Ile Pro Ile Ser Gly Trp Leu Arg Trp Asn Pro
165 170 175
Ile Tyr Thr Ile Val Gly Leu Pro Asp Gly Ser His Phe Trp Pro Trp
180 185 190
Ser Arg Leu Phe Glu Thr Thr Glu Asp Arg Val Lys Cys Ala Val Ser
195 200 205
Gly Val Ala Cys Ala Ile Cys Ala Tyr Ile Ala Phe Val Leu Cys Asp
210 215 220
Tyr Ser Val Tyr Thr Phe Val Lys Tyr Tyr Tyr Ile Pro Leu Leu Phe
225 230 235 240
Gln Gly Leu Ile Leu Val Ile Ile Thr Tyr Leu Gln His Gln Asn Glu
245 250 255
Asp Ile Glu Val Tyr Glu Ala Asp Glu Trp Gly Phe Val Arg Gly Gln
260 265 270
Thr Gln Thr Ile Asp Arg His Trp Gly Phe Gly Leu Asp Asn Ile Met
275 280 285
His Asn Ile Thr Asn Gly His Val Ala His His Phe Phe Phe Thr Lys
290 295 300
Ile Pro His Tyr His Leu Leu Glu Ala Thr Pro Ala Ile Lys Lys Ala
305 310 315 320
Leu Glu Pro Leu Lys Asp Thr Gln Tyr Gly Tyr Lys Arg Glu Val Asn
325 330 335
Tyr Asn Trp Phe Phe Lys Tyr Leu His Tyr Asn Val Thr Leu Asp Tyr
340 345 350
Leu Thr His Lys Ala Lys Gly Val Leu Gln Tyr Arg Ser Gly Val Glu
355 360 365
Ala Ala Lys Ala Lys Lys Ala Gln
370 375
机译： 提高包含omega-3多不饱和脂肪酸的组合物稳定性的方法
机译： 提高包含omega-3多不饱和脂肪酸的组合物稳定性的方法
机译： 提高omega-3多不饱和脂肪酸掺入家禽肉效率的方法
