一种含饲用复合酶的生长猪专用酶及其制备方法

摘要

本发明公开了一种含饲用复合酶的生长猪专用酶及其制备方法，属于酶制剂制备技术领域。所述生长猪专用酶由黑曲霉培养物、酸性木聚糖酶、植酸酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶、淀粉酶、酸性蛋白酶、中草药提取物、保护剂、激活剂科学复配而成，其中黑曲霉培养物中黑曲霉菌体在生长和发酵过程中能够抑制致病性大肠杆菌的生长；抑制黄曲霉生长和繁殖、分解黄曲霉毒素；促进动物生长、调节胃肠道菌群平衡、提高整体免疫力，并且黑曲霉培养物发酵液粗酶液中含有蛋白酶、甘露聚糖酶、α-半乳糖酶、果胶酶多种酶活力，特别适合生长猪饲料的添加。

说明书

技术领域

本发明属于酶制剂制备技术领域，具体是一种含饲用复合酶的生长猪专用酶及其制备方法。

背景技术

在饲料中添加酶制剂主要由以下4个理由：1.降解在动物饲料中存在的抗营养因子。这些物质不能被动物内源酶降解，从而干扰动物的正常代谢，导致动物消化不良，生产性能下降。2.提高淀粉、蛋白质和矿物质的利用率。这些物质或者被富含纤维的细胞壁包围，或者以某些不能被动物消化的结构形式存在（例如在植物饲料原料中，大量的磷以植酸磷的形式存在。）。3.在原料中降解某些特定的化学键。这些化学键不能被动物自身的酶所降解，加入外源酶以后可以释放更多的营养物。4.由于幼龄动物自身消化系统还不成熟，内源酶不足添加外源酶可以提高饲料消化率，防止出现消化不良症状。除了可以提高日粮的利用率以外，加酶还可以减少饲料原料之间的差异，提高饲料配方的精确性，同时还可以提高动物生长的整齐性，减少管理成本，提高经济效益。使用酶制剂还可以保护环境。由于饲料的利用率提高了，相应的粪便排放量下降了。在效果比较明显的情况下，粪便的排放量可以减少20%左右，猪粪中氮的排放下降15%左右，鸡粪中氮的排放下降20%。对于植酸磷，可以大幅度减少磷对环境的污染。

目前在饲料工业中应用的酶制剂主要有4大类：分别用来降解纤维素、蛋白质、淀粉和植酸。

纤维降解酶：对于单胃动物来说，消化的最大阻力是不能产生降解纤维的酶，在含有小麦、大麦、燕麦等组分的日粮中，很大一部分纤维是阿拉伯木聚糖和β—葡聚糖。水溶性的纤维能提高小肠内容物的粘度，阻碍养分的吸收，从而降低动物的生长性能。同时这种状况还和一些由于消化不良引起的疾病有关。如猪的性欲减退、禽的黑趾症和小猪拉稀。由于品种、生长地点和气候条件等因素的影响，大麦和小麦中纤维含量的变化很大，导致含有这些组分的日粮的营养价值差异很大。纤维降解酶、木聚糖酶和β—葡聚糖可以减少这些差异，提高动物的生长性能和整齐度。同时还可以减少某些消化不良的疾病。

蛋白降解酶：在动物日粮中蛋白质来自各种饲料原料，它们最终通过降解的氨基酸存积在瘦肉中。在单胃动物日粮中，添加蛋白酶（不同饲料原料蛋白质和品质和可利用性）除了能充分降解大部分储蛋白质或储藏蛋白质或为动物可利用的小分子肽外，还能够通过降解抗营养因素而改善饲料营养价值。存积的效率差异很大。在植物蛋白源，如豆饼粉中存在着一些抗营养因子，如几鞣质和胰蛋白酶抑制因子，可能会对小肠吸收表面造成损害，影响营养物的吸收。另外，幼龄动物不完善的消化体系是得植物蛋白（如豆饼粉）中的蛋白质不能得到很好的利用。

淀粉降解酶：许多营养学家认为玉米是饲料原料的“黄金标准”。绝大数营养学家认为玉米不存在消化不良性，消化率超过95%，但是最近Noy和Sklan研究表明（1994年）在理想状态下，4—12日龄的肉鸡日粮中，淀粉的消化率很少超过85%，添加淀粉酶可以使淀粉在小肠得到更多更快的降解。在仔猪断奶期，由于营养、环境和免疫系统的变化，体重会下降。在日粮中添加淀粉酶和其他一些酶，可以增加动物内源消化酶分泌，进而改进营养的消化吸收，提高饲料转化率和动物生长率。

植酸降解酶：对于所有的动物来说，磷对于骨骼的矿化、免疫、繁殖、生长都是至关重要的。猪和家禽单胃动物只能里利用植物饲料中30—40%的磷，其余60—70%的植酸磷事故无法利用的。在许多情况下，饲料日粮中必须补充无机磷来满足动物生长的需要。饲料中一半以上的磷随着粪便排放到环境中，污染环境。添加植酸酶可以降解植酸，释放植酸分子中的磷。这样可以产生2个益处：1.减少了饲料中磷的添加量。2.减少了畜禽粪便对环境的磷污染。

显而易见：作为饲料酶种的四大主角，他们的作用机理和模式在很大程度决定或推动了动物饲料产业对于酶制剂技术的吸收运用。目前在肉鸡料中添加酶的产出投入比例超过2:1。相对而言，在养猪业领域，酶制剂的使用情况就比较复杂，显得不明朗。集约化程度低，涉及环节比较多，酶制剂的使用效果很难进行商业计算。尽管在20世纪50年代已经有了使用酶制剂的设想，但是直到20世纪80年代才开始懂得如何在饲料工业中发挥酶的力量。饲料谷物，如小麦和大麦都含有比较高的单胃动物不能利用的纤维。如果纤维能够被降解，动物就能更好地利用营养物。在欧洲，大麦比较便宜，禽类营养学家和酶学家投入了大量精力研究了在含有大麦的肉鸡日粮中添加β—葡聚糖酶以减少其负面影响的可能性。其结果被证明是成功的，并得到了一个黄金定律：大麦+β—葡聚糖酶=小麦。受到上述成功的鼓舞，小麦是第二个的研究对象。理论假设是：小麦+木聚糖酶=玉米。这一步的研究也获得了成功。在20世纪90年代中期，酶在饲料工业得到了普遍认可。可以毫不夸张地说：1996年，在欧洲80%的肉鸡料（粘性谷物为能量来源）中含有纤维降解酶。由此强化和加快饲料产业对新技术的应用。从全球范围来看，大约65%的含有能产生粘性谷物的家禽饲料添加了纤维降解酶。而在猪饲料中的应用比例要低得多，接近10%。其主要原因是市场的结构比较复杂，市场呈多元化，甚至无法测算。从地理分布来看，使用纤维素降解酶的地区主要集中在粘性谷物作为主要能量饲料的产区，例如：欧洲、加拿大、澳大利亚和新西兰。另外，在美国、南美和亚太地区，使用情况取决于玉米和小麦之间的比价。从这个意义上讲，欧洲是使用降解纤维素酶的核心细分市场。为了获得全球的认可，饲用酶厂家必须大举进军以玉米——豆粕型日粮为主的北美和亚太地区。玉米——豆粕型日粮历来被看作是“黄金标准”，尽管许多营养学家认为这些原料的变动性要比原来设想的变动性要大得多。现在，越来越多的证据表明这种黄金日粮也可以通过酶而改善其生产性能，尽管这类日粮与粗纤维或粘度相关的问题不严重。过去10年在研发玉米-豆粕第一代饲料酶上耗费很多，并于1996年开始成功应用，初期应用结果五花八门，但业界正开始变得越来越明白如何才能得心应手，加酶技术获得最大经济回报。据估算，该部分饲料酶市场份额为2千万美元，实际在使用玉米-豆粕日粮的肉鸡饲料只有5%为加酶饲料。1999/2000年一降低粘度和粗纤维为日粮的饲料酶市场价值超过1亿美元。目前，植酸酶已经得到了全球的承认和应用。植酸酶的市场份额大约是每年5000万美元，在全球约有8.0%左右的猪禽饲料添加植酸酶。除了经济利益的原因外，还有一个因素是减少了粪中植酸磷的含量有利于保护环境。

综上所述，生长猪专用酶的应用有着其广阔的市场空间和巨大的经济价值，但生长猪专用酶的热稳定性、安全性、复配全面性及作用效果的充分发挥仍是酶制剂生产厂家和广大养殖户共同关注的一个重要问题，制备更安全，更全面，酶作用效果更好的生长猪专用酶是本行业技术人员的共同责任和追求。

发明内容

本发明所解决的技术问题是以含强热稳定性和pH稳定性的饲用复合酶的黑曲霉培养物为基础，并科学复配中草药提取物、保护剂、激活剂和其它食品级饲料酶，制得的饲料复合酶不但为饲养畜禽提供了安全、全面的消化酶，减轻消化负担，提高原料利用率和生长率，有效保护环境，同时适量的激活剂可在同等条件下充分发挥酶制剂的效力，物尽其用，节约酶制剂添加量，中草药提取物的科学复配既可延长复合酶制剂的保质期，又可提高饲养畜禽的免疫力，从而达到一酶多用的效果。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种含饲用复合酶的生长猪专用酶，由以下重量份数的原料组成：

黑曲霉培养物30-50份，酸性木聚糖酶30-50份，植酸酶20-30份，β-葡聚糖酶15-20份，纤维素酶15-20份，淀粉酶10-15份，酸性蛋白酶10-15份，中草药提取物10-15份，保护剂10-15份，激活剂10-15份。

所述酸性木聚糖酶、植酸酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶、淀粉酶、酸性蛋白酶均为食品级酶制剂；

所述黑曲霉培养物中主要包括饲用酶和黑曲霉菌体。

所述黑曲霉培养物发酵液粗酶液中含有多种饲用酶，其中，蛋白酶活力6500-6700U/ml、甘露聚糖酶活力1500-1700U/ml、α-半乳糖酶活力1200-1300U/ml、果胶酶活力1000-1200U/ml。对发酵液粗酶液进行酶的热稳定性试验和pH稳定性试验，试验结果表明：在30-75℃，pH值2-7时各酶均有较高的酶活力，达到80%以上。

所述黑曲霉菌体在生长和发酵过程中能够抑制致病性大肠杆菌的生长；抑制黄曲霉生长和繁殖、分解黄曲霉毒素；促进动物生长、调节胃肠道菌群平衡、提高整体免疫力。

所述黑曲霉培养物的制备方法如下：将保存完好的黑曲霉DM-18的斜面菌种经菌种活化和一级、二级、三级及种子罐液体种子逐级扩大培养得到液体种子，以6%接种量接入发酵罐，培养温度28-30℃，搅拌速度200-700r/m，通风量（V/V）1:1-3,培养时间10-15h；然后以1-2℃/h降温速率缓慢降温至10-15℃，恒温培养15-20h；继续以1-2℃/h降温速率缓慢降温至2-5℃，此时，将液体种子以4%接种量追加接入发酵罐，恒温培养20-30h；最后以1-2℃/h升温速率缓慢升温至10-15℃，恒温培养15-20h；继续以1-2℃/h升温速率缓慢升温至30-33℃，恒温培养15-20h；发酵液经离心分离得到黑曲霉湿菌体和离心液，离心液于10-20℃循环超滤浓缩去除水分得固形物含量20-40%浓缩液，浓缩液与黑曲霉湿菌体以质量比1-10:1均匀混合，然后经真空冷冻干燥、超微粉碎得黑曲霉培养物。

所述斜面培养基组成为：干酪素4g，磷酸氢二钾2g，氯化镁0.6g，氯化钾0.8g，硫酸亚铁0.02g，葡萄糖20g，琼脂20g，中草药粉剂5-20g,蒸馏水l000mL，pH值5.8，121℃灭菌20min。

所述中草药粉剂的制备方法如下：

称取黄芪20-30份；党参10-18份；柴胡10-15份；黄芩10-15份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加3-6倍重量的水，控制温度70℃～90℃保持2～4h，添加混合物料2-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制温度至60℃～78℃保持3～4h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂。

所述乙醇和丙醇的质量比例为1：1-1.5。

所述一级、二级、三级种子培养基组成为：磷酸氢二钾2g，氯化镁0.6g，氯化钾0.8g，硫酸亚铁0.02g，葡萄糖20g，中草药粉剂15-25g,海藻糖10-30g,蒸馏水l000mL，pH值5.5，121℃灭菌20min。

所述种子罐培养基组成为：玉米粉50-60g，豆粉15-25g，麸皮10-15g，鱼粉10-15g，氯化钙6-10g，氯化铵1-3g，磷酸氢二钠1-2g，中草药粉剂15-20g，海藻糖10-30g，纯净水l000mL，pH值5-7，121℃灭菌20min。

所述种子罐发酵液孢子浓度为7.0x10⁸-8.0x10⁸个/ml；

所述发酵培养基组成为：玉米粉50-60g，豆粉15-25g，麸皮10-15g，鱼粉10-15g，氯化钙6-10g，氯化铵1-3g，磷酸氢二钠1-2g，中草药粉剂30-50g，海藻糖10-30g，纯净水l000mL，pH值5-7，121℃灭菌20min。

所述补料培养基重量组成为：麦芽糊精20-30%，玉米粉10-20%，豆粉15-25%，鱼粉1.0-1.5%，氯化钙0.6-1.0%，氯化铵0.1-0.3%，磷酸氢二钠0.1-0.2%，中草药粉剂5-10%，不足部分纯净水补足，pH值5-7，121-123℃灭菌30-40min。

所述中草药提取物的制备方法为：分别将中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加3-6倍重量的水，控制温度70℃～90℃保持2～4h，然后降温至45-60℃，加入混合酶制剂进行酶解，用乳酸调节pH值为5.5-6.8，酶解2-4h，最后添加混合物料0.5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制温度至60℃～78℃保持3～4h，过滤；滤液减压浓缩至固形物含量为20%以上，然后冷冻干燥获得中草药提取物。

所述中草药的重量份数组成为：沙棘20-30份，决明子20-30份，枸杞10-15份，山药10-15份，北沙参5-10份，黄荆子5-10份，玉竹3-5份，薏米3-5份，大麦芽3-5份，桂花3-5份，黄芪3-5份；

混合酶添加量为混合物料总重量的5-10%；

所述混合酶的重量份数组成为：内β-葡聚糖酶10-20份，外β-葡聚糖酶10-20份，β-葡萄糖苷酶10-15份，木聚糖酶15-20份，戊聚糖酶15-20份，普鲁兰酶20-30份，β-淀粉酶10-15份，中性蛋白酶10-15份，酸性蛋白酶10-15份，超氧化物歧化酶5-10份，葡萄糖氧化酶5-10份，酸性磷酸酶5-10份；

所述保护剂由以下重量份数的原料组成:海藻糖20-30份，NaCl20-30份，(NH₄)₂SO₄10-15份，半胱氨酸10-15份。

所述激活剂是由如下质量份数的无机盐均匀混合而成：氯化锌30-40份，氯化钙10-20份，硫酸钠10-20份，氯化镁5-10份。

本发明生长猪专用酶的制备方法：

将所述保护剂、中草药提取物分别超微粉碎，确保粒度小于所述酸性木聚糖酶及其它原料，然后与黑曲霉培养物、酸性木聚糖酶、植酸酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶、淀粉酶、酸性蛋白酶均匀混合，最后加入激活剂，混合均匀后密封包装即得成品生长猪专用酶。

所述生长猪专用酶适用于饲料加工厂和养殖场自配饲料，使用时应与饲料中的其它原料混合均匀，可事先将本发明与少量饲料混合均匀，再混合到大批饲料中，直接饲喂。建议每吨全价料添加量为：100-150g。

本发明的高产饲用复合酶的黑曲霉菌株具体为黑曲霉（Aspergillus niger）DM-18，是从湖南省津市市洋由乡腐质土、稻草混合样分离得到的野生菌HYX0022经经紫外诱变、紫外亚硝酸诱变、紫外线亚硝基胍复合诱变，然后对突变株逐级筛选淘汰，最后对优良菌株经发酵性能测试筛选得到产饲用复合酶的黑曲霉DM-18。该菌株已于2013年11月3日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学生命科学学院邮编：430072），保藏号为CCTCC NO：M2013541，分类命名为黑曲霉（Aspergillus niger）DM-18。

本发明提供的高产饲用复合酶的黑曲霉DM-18具有以下微生物学特征：

1、形态学特征：

黑曲霉DM-18，生物学形态为包括分生孢子、胞梗、顶囊、产胞结构等几部分。分生孢子头球形至辐射形，直径150-450μm，分生孢子梗发生于基质。胞梗茎1000-3000(长度)×12-20(直径)μm，黄色或黄褐色，壁平滑；顶囊球形或近似球形，直径35-50μm，表面全面可育；产胞结构双层，梗基15-20(长度)×3-4.0(直径)μm，瓶梗6-8(长度)×2-4(直径)μm，分生孢子球形或近球形，较小，直径3.5-5.0μm，褐色，壁粗糙。

2、培养学特征：

黑曲霉DM-18在麦芽汁琼脂培养基上生长迅速，28℃4天直径65mm；质地丝绒状或稍带絮状；分生孢子结构大量，褐黑色，有少量渗出液；菌落反面略带黄色。

3、生理生化特征：

黑曲霉DM-18可在马铃薯、玉米粉、可溶性淀粉，糖蜜等上生长，最适PH值4.6，最适生长温度28-34℃，最适产酶温度28-30℃。

黑曲霉DM-18的筛选技术路线为：原始菌株分离、筛选与鉴定→出发菌株→斜面培养→孢子悬液的制备→诱变处理→平板分离→初筛→复筛→再复筛→扩大实验(发酵性能测定)。

有益效果：

1.本发明黑曲霉培养物中黑曲霉菌体在生长和发酵过程中能够抑制致病性大肠杆菌的生长；抑制黄曲霉生长和繁殖、分解黄曲霉毒素；促进动物生长、调节胃肠道菌群平衡、提高整体免疫力，特别适合生长猪饲料的添加。

2.本发明中的黑曲霉培养物以高产饲用复合酶的菌株黑曲霉DM-18为出发菌株，并进行培养基优化和发酵工艺改进，采用梯度降温和梯度升温的发酵工艺，同时予以追加接种和适时补料，尤其是梯度降温和梯度升温的发酵工艺显著提高了出发菌株的抗应激能力，致使菌种的产酶能力最大限度地显现。并且本发明对培养基组成实施全程优化，添加了具有抗热应激原作用的黄芩、柴胡，添加了具有调整和修复机体功能、增强机体的免疫功能、具有微生态调节功能的黄芪、党参等，进一步增强了微生物在同一发酵环境下的机体功能性、传代适应性和共同协作性，进而增强了微生物的代谢功能，使得本发明所产饲用复配酶活力高、耐受温度较高、稳定性强、适于工业化生产。

3.本发明黑曲霉培养物发酵液粗酶液中含有多种酶活力，其中，蛋白酶活力6500-6700U/ml、甘露聚糖酶活力1500-1700U/ml、α-半乳糖酶活力1200-1300U/ml、果胶酶活力1000-1200U/ml。对发酵液粗酶液进行酶的热稳定性试验和pH稳定性试验，试验结果表明：在30-75℃，pH值2-7时各酶均有较高的酶活力，达到80%以上。本发明饲用复合酶热稳定性和pH稳定性强，更加适合饲料工业加工工艺需求，加工后的饲料酶活损失低。

4.本发明生长猪专用酶中的保护剂采用多糖、无机盐和氨基酸科学复配，有效减缓了复配原料的回潮；同时可增强复配酶的耐冻、耐热性能，保持相同的酶活力，其耐热温度可提高20-30℃，耐冷冻温度可降低10-15℃，有效防止了复配酶在运输、保存和使用过程中酶活力的损失，延长了复配酶的保质期，达到同样的酶活力，同类产品保质期可延长2-3年。

5.本发明生长猪专用酶添加无机盐作为激活剂，创造了酶催化作用的最佳条件，充分发挥了复配酶各酶组份的活力，彻底有效的分解了饲料中淀粉、蛋白质、纤维素、植酸等大分子物质，大大减轻了畜禽动物的消化负担，提高了原料利用率和畜禽的生长率，同时有效防止了畜禽粪便造成的环境污染，保护了饲养环境。

6.本发明生长猪专用酶添加的中草药提取物既可延长复配原料的保质期，又可提高饲养畜禽的免疫力，有效防止畜禽流行性疾病的发生。

7.本发明生长猪专用酶中保护剂与酶制剂、激活剂与酶制剂、中草药提取物与酶制剂的共同协同作用，使得复配酶的酶活力和效力最大限度的发挥，并相应的提高了饲料的利用率和动物的生长率，增强了动物的食欲和抗病能力，延长了复配酶的保质期和保护了环境。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

实施例1

一种含饲用复合酶的生长猪专用酶，由以下重量份数的原料组成：

黑曲霉培养物40份，酸性木聚糖酶40份，植酸酶25份，β-葡聚糖酶17份，纤维素酶17份，淀粉酶12份，酸性蛋白酶12份，中草药提取物12份，保护剂13份，激活剂12份。

所述酸性木聚糖酶、植酸酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶、淀粉酶、酸性蛋白酶均为食品级酶制剂；

所述黑曲霉培养物制备方法包括如下步骤：

（1）菌种活化

将保存完好的黑曲霉DM-18的斜面菌种接种于斜面培养基，28℃培养36h进行菌种活化，如此活化2次；

所述斜面培养基组成为：干酪素4g，磷酸氢二钾2g，氯化镁0.6g，氯化钾0.8g，硫酸亚铁0.02g，葡萄糖20g，琼脂20g，中草药粉剂5g,蒸馏水l000mL，pH值5.8，121℃灭菌20min；

所述中草药粉剂的制备方法如下：

称取黄芪20份；党参10份；柴胡10份；黄芩10份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加3倍重量的水，控制温度70℃保持2h，添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制温度至60℃保持3h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂。

所述乙醇和丙醇的质量比例为1：1。

（2）液体种子扩大培养

①一级种子培养：将步骤（1）活化后的宇佐美曲霉斜面菌种以无菌水洗下孢子，接入500毫升摇瓶中，液体种子培养基装量100毫升，28℃、80rpm摇床培养36h；

②二级种子培养：将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；

③三级种子培养：将二级种子以8%接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，液体培养基装量1000毫升，28℃、80rpm摇床培养36h；

④种子罐培养：将三级种子以8%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，种子罐培养基装量100L，控制pH值为5，培养温度28℃，搅拌速度200rpm，通风量（V/V）1:0.8,培养时间36h，溶解氧10%；

所述一级、二级、三级种子培养基组成为：磷酸氢二钾2g，氯化镁0.6g，氯化钾0.8g，硫酸亚铁0.02g，葡萄糖20g，中草药粉剂15g,海藻糖10g,蒸馏水l000mL，pH值5.5，121℃灭菌20min。

所述种子罐培养基组成为：玉米粉50-60g，豆粉15-25g，麸皮10-15g，鱼粉10g，氯化钙6g，氯化铵1g，磷酸氢二钠1g，中草药粉剂15g，海藻糖10g，纯净水l000mL，pH值5，121℃灭菌20min。

所述种子罐发酵液孢子浓度为7.0x10⁸个/ml；

（3）发酵罐发酵

将步骤（2）中种子罐液体种子以6%接种量接入发酵罐，培养温度28℃，搅拌速度200r/m，通风量（V/V）1:1,培养时间10h；然后以1℃/h降温速率缓慢降温至10℃，恒温培养15h；继续以1℃/h降温速率缓慢降温至2℃，此时，将步骤（2）中种子罐液体种子以4%接种量追加接入发酵罐，恒温培养20h；最后以1℃/h升温速率缓慢升温至10℃，恒温培养15h；继续以1℃/h升温速率缓慢升温至30℃，恒温培养15h；

溶解氧控制：通过调整搅拌转速及通风量，控制溶解氧15%；

pH控制：通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH值保持在5；

补料控制：当发酵液中的还原糖含量降至3mg/ml-8mg/ml时，开始添加补料培养基，补料量以维持发酵液还原糖含量为2mg/ml-5mg/ml；

放罐标准：60%菌体衰老自溶，酶活力增长缓慢。

所述发酵培养基组成为：玉米粉50g，豆粉15g，麸皮10g，鱼粉10g，氯化钙6g，氯化铵1g，磷酸氢二钠1g，中草药粉剂30g，海藻糖10g，纯净水l000mL，pH值5，121℃灭菌20min。

所述补料培养基重量组成为：麦芽糊精20%，玉米粉10%，豆粉15%，鱼粉1.0%，氯化钙0.6%，氯化铵0.1%，磷酸氢二钠0.1%，中草药粉剂5%，不足部分纯净水补足，pH值5，121℃灭菌30min。

（4）发酵液经离心分离得到黑曲霉湿菌体和离心液，离心液于15℃循环超滤浓缩去除水分得固形物含量30%浓缩液，浓缩液与黑曲霉湿菌体以质量比5:1均匀混合，然后经真空冷冻干燥、超微粉碎得黑曲霉培养物。

上述制备方法中发酵液粗酶液中含有多种酶活力，其中，蛋白酶活力6500U/ml、甘露聚糖酶活力1500U/ml、α-半乳糖酶活力1200U/ml、果胶酶活力1000U/ml。

所述中草药提取物的制备方法为：分别将中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加5倍重量的水，控制温度80℃保持3h，然后降温至53℃，加入混合酶制剂进行酶解，用乳酸调节pH值为6.2，酶解3h，最后添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制温度至69℃保持4h，过滤；滤液减压浓缩至固形物含量为20%以上，然后冷冻干燥获得中草药提取物。

所述中草药的重量份数组成为：沙棘25份，决明子25份，枸杞17份，山药13份，北沙参8份，黄荆子7份，玉竹4份，薏米4份，大麦芽4份，桂花4份，黄芪4份；

混合酶添加量为混合物料总重量的5-10%；

所述混合酶的重量份数组成为：内β-葡聚糖酶15份，外β-葡聚糖酶15份，β-葡萄糖苷酶13份，木聚糖酶13份，戊聚糖酶13份，普鲁兰酶25份，β-淀粉酶12份，中性蛋白酶13份，酸性蛋白酶13份，超氧化物歧化酶7份，葡萄糖氧化酶7份，酸性磷酸酶7份；

所述保护剂由以下重量份数的原料组成:海藻糖25份，NaCl25份，(NH₄)₂SO₄13份，半胱氨酸12份。

所述激活剂是由如下质量份数的无机盐均匀混合而成：氯化锌35份，氯化钙15份，硫酸钠15份，氯化镁7份。

本发明生长猪专用酶的制备方法：

将所述保护剂、中草药提取物分别超微粉碎，确保粒度小于所述酸性木聚糖酶及其它原料，然后与黑曲霉培养物、酸性木聚糖酶、植酸酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶、淀粉酶、酸性蛋白酶均匀混合，最后加入激活剂，混合均匀后密封包装即得成品生长猪专用酶。

实施例2

一种含饲用复合酶的生长猪专用酶，由以下重量份数的原料组成：

饲用复合酶30份，酸性木聚糖酶30份，植酸酶20份，β-葡聚糖酶15份，纤维素酶15份，淀粉酶10份，酸性蛋白酶10份，中草药提取物10份，保护剂10份，激活剂10份。

所述酸性木聚糖酶、植酸酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶、淀粉酶、酸性蛋白酶均为食品级酶制剂；

所述黑曲霉培养物制备方法包括如下步骤：

（1）菌种活化

将保存完好的黑曲霉DM-18的斜面菌种接种于斜面培养基，34℃培养48h进行菌种活化，如此活化4次；

所述斜面培养基组成为：干酪素4g，磷酸氢二钾2g，氯化镁0.6g，氯化钾0.8g，硫酸亚铁0.02g，葡萄糖20g，琼脂20g，中草药粉剂20g,蒸馏水l000mL，pH值5.8，121℃灭菌20min。

所述中草药粉剂的制备方法如下：

称取黄芪30份；党参18份；柴胡15份；黄芩15份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加6倍重量的水，控制温度90℃保持4h，添加混合物料3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制温度至78℃保持4h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂。

所述乙醇和丙醇的质量比例为1：1.5。

（2）液体种子扩大培养

①一级种子培养：将步骤（1）活化后的斜面菌种以无菌水洗下孢子，接入500毫升摇瓶中，液体种子培养基装量100毫升，34℃、120rpm摇床培养48h；

②二级种子培养：将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；

③三级种子培养：将二级种子以8%接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，液体培养基装量1000毫升，34℃、120rpm摇床培养48h；

④种子罐培养：将三级种子以8%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，种子罐培养基装量100L，控制pH值为5-7，培养温度30℃，搅拌速度400rpm，通风量（V/V）1:1.2,培养时间48h，溶解氧20%；

所述一级、二级、三级种子培养基组成为：磷酸氢二钾2g，氯化镁0.6g，氯化钾0.8g，硫酸亚铁0.02g，葡萄糖20g，中草药粉剂25g,海藻糖30g,蒸馏水l000mL，pH值5.5，121℃灭菌20min。

所述种子罐培养基组成为：玉米粉60g，豆粉25g，麸皮15g，鱼粉15g，氯化钙10g，氯化铵3g，磷酸氢二钠2g，中草药粉剂20g，海藻糖30g，纯净水l000mL，pH值7，121℃灭菌20min。

所述种子罐发酵液孢子浓度为8.0x10⁸个/ml；

（3）发酵罐发酵

将步骤（2）中种子罐液体种子以6%接种量接入发酵罐，培养温度30℃，搅拌速度700r/m，通风量（V/V）1:3,培养时间15h；然后以2℃/h降温速率缓慢降温至15℃，恒温培养20h；继续以2℃/h降温速率缓慢降温至5℃，此时，将步骤（2）中种子罐液体种子以4%接种量追加接入发酵罐，恒温培养30h；最后以2℃/h升温速率缓慢升温至15℃，恒温培养20h；继续以2℃/h升温速率缓慢升温至34℃，恒温培养20h；

溶解氧控制：通过调整搅拌转速及通风量，控制溶解氧30%；

pH控制：通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH值保持在6；

补料控制：当发酵液中的还原糖含量降至3mg/ml-8mg/ml时，开始添加补料培养基，补料量以维持发酵液还原糖含量为2mg/ml-5mg/ml；

放罐标准：80%菌体衰老自溶，酶活力增长缓慢。

所述发酵培养基组成为：玉米粉60g，豆粉25g，麸皮15g，鱼粉15g，氯化钙10g，氯化铵3g，磷酸氢二钠2g，中草药粉剂50g，海藻糖30g，纯净水l000mL，pH值7，121℃灭菌20min。

所述补料培养基重量组成为：麦芽糊精30%，玉米粉20%，豆粉25%，鱼粉1.5%，氯化钙1.0%，氯化铵0.3%，磷酸氢二钠0.2%，中草药粉10%，不足部分纯净水补足，pH值7，123℃灭菌40min。

（4）发酵液经离心分离得到黑曲霉湿菌体和离心液，离心液于10℃循环超滤浓缩去除水分得固形物含量20%浓缩液，浓缩液与黑曲霉湿菌体以质量比1:1均匀混合，然后经真空冷冻干燥、超微粉碎得黑曲霉培养物。

上述制备方法中发酵液粗酶液中含有多种酶活力，其中，蛋白酶活力6600U/ml、甘露聚糖酶活力1600U/ml、α-半乳糖酶活力1240U/ml、果胶酶活力1080U/ml。

所述中草药提取物的制备方法为：分别将中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加3倍重量的水，控制温度70℃保持2h，然后降温至45℃，加入混合酶制剂进行酶解，用乳酸调节pH值为5.5，酶解2h，最后添加混合物料0.5倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制温度至60℃保持3h，过滤；滤液减压浓缩至固形物含量为20%以上，然后冷冻干燥获得中草药提取物。

所述中草药的重量份数组成为：沙棘20份，决明子20份，枸杞10份，山药10份，北沙参5份，黄荆子5份，玉竹3份，薏米3份，大麦芽3份，桂花3份，黄芪3份；

混合酶添加量为混合物料总重量的5%；

所述混合酶的重量份数组成为：内β-葡聚糖酶10份，外β-葡聚糖酶10份，β-葡萄糖苷酶10份，木聚糖酶15份，戊聚糖酶15份，普鲁兰酶20份，β-淀粉酶10份，中性蛋白酶10份，酸性蛋白酶10份，超氧化物歧化酶5份，葡萄糖氧化酶5份，酸性磷酸酶5份；

所述保护剂由以下重量份数的原料组成:海藻糖20份，NaCl20份，(NH₄)₂SO₄10份，半胱氨酸10份。

所述激活剂是由如下质量份数的无机盐均匀混合而成：氯化锌30份，氯化钙10份，硫酸钠10份，氯化镁5份。

本发明生长猪专用酶的制备方法如实施例1。

实施例3

一种含饲用复合酶的生长猪专用酶，由以下重量份数的原料组成：

饲用复合酶50份，酸性木聚糖酶50份，植酸酶30份，β-葡聚糖酶20份，纤维素酶20份，淀粉酶15份，酸性蛋白酶15份，中草药提取物15份，保护剂15份，激活剂15份。

所述酸性木聚糖酶、植酸酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶、淀粉酶、酸性蛋白酶均为食品级酶制剂；

所述黑曲霉培养物制备方法包括如下步骤：

（1）菌种活化

将保存完好的黑曲霉DM-18的斜面菌种接种于斜面培养基，30℃培养42h进行菌种活化，如此活化3次；

所述斜面培养基组成为：干酪素4g，磷酸氢二钾2g，氯化镁0.6g，氯化钾0.8g，硫酸亚铁0.02g，葡萄糖20g，琼脂20g，中草药粉剂12g,蒸馏水l000mL，pH值5.8，121℃灭菌20min。

所述中草药粉剂的制备方法如下：

称取黄芪25份；党参15份；柴胡12份；黄芩12份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加5倍重量的水，控制温度80℃保持3h，添加混合物料3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制温度至70℃保持4h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂。

所述乙醇和丙醇的质量比例为1：1.2。

（2）液体种子扩大培养

①一级种子培养：将步骤（1）活化后的斜面菌种以无菌水洗下孢子，接入500毫升摇瓶中，液体种子培养基装量100毫升，30℃、100rpm摇床培养42h；

②二级种子培养：将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；

③三级种子培养：将二级种子以8%接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，液体培养基装量1000毫升，30℃、100rpm摇床培养42h；

④种子罐培养：将三级种子以8%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，种子罐培养基装量100L，控制pH值为6，培养温度30℃，搅拌速度300rpm，通风量（V/V）1:1,培养时间42h，溶解氧20%；

所述一级、二级、三级种子培养基组成为：磷酸氢二钾2g，氯化镁0.6g，氯化钾0.8g，硫酸亚铁0.02g，葡萄糖20g，中草药粉剂20g,海藻糖20g,蒸馏水l000mL，pH值5.5，121℃灭菌20min。

所述种子罐培养基组成为：玉米粉55g，豆粉20g，麸皮12g，鱼粉12g，氯化钙8g，氯化铵2g，磷酸氢二钠2g，中草药粉剂18g，海藻糖20g，纯净水l000mL，pH值6，121℃灭菌20min。

所述种子罐发酵液孢子浓度为7.5x10⁸个/ml；

（3）发酵罐发酵

将步骤（2）中种子罐液体种子以6%接种量接入发酵罐，培养温度30℃，搅拌速度350r/m，通风量（V/V）1:2,培养时间12h；然后以2℃/h降温速率缓慢降温至12℃，恒温培养18h；继续以2℃/h降温速率缓慢降温至4℃，此时，将步骤（2）中种子罐液体种子以4%接种量追加接入发酵罐，恒温培养25h；最后以2℃/h升温速率缓慢升温至12℃，恒温培养18h；继续以2℃/h升温速率缓慢升温至30℃，恒温培养18h；

溶解氧控制：通过调整搅拌转速及通风量，控制溶解氧20%；

pH控制：通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH值保持在5.2；

补料控制：当发酵液中的还原糖含量降至3mg/ml-8mg/ml时，开始添加补料培养基，补料量以维持发酵液还原糖含量为2mg/ml-5mg/ml；

放罐标准：70%菌体衰老自溶，酶活力增长缓慢。

所述发酵培养基组成为：玉米粉55g，豆粉20g，麸皮12g，鱼粉12g，氯化钙8g，氯化铵2g，磷酸氢二钠2g，中草药粉剂40g，海藻糖20g，纯净水l000mL，pH值6，121℃灭菌20min。

所述补料培养基重量组成为：麦芽糊精25%，玉米粉15%，豆粉18%，鱼粉1.2%，氯化钙0.8%，氯化铵0.2%，磷酸氢二钠0.2%，中草药粉剂8%，不足部分纯净水补足，pH值6，123℃灭菌40min。

（4）发酵液经离心分离得到黑曲霉湿菌体和离心液，离心液于20℃循环超滤浓缩去除水分得固形物含量40%浓缩液，浓缩液与黑曲霉湿菌体以质量比10:1均匀混合，然后经真空冷冻干燥、超微粉碎得黑曲霉培养物。

上述制备方法中发酵液粗酶液中含有多种酶活力，其中，蛋白酶活力6700U/ml、甘露聚糖酶活力1700U/ml、α-半乳糖酶活力1300U/ml、果胶酶活力1200U/ml。

所述中草药提取物的制备方法为：分别将中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加6倍重量的水，控制温度90℃保持4h，然后降温至60℃，加入混合酶制剂进行酶解，用乳酸调节pH值为6.8，酶解4h，最后添加混合物料3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制温度至78℃保持4h，过滤；滤液减压浓缩至固形物含量为20%以上，然后冷冻干燥获得中草药提取物。

所述中草药的重量份数组成为：沙棘30份，决明子30份，枸杞15份，山药15份，北沙参10份，黄荆子10份，玉竹5份，薏米5份，大麦芽5份，桂花5份，黄芪5份；

混合酶添加量为混合物料总重量的10%；

所述混合酶的重量份数组成为：内β-葡聚糖酶20份，外β-葡聚糖酶20份，β-葡萄糖苷酶15份，木聚糖酶20份，戊聚糖酶20份，普鲁兰酶30份，β-淀粉酶15份，中性蛋白酶15份，酸性蛋白酶15份，超氧化物歧化酶10份，葡萄糖氧化酶10份，酸性磷酸酶10份；

所述保护剂由以下重量份数的原料组成:海藻糖30份，NaCl30份，(NH₄)₂SO₄15份，半胱氨酸15份。

所述激活剂是由如下质量份数的无机盐均匀混合而成：氯化锌40份，氯化钙20份，硫酸钠20份，氯化镁10份。

本发明生长猪专用酶的制备方法如实施例1。

实施例4饲用复合酶的热稳定性分析

对饲用复合酶的热稳定性进行了分析，将实施例3发酵液粗酶液分别置于30℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃下，每隔10分钟取样测定饲用复合酶中各组成酶的酶活。30℃、40℃、45℃、50℃下，60分钟各组成酶酶活没有下降。55℃、60℃与65℃下，30分钟各组成酶酶活降到原有酶活的95％，60分钟各组成酶酶活降到85％。70℃下，30分钟各组成酶酶活降到原有酶活的90％，60分钟各组成酶酶活降到85％。75℃下，30分钟各组成酶酶活降到原有酶活的85％，60分钟各组成酶酶活降到原有酶活的80％，与现有技术相比，同样条件下达到同样酶活耐受温度平均提高了5-10℃。

实施例5饲用复合酶的pH稳定性分析

对饲用复合酶酶的pH稳定性进行了分析，将实施例3发酵液粗酶液分别置于pH值2.0、2.5、3.5、4.5、5.5、6.0、6.5、7.0下，每隔10分钟取样测定饲用复合酶中各组成酶的酶活。粗酶液pH值5.5、6.0、6.5、7.0下，60分钟各组成酶酶活没有下降。pH值4.5、3.5下，30分钟各组成酶酶活降到原有酶活的95％，60分钟各组成酶酶活降到原有酶活的85％。pH值2.5下，30分钟各组成酶酶活降到原有酶活的90％，60分钟降到原有酶活的85％。pH值2.0下，30分钟各组成酶酶活降到原有酶活的85％，60分钟降到原有酶活的80％，与现有技术相比，同样条件下达到同样酶活耐pH值较宽泛。

实施例6本发明实施例1生长猪专用酶的使用效果试验

1.饲料种类：全价国标生长猪饲料；

2.生长猪专用酶添加量：每吨饲料添加100g；

3.生长猪专用酶试验组设计：生长猪专用酶重量份数组成分为试验组、对照组1、对照组2；其中试验组为本发明实施例1制备的生长猪专用酶；对照组1为试验组组份中除了枯草芽孢杆菌培养物的其余组份；对照组2是市售的生长猪专用酶并且其包含的各酶种类、酶活力和酶重量份数与试验组和对照组1相同；各试验组的具体重量份数组成如表1

表1

项目试验组对照组1对照组2备注黑曲霉培养物（份）4000酸性木聚糖酶（份）404040植酸酶（份）252525纤维素酶（份）171717β-葡聚糖酶（份）171717淀粉酶（份）121212酸性蛋白酶（份）121212中草药提取物（份）12120保护剂（份）13130激活剂（份）12120

4.饲喂试验

4.1材料与方法

4.1.1试验猪的选择及分组

在湖南某一大型正规养猪场，选取36头体重为（30±2）kg的健康杜长大三元杂交生长猪，随机分成3组，每组2栏重复，每重复6头，阉公猪和小母猪各半。正式试验前进行为期1周的预试，并完成驱虫和常规免疫工作。试验分前后两期进行，前期（30kg-60kg），后期（61kg～90kg）。

4.1.2饲养管理

饲喂干粉料，自由采食，以吃饱不剩为限，自动饮水器饮水。前期日喂三次，后期日喂二次，以栏为单位记录耗料量。猪舍为砖瓦结构、水泥地面、单列式，试猪分别饲养于9栏内，各栏舍的环境条件一致，每日上下午清扫圈舍各一次，同时观察猪的行为、食欲、粪便。试验期间记录疾病及治疗情况。

4.1.3饲料及配方

以全价国标生长猪饲料为基础，每吨饲料添加试验组、对照组1和对照组2的生长猪专用酶100g；生长猪专用酶的原料组成具体见表1。

4.1.4测试指标：在试验前（30kg-60kg）、中期和试验后期（61kg～90kg）结束时，分别称个体重，称重均在早晨空腹进行。分阶段，以栏为单位记录其每日耗料量、发病率，同时计算日采食量和饲料利用效率，并对上述数据进行统计分析，生长猪生长性能见表2。

表2

4.1.5对上述试验全期测试结果进行分析如表3

表3

项目试验组对照组1偏差(%)对照组2偏差(%)日增重（g）877746131(17.56)657220(33.49)采食量（kg）189.73193.46-3.73(-1.92)210.17-20.44(-9.7)料重比2.803.36-0.56(-16.67)4.15-1.35(-32.53)腹泻率（%）04-4(-100)17-17(-100)毛色评分96.52.5(38.46)45(125)

从上述统计结果分析：试验组与对照组1和对照组2相比，在试验材料、试验环境、试验方法和实验设施等试验条件相同的情况下，日增重分别提高了17.56%和33.49%；采食量分别降低了1.92%和9.7%；料重比分别降低了16.67%和32.53%；腹泻率分别降低了100%；外观毛色质量分别提高了38.46%和125%；使用本发明的生长猪专用酶生长猪具有优良的生长性能和显著的免疫能力，提高了养殖产量和质量，降低了养殖成本，提高了养殖经济效益。