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2018-06-01
著录事项变更 IPC(主分类):C12Q1/68 变更前: 变更后: 申请日:20131212
著录事项变更
2015-09-09
授权
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2015-01-28
专利申请权的转移 IPC(主分类):C12Q1/68 变更前: 变更后: 登记生效日:20150108 申请日:20131212
专利申请权、专利权的转移
2014-05-21
实质审查的生效 IPC(主分类):C12Q1/68 申请日:20131212
实质审查的生效
2014-03-26
公开
公开
技术领域
本发明属于基因检测领域,涉及一种用于检测结直肠癌K-ras基因突变的核 酸质谱的制备方法及其产品,具体地是涉及利用核酸指纹质谱方法来检测一种 K-ras基因12、13密码子及其相关产品。
背景技术
K-ras基因(GenBank:NC_000012)是RAS基因超家族中的一种原癌基因, 位于12号染色体短臂上,其编码的蛋白是细胞表面受体如EGFR等信号传导通 路上的重要蛋白,在肿瘤的发生、发展起着关键作用。通过下游信号蛋白参与细 胞周期调控,与肿瘤细胞的生存、增殖、迁移扩散、血管生成密切相关。
在正常生理情况下,细胞受到外界刺激并激活EGFR等信号通路,野生型的 KRAS蛋白被上游EGFR等酪氨酸激酶磷酸化,导致短暂激活,从而激活该信号通 路中的下游信号蛋白,其后KRAS蛋白迅速失活。而K-ras基因的突变将导致蛋白 功能异常,在无EGFR活化信号刺激下,突变的KRAS蛋白仍处于激活状态,其 功能状态不可控,使肿瘤的持续增殖等。
近年来研究显示K-ras基因活性物与细胞增殖、凋亡之间关系密切。突变K-ras 基因使本应正常死亡的细胞的生存期延长,可能的机制是K-ras基因增强了细胞 分解过氧化氢的能力从而抑制凋亡。大约70%的肿瘤在不同程度上都与该基因 12、13位密码子突变有关。K-ras基因在结肠癌占44%,胰腺癌占90%。
目前已报道的K-ras基因突变集中于第12、13位密码子,该区域共有7种单 位点突变型(表1)。
表1:K-ras基因常见突变
新型的抗肿瘤靶向药物是以与肿瘤生物学特性相关的细胞信号通路上关键 因子为靶标,通过改变这些关键因子的活性,影响整个通路的信号传导,最终抑 制肿瘤细胞的发生、发展。
其中,Cetuximab(爱必妥)和Panitumumab(帕尼单抗)等药物,通过与 内源性配体(EGF、TGFα等)竞争性结合EGFR,阻断EGFR介导的细胞通路,从 而抑制肿瘤细胞的增殖。这些靶向药物价格昂贵,但是对携带野生型K-ras基因 的患者疗效非常好。而K-ras基因若发生突变,将使KRAS蛋白在无EGFR影响下 长期处于激活状态,使肿瘤持续增殖,这也就意味着这些药物失效。因此,如果 携有K-ras基因突变的患者服用相关药物,治疗效果不明显,不仅造成巨额药费 的浪费,还耽误了病情。
2008年6月在美国临床肿瘤学会(ASCO)年会上发布的临床结果表明,K-ras 突变型患者并不能从抗EGFR治疗中获益,并具有不良反应危险,而K-ras野生 型患者就很有可能从这类药物治疗中获益。同年10月,K-ras基因突变检测被写 入《美国国立癌症综合网络(NCCN)结直肠癌临床实践指南》(2008年第3版)。 该指南明确指出:所有转移性结直肠癌患者都应检测K-ras基因状态,只有野生 型患者才建议接受EGFR抑制剂(如Cetuximab、Panitumumab等)的治疗。欧 洲药监机构和美国FDA都明确规定了在使用靶向药物Cetuximab和Panitumumab 治疗转移性结肠癌前必须检测K-ras基因。我国的《结直肠癌诊疗规范(2010年 版)》也提示,“确定为复发或转移性结直肠癌时,检测肿瘤组织K-ras基因状态”。
所以,对K-ras基因突变进行检测,将有助于制定合理的用药方案,也是未 来肿瘤个体化治疗的发展方向。
另一方面,近年研究发现在外周血液中能够检测到早期肿瘤细胞逸出的突变 DNA,成为良好的肿瘤诊断、治疗预后的生物标记。Kimura等(2006年)报道 能够在循环血液中检测到K-ras突变,认为检测这些外周血液中的突变DNA,可 以知道患者体内是否存在微小病灶、肿瘤手术后是否存在转移、靶向药物靶标位 点的分子学特征等,从而作出相应治疗方案。因此,检测K-ras基因的突变,还 将有助于评价治疗效果,有助于对肿瘤发病风险进行预测,有助于对肿瘤转移进 行早期诊断。
目前检测K-ras基因突变的方法有多种,主要有两大类,一类是非实时PCR, 如测序法、限制性片段长度多态性法(RFLP)、DHPLC以及基于多重PCR和单碱 基延伸的质谱检测等,虽然测序法为核酸序列分析的金标准,基于多重PCR和单 碱基延伸的质谱检测也广泛的运用于基因多态和基因突变检测实验中,但是这些 方法步骤繁琐,耗时长。另一类是实时PCR及其各类变化,如TaqMan探针、竞 争性抑制实时PCR方法等。这类方法最大的缺陷在于,K-ras基因在12、13密码 子处共有7种突变类型,加上野生型共为8种基因型,以PCR的方法对这两个密 码子进行基因分型,共要进行8个PCR反应(如基于扩增受阻突变体系(ARMS) 的蝎子引物法),操作上过于繁琐,成本也较高。
综上所述,目前检测K-ras基因12、13密码子是否发生突变,对肿瘤患者(特 别是结直肠癌患者)能否使用特定的靶向抗癌药物具有极其重要的临床意义。而 现有的检测技术,或者步骤繁琐,耗时过长,或者要分多个反应进行,成本较高。
因此,目前需要一种对K-ras基因突变的快速、简便、准确和高效的检测方 法,从而为结直肠癌的合理给药治疗提供便利。
发明内容
本发明第一个目的提供一种制备K-ras基因12、13密码子突变的核酸指纹图 谱的方法,它包括如下步骤:
(1)PCR反应:使用特异性PCR引物,扩增包含12、13密码子在内的K-ras 基因DNA序列;
(2)PCR产物纯化:对步骤(1)得到的PCR产物进行纯化;
(3)逆转录和核酸酶切:使用特定的逆转录酶和核酸酶,对步骤(2)得到 的纯化产物进行逆转录和核酸酶切,获得一系列长度不一、丰度不一的核酸片段;
(4)纯化:对步骤(3)得到的酶切产物进行纯化;
(5)质谱仪检测:将步骤(4)得到的纯化产物上点在含有基质的靶片上, 上质谱仪进行检测,得到K-ras基因DNA片段(含12、13密码子)的核酸酶切 指纹图谱。
在一个实施方案中,步骤1所述的PCR引物选自如SEQ ID NO:1-2所示的序 列,且步骤3所述的特定酶,包括但不限于RNaseA酶。在一个具体实施方案中, 上述PCR引物序列为核心序列,其在5'端可包括保护碱基序列,优选5-15个碱 基。在另一个具体实施方案中,保护碱基序列选自在SEQ NO:1的5'端加入 aggaagagag,在SEQ ID NO:2的5'端加入cagtaatacgactcactatagggagaaggct。例如, 实际合成的引物序列如下:
5'-aggaagagagAAGGCCTGCTGAAAATGACTG-3'
5'-cagtaatacgactcactatagggagaaggctTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCT-3'
在另一个实施方案中,步骤5的纯化包括在转录和酶切产物中加入超纯水, 混匀后,再加入树脂,上下颠倒混匀15分钟。在另一个具体实施方案中,其中 所述质谱仪是MALDI TOF MS质谱仪。
上述任一方案中,其中密码子突变的类型选自12S、12R、12C、12D、12A、 12V、13D,其中,
本发明的第二个目的是提供建立K-ras基因12、13密码子突变的核酸指纹特 征图谱库的方法,至少包括:
上述步骤1-5,和:
(6)将步骤5得到的K-ras基因12、13密码子野生型及突变型的核酸指纹特 征图谱,通过计算机软件进行汇总和整理,得到所述的K-ras基因12、13密码子 的核酸指纹特征图谱库。
在一个实施方案中,所述软件是发明人自行研究开发的BioExplore软件,其 版权号为软著登字第136879号、登记号2009SR10700。
本发明的第三个目的是提供上述方法所制备的K-ras基因12、13密码子突变 的核酸指纹特征图谱库。
本发明第四目的是提供一种利用上述特征图谱库进行待测K-ras基因12、13 密码子突变检测的方法,包括:
(1)PCR反应:使用特异性PCR引物,扩增包含12、13密码子在内的待测 K-ras基因DNA序列;
(2)PCR产物纯化:对步骤(1)得到的PCR产物进行纯化;
(3)逆转录和核酸酶切:使用特定的逆转录酶和核酸酶,对步骤(2)得到 的纯化产物进行逆转录和核酸酶切,获得一系列长度不一、丰度不一的核酸片段;
(4)纯化:对步骤(3)得到的酶切产物进行纯化;
(5)质谱仪检测:将步骤(4)得到的纯化产物上点在含有基质的靶片上, 上质谱仪进行检测,得到待测K-ras基因DNA片段(含12、13密码子)的核酸 酶切指纹图谱;
(6)将所得核酸指纹特征图谱与核酸指纹特征图谱库进行比较,从而判断 待测K-ras基因12、13密码子的突变类型。
在一个实施方案中,步骤3所述的特定酶,包括但不限于RNaseA酶。在一 个具体实施方案中,其中所述质谱仪是MALDI TOF MS质谱仪。在另一个具体实 施方案中,步骤6通过BioExplore软件进行比较检测。
本发明的第五个目的是提供建立一种通过上述K-ras基因核酸指纹图谱库判 断该基因12、13密码子突变类型的方法,该方法至少包括:
本发明上述第一目的的步骤(1)-(5),和:
(6)将步骤(5)得到的待测样本的核酸酶切指纹图谱,与野生型或突变型 的核酸指纹特征图谱库进行对比,看是否存在特征峰,即可判断K-ras基因12、 13密码子的突变类型。
在一个实施方案中,上述方法可用于指导临床用药。
本发明的第六个目的是提供能用于K-ras基因12、13密码子基因型检测的检 测产品,包括:
(1)用于扩增DNA的引物对及其缓冲液;
(2)用于PCR产物纯化的试剂;
(3)用于逆转录及核酸酶切的逆转录酶和核酸酶及其缓冲液;
(4)用于纯化酶切产物的试剂;
(5)用于比对核酸指纹特征图谱的分析软件。
在一个实施方案中,其中所述引物是SEQ ID NO:1-2。
在另一实施方案中,其中所述软件是BioExplore软件,其版权号为(软著登 字第136879号、登记号2009SR10700)。
定义
本发明所述的“K-ras基因DNA片段”,是指K-ras基因编码序列中,包含12、 13密码子在内的一段DNA。
术语“保护碱基”,指在PCR引物的5'端额外增加的碱基。由于保护碱基的序 列使得PCR引物(即核心引物)的分子量增大,可以避免反应剩余的PCR引物 进入质谱检测窗口,以避免干扰检测效果。
术语“检测产品”,指用于检测SNP位点基因型的任何常规产品,包括:检测 试剂、检测芯片(如基因芯片、液体芯片等)、检测载体,以及检测试剂盒等。
有益效果
1、本发明能够实现K-ras基因12、13密码子基因型的检测,方便临床医师做出 用药判断。
2、相对于测序法、限制性片段长度多态性法(RFLP)、DHPLC以及基于多重PCR 和单碱基延伸的质谱检测等方法,本发明全过程仅用1-3小时即可完成,可快速 获得基因型结果;
3、相对于常规PCR测序检测、竞争性抑制实时PCR、基于扩增受阻突变体系 (ARMS)的蝎子引物法等方法,本发明仅在一个反应孔内即可完成实验,方便 快捷,并且大大的降低了试剂盒耗材成本;
4、质谱检测技术具有高灵敏度、高准确性。
附图说明
图1为野生型(WT)的核酸酶切指纹图谱
图2为突变型(12A)的核酸酶切指纹图谱
图3为突变型(12C)的核酸酶切指纹图谱
图4为突变型(12D)的核酸酶切指纹图谱
图5为突变型(12R)的核酸酶切指纹图谱
图6为突变型(12S)的核酸酶切指纹图谱
图7为突变型(12V)的核酸酶切指纹图谱
图8为突变型(13D)的核酸酶切指纹图谱
图9为对照样本1的测序结果
图10为样本1的测序结果
图11为样本2的测序结果
图12为样本3的测序结果
具体实施方式
现在仅用参考下面非限制性的实施例的方式进一步描述本发明。但是应当理 解,下面的实施例仅仅是作为例证的,不应以任何方式当作对上述本发明总体的 限制。除非有其它说明。本发明的实施例使用本领域中的传统分子生物学、细胞 生物学、PCR扩增和突变技术等等。这些技术是技术人员熟知的,并在文献中有 详细解释。参见,例如,
Sam brook and Russell″Molecular Cloning:A Laboratory Manual″(2001);
Cloning:A Practical Approach,″Volumes I and II(D.N.Glover,ed.,1985)″;
T.A Brown“Genome”BIOS Scientific Publishers Limited;
PY Kwok Annu.Rev.Genomics Hum.Genet.(2001),235–58.
实施例一、引物设计。
针对K-ras基因DNA片段,设计对应特异性PCR引物核心序列(SEQ ID No: 1和SEQ ID No:2),该对引物能扩增K-ras基因编码序列上,含12、13密码子 在内的83bp。
SEQ ID No:1:5'-AAGGCCTGCTGAAAATGACTG-3'
SEQ ID No:2:5'-TAGCTGTATCGTCAAGGCACTCT-3'
它们扩增的序列SEQ ID NO:3(83bp)如下(其中加下划线区域为12、13密 码子,仅列出野生型):
SEQ ID No:3:AAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTG GTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTA
为了使逆转录酶识别PCR产物,并且避免PCR引物进入质谱仪检测窗口而 干扰检测效果,还需要在SEQ ID No:1和SEQ ID No:2的5'端加上特定序列(小 写字母)。因此,实际合成的引物序列如下:
SEQ ID No:4:5'-aggaagagagAAGGCCTGCTGAAAATGACTG-3'
SEQ ID No:5:5'-cagtaatacgactcactatagggagaaggctTAGCTGTATCGTCAAGGC ACTCT-3'
它们扩增的PCR产物实际序列如下(其中加下划线区域为12、13密码子, 仅列出野生型,大写字母为K-ras基因的部分编码DNA,小写字母为SEQ ID No: 1和SEQ ID No:2的5'端加上的特定序列):
SEQ ID No:6:aggaagagagAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTT GGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAagccttctccctatagtgagtcgtatt actg
相关引物在生工生物工程(上海)有限公司进行合成。
实施例二、样本制备。
通过质粒构建和定点突变等分子克隆技术,分别构建含K-ras基因野生型和 7种突变的的质粒,共8种,分别为样本WT(野生型)、12A(12密码子GGT>GCT)、 12C(12密码子GGT>TGT)、12D(12密码子GGT>GAT)、12R(12密码子GGT>CGT)、 12S(12密码子GGT>AGT)、12V(12密码子GGT>GTT)、13D(13密码子GGC>GAC)。 此操作采用基本的分子生物学常用技术,不再累述。
临床结直肠癌患者一,在手术切除肿瘤组织时,取新鲜组织块(黄豆大小), 以血液/细胞/组织基因组提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司,DP304) 提取该患者肿瘤基因组DNA,定为样本1,-20℃备用。
结直肠癌术后患者二,采集静脉血,分离血清(约1ml),采用磁珠法基因 组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司,DP329)提取该患者血清 中的游离DNA,定为样本2,-20℃备用。
某结直肠癌患者三的组织标本,取石蜡切片10块(5um厚,每块中肿瘤组 织面积大于70%),采用石蜡包埋组织DNA试剂盒(天根生化科技(北京)有限 公司,DP331)提取该样本中的患者的肿瘤基因组DNA,定为样本3,-20℃备用。
根据上述方法,对三名已知未患有结直肠癌的其他疾病患者,分别采集其直 肠组织、静脉血以及直肠组织石蜡切片,进行处理,分别得到对照样品1-3,-20℃ 备用。
实施例三、K-ras基因12、13密码子野生型和突变型核酸酶切指纹图谱的差异性 分析和验证。
通过对野生型和突变型的序列进行理论分析,野生型和突变型将产生不同的 核酸酶切指纹图谱,如表2所示,野生型的DNA片段,通过酶切将产生3738.35 峰,并且不具有1577.98、2196.38、2485.56、3778.38和3794.37等峰,而突变 型的DNA片段正好相反,通过酶切和质谱后将产生1577.98、2196.38、2485.56、 3778.38和3794.37等峰中的一个或几个,而不存在3738.35峰。因此,理论上可 通过3738.35峰是否存在确定是否存在野生型,通过1577.98、2196.38、2485.56、 3778.38和3794.37等峰中的一个或几个是否存在确定是否存在突变型。
表2:K-ras基因12、13密码子野生型和突变型核酸酶切片段的理论分析
应当注意的是,如果检测同时存在野生型(即3738.35峰)和突变型(如 1577.98、2196.38、2485.56、3778.38和3794.37等峰),表明待检样本为野生- 突变的杂合型。
在本实施例中,使用所构建的8个含K-ras基因12、13密码子野生型或突变 型的质粒,分别进行酶切和检测,所得核酸酶切指纹图谱库(即图1至图8), 与理论分析一致。
因此,通过本实验,即建立了针对12、13密码子不同基因型的K-ras基因 DNA片段标准核酸酶切指纹图谱。具体实验过程如下:
1、PCR
体系:
GeneAmp Fast PCR Master Mix(LifeTechnologies,4359187),2x,10ul
上下游PCR引物,10pmol/ul,各1ul
DNA模板,1ul
超纯水,17ul
反应参数:
94℃,2min
94℃,1sec,64℃,1sec,25cycles
2、PCR产物纯化
使用Diffinity RapidTip(Sigma-Aldrich,D1947)对PCR产物进行纯化
3、逆转录和核酸酶切
体系:
取2ul纯化产物,加入:
RNase-free ddH2O,2.67ul
5×T7Polymerase Buffer,0.89ul
T Cleavage Mix,0.22ul
DTT(100mM),0.22ul
T7RNA&DNA Polymerase,0.4ul
Rnase A,0.6ul
以上试剂,除Rnase A(Takara,D202)外,均来自Sequenom公司。
反应参数:
15min,37℃
4、酶切产物纯化
在7ul的转录和酶切产物中加入20ul超纯水,混匀后,再加入6mg树脂(resin, 美国Sequenom公司),上下颠倒混匀15分钟。
5、质谱仪检测
纯化后的产物使用纳升点样仪(Nanodispenser,美国Sequenom公司),点 至含基质的芯片上(SpectroCHIP,美国Sequenom公司),并使用飞行时间质谱 仪(美国Sequenom公司)进行检测和结果判断。
实施例四、临床标本检测。
以实施例三所述实验方案对样本1-3和对照样本1-3进行生物学实验和质谱 检测。各样本的检测结果如表3所示:
表3:样本1-3和对照样本1-3(CK1-3)的检测结果
由表3可知:
样本1未发现12、13密码子突变,该患者术后可服用Cetuximab、 Panitumumab等EGFR抑制剂;
样本2中除12、13密码子野生型之外,也发现突变基因型12A(1,577.98和 2,196.38峰值),因此样本2为WT/12A杂合型,表明该患者预后较差,复发概率 较大,临床应密切监测,注意饮食、修养,以配合各类治疗;
样本3中未发现12密码子野生型发现突变基因型12V(3,778.38峰值),因 此该患者为12V纯合型,表明该患者可能对Cetuximab、Panitumumab等EGFR 抑制剂表现为耐药,临床应考虑更换治疗方案,如改用化疗药物。
对照样本1-3,均未发现12、13密码子突变,表明12、13密码子突变主要 存在于结直肠癌患者中。
对照实施例
一、根据实施例1,使用引物SEQ ID NO:1-2,对各位点进行PCR扩增及测 序,过程如下:
1、PCR
体系:
GeneAmp Fast PCR Master Mix(LifeTechnologies,4359187),2×,10ul
上下游PCR引物,10pmol/ul,各1ul
DNA模板,1ul
超纯水,17ul
反应参数:
94℃,2min
94℃,1sec,64℃,1sec,25cycles
2、PCR产物纯化
使用Diffinity RapidTip(Signa-Aldaich,D1947)对PCR产物进行纯化.
3、测序鉴定
(1)PCR反应体系为25μl
用ddH2O补齐。
(2)反应条件:反应在ABI公司9700热循环仪上进行,反应条件为94℃预变 性5分钟,94℃变性30秒,55℃退火30秒,72℃延伸40秒,35个循环,反应 结束后再72℃延伸7分钟,4℃保存。
(3)PCR产物纯化和测序
①向装有PCR产物的96孔板中加入50微升洗涤缓冲液,混匀。
②将其转移到Millipore纯化板中,放到真空泵上抽滤约3分钟,看到 纯化板中没有水即可。
③向纯化板中再次加入50微升的洗涤缓冲液,继续抽滤,直到纯化板 中没有水为止。
④将纯化板从真空泵上取下,向板中加入20微升的去离子水,静置15 分钟。
⑤再震荡15分钟,然后吸到一新96孔板内。
测序反应所需试剂应为新鲜配制,需要经高压灭菌的试剂必须灭菌后方可使 用。测序反应所需的器材(如384孔板、tip头等)同样应为洁净无菌的。
⑥为了保证测序样本及反应试剂的新鲜,加样时应在冰上操作。
⑦测序反应体系为5μl,各种试剂加入量如下:PCR产物3-10ng, BigDyev3.10.25μl,5×BigDye buffer0.875μl,引物1.6pmol;
⑧样品放于PCR仪上做如下反应:
步骤:95℃,5分;
95℃,10秒;60℃,4分;重复30个循环;
4℃保持直到准备纯化。
⑨在每个孔中加入20μl80%乙醇,4,000rpm离心30min;
⑩将样品板放在折好的纸巾上,在离心机中倒甩,倒甩时速率1000rpm;
在每孔中加入30μl70%乙醇,4000rpm离心10min,倒甩;
重复第11步的操作2次;
将样品板放于干净的抽屉中,避光干燥30min;
加人5μl甲酰胺,封膜,离心后置于-20℃冰箱中;
测序仪前95℃变性5分钟,放置冰上2分钟,离心后上样。
使用ABI3730xl型遗传分析仪进行序列测定
二、测序结果
使用引物SEQ ID NO:1-2,分别对对样本1-3进行测序,并对每个样本的密 码子12-13的测序图进行分析,结果如图9-12所示(图9为对照样本1的测序 图):
图9和图10所示,样本1和对照样本1的12-13密码子位点为GGT-GGC, 表明该两个样本均为野生型WT;
图11所示,样本2中的密码子存在等位突变,即GGT-GGC和GCT-GGC两种 类型,表明该样本为WT/12A杂合型;
图12所示,样本3中的密码子也存在等位突变,即GTT-GGC类型,表明该 样本为12V纯合型。
经过比较,图9-12的结果与表5完全一致,说明本发明检测方法的准确性。
机译: 用于扩增核酸的嵌合寡核苷酸底漆;扩增核酸的产品;一种检测目标核酸的方法的探索;一种具有固定化的扩增的核酸的材料及其制备方法;确定核苷酸序列的方法
机译: 核酸酶多组分的组合物(疟疾),检测至少一种组合促进剂的存在的方法,靶标,核酸序列的变体,用于检测至少一种甲基化核酸的存在和通过级联扩增来检测sp,从而至少是一种促进组合物的方法。多种核酸酶多组分(mnazima)的制备方法,以及至少一种寡核苷酸的使用
机译: 一种用于碱基交换检测的样品核酸,用于一种碱基检测的PCR引物,用于离子交换色谱分析的一种碱基检测的样品的制备方法