猪葡萄球菌脱落毒素分型的多重荧光PCR检测方法及试剂盒

摘要

本发明公开了一种猪葡萄球菌4种脱落毒素分型（EXHA、EXHB、EXHC和EXHD）的多重荧光PCR方法及试剂盒，属于多重荧光PCR方法及试剂盒领域。本发明的方法采用了序列如SEQ ID NO:1-8所示的引物，还采用了序列如SEQ ID NO:9-12所示的Taqman探针。本发明还提供了猪葡萄球菌脱落毒素EXHA、EXHB、EXHC和EXHD多重荧光PCR检测试剂盒，该试剂盒包含上述引物和Taqman探针，还包括DNA聚合酶；PCR缓冲液；dNTP和水。本发明的试剂盒具有特异性强、灵敏度高、快速、操作方便、节约耗材、成本低廉等优点，可用于猪葡萄球菌4种脱落毒素的检测，用于科研及临床应用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种多重荧光PCR方法及试剂盒，特别涉及一种猪葡萄球菌4种脱落毒素分型（EXHA、EXHB、EXHC和EXHD）的多重荧光PCR方法及试剂盒。

背景技术

葡萄球菌产生的脱落毒素可以引起人和动物发生严重的皮肤性疾病。例如金黄色葡萄球菌可引起人的烫伤样皮肤综合症，猪葡萄球菌可引起仔猪发生渗出性皮炎。目前发现的脱落毒素有9种，包括金黄色葡萄球菌产生的ETA、ETB和ETD，以及猪葡萄球菌产生的EXHA、EXHB、EXHC和EXHD，还有日本研究人员发现的另外两种猪葡萄球菌毒素蛋白SHETA和SHETB。

猪葡萄球菌（S.hyicus）可以引起猪群发生大规模的渗出性皮炎病（Exudative Epidermitis,EE），它是一种急性、高度接触性的猪传染病，患猪以急性全身性渗出性皮炎为主要特征，该病又称溢脂性皮炎或煤烟病。本病主要感染5-6日龄的初生哺乳仔猪、刚断奶的仔猪以及母猪乳房上。该病原可通过各种途径感染，主要以破裂和损伤的皮肤黏膜引起动物的感染。据国内外的研究结果表明它的发病率为80%；死亡率5%～90%不等；少数存活的病猪常导致生长发育障碍形成“僵猪”。

猪葡萄球菌所产生的这些脱落毒素是造成猪渗出性皮炎的主要致病因子之一，它是一种细胞外分泌的蛋白质，分子量大约30KD。丹麦研究者首先通过PCR和Western-blot对产生的脱落毒素进行了分析和研究，将脱落毒素分为4种类型，并分别命名为EXHA、EXHB、EXHC、EXHD，其中EXHD的抗原性不同于其他3种毒素的抗原性。这4种脱落毒素的基因大小约为816bp～834bp，这些基因携带一些质粒，并受这些质粒的调控。

由于猪葡萄球菌在嗜菌型、血清型和DNA指纹型方面具有多型性(Andresene tal,1993)，发病猪中同时存在不同型的S.hyicus，从而使诊断变得复杂。Wegener发现从每个病猪的皮肤上任选分离出的10株S.hyicus中，平均包含1.9种不同的噬菌体型和2.3种不同的抗生素型。从动物肝、脾中分离到的菌株的多样性则稍低一些。目前，在实验室诊断中缺少简易方法来区分毒力型和非毒力型菌株，所以各型S.hicus都应被看做潜在的毒力型菌株。但是，由于引起该病的病因很复杂，而且易与其它皮肤病变混淆，如脂痘，疥癣，癣，玫瑰糖疹，缺锌，增生性皮肤病等。因此，在诊断过程中要选择特异性强、灵敏度高的检测方法进行鉴别诊断。

目前，对猪葡萄球菌产生的脱落毒素采用的诊断方法主要是细菌学的分离鉴定、生化试验、冰冻组织切片、免疫印迹分析、酶联免疫（ELISA）、PCR和多重PCR方法等。

以上这些方法虽然已经得到了推广应用，但是都存在耗费时间长、灵敏性和特异性欠佳等缺陷，对实际生产的指导意义不大。因此，建立一种快速、高效、准确的多重荧光PCR诊断方法已迫在眉睫。

发明内容

为克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种猪葡萄球菌脱落毒素分型的多重荧光PCR检测引物组，其中包括检测EXHA、EXHB、EXHC及EXHD的4组特异性引物和4条Taqman探针。

本发明的另目的在于提供包含上述检测引物组的猪葡萄球菌脱落毒素分型的多重荧光PCR检测试剂盒，从而使检测达到灵敏、快速、准确、节约材料和试剂的目的。

本发明的再一目的在于提供上述检测试剂盒检测猪葡萄球菌脱落毒素分型的多重荧光PCR方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种猪葡萄球菌脱落毒素分型的多重荧光PCR检测引物组，包括用于检测EXHA、EXHB、EXHC及EXHD的4组引物和4条Taqman探针；

所述的4组引物为：

所述的Taqman探针由5’端带有的荧光物质，Taqman探针的序列和3’端带有的淬灭物质组成；

所述的5’端带有的荧光物质优选为FAM、JOE、TAMRA、Cy5中的至少一种；

所述的3’端带有的淬灭物质优选为BHQ、BHQ1、BHQ2和BHQ3中的至少一种；

所述的4条Taqman探针的序列如下：

优选的，上述4条Taqman探针如下：

EXHA-Prob-FAM FAM-tgaagcgccttttggagcagga-BHQ

EXHB-Prob-JOE JOE-cacgccaatagagaatgtatcacatg-BHQ1

EXHC-Prob-TAMRA TAMRA-tggcagattaaatgttcaaggagaagc-BHQ2

EXHD-Prob-Cy5   Cy5-cgttgctaccgcttcagttgtagga-BHQ3

其中，引物EXHA-F和EXHA-R用来检测猪葡萄球菌脱落毒素EXHA，本发明中称之为EXHA组引物；引物EXHB-F和EXHB-R用来检测猪葡萄球菌脱落毒素EXHB，本发明中称之为EXHB组引物；引物EXHC-F和EXHC-R用来检测猪葡萄球菌脱落毒素EXHC，本发明中称之为EXHC组引物；引物EXHD-F和EXHD-R用来检测猪葡萄球菌脱落毒素EXHD，本发明中称之为EXHD组引物。

其中，EXHA-Pob-FAM是用来检测猪葡萄球菌脱落毒素EXHA的探针，EXHB-Prob-JOE是用来检测猪葡萄球菌脱落毒素EXHB的探针，EXHC-Prob-TAMRA是用来检测猪葡萄球菌脱落毒素EXHC的探针，EXHD-ProbCy5是用来检测猪葡萄球菌脱落毒素EXHD的探针。

所述的猪葡萄球菌脱落毒素分型的多重荧光PCR检测试剂盒，包括上述检测EXHA、EXHB、EXHC及EXHD的4组引物和4条Taqman探针；

所述的猪葡萄球菌脱落毒素分型的多重荧光PCR检测试剂盒，具有由以下成分组成：上述检测EXHA、EXHB、EXHC及EXHD的4组引物和4条Taqman探针；DNA聚合酶；DNA聚合酶缓冲液；dNTP和水。

所述的DNA聚合酶、DNA聚合酶缓冲液和dNTP优选为TaKaRa公司（中国大连）的Premix Ex Taq试剂盒中的Premix溶液；

上述的检测试剂盒检测猪葡萄球菌脱落毒素分型的多重荧光PCR方法，具体步骤如下：

（1）提取待测样品的DNA模板；

（2）配制PCR反应体系（在一个PCR管中配制）：步骤（1）待测样品DNA模板2μL；4组引物中各条引物的量为5-15pmol；4条Taqman探针中各种探针的量为2-10pmol；Premix溶液10μL（包含TaKaRa Ex Taq0.5U、dNTPs和Ex TaqBuffer），加水至总体积为20μL；

（3）将上述步骤（2）中配制的PCR反应体系置于荧光定量PCR仪中反应，反应条件如下：95℃30秒，热循环为95℃1秒，60℃20秒，共40个循环；

（4）通过荧光探针上所携带的荧光染料的颜色对应的扩增曲线的CT值判断，是否存在EXHA、EXHB、EXHC及EXHD，及存在的量的多少。

本发明相对于现有技术相比具有以下优点和效果，本方法采用自身设计的EXHA/EXHB/EXHC/EXHD特异引物及Taqman探针，使用FAM/JOE/TAMRA/Cy5多重荧光素标记，实现了对猪葡萄球菌4种脱落毒素分型的一管多重检测，具有特异性强、灵敏度高、快速、操作方便、节约耗材、成本低廉等多种优点，可作为猪葡萄球菌4种脱落毒素检测的试剂，用于科研及临床应用，包括对猪葡萄球菌的流行病学研究等方面。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：引物、探针的特异性试验

运用生物信息学和设计引物探针的生物软件对现有数据库中的猪葡萄球菌4种脱落毒素EXHA、EXHB、EXHC和EXHD基因（NCBI中GenBank编号分别为:JQ728534，EU259000，JQ728530，AF515456）序列进行比分析后，设计了如表1所示的引物和探针，以实现猪葡萄球菌脱落毒素EXHA、EXHB、EXHC和EXHD一管多重荧光PCR检测。表1为猪葡萄球菌脱落毒素引物和探针序列。

表1猪葡萄球菌脱落毒素引物和探针序列

其中探针序列经过荧光标记后的荧光探针信息如表2

表2

EXHAEXHA-Prob-FAMFAM-tgaagcgccttttggagcagga-BHQEXHBEXHB-Prob-JOEJOE-cacgccaatagagaatgtatcacatg-BHQ1EXHCEXHC-Prob-TAMRATAMRA-tggcagattaaatgttcaaggagaagc-BHQ2EXHDEXHD-Prob Cy5Cy5-cgttgctaccgcttcagttgtagga-BHQ3

为了验证所设计的引物和荧光探针的特异性，首先设计单重荧光PCR反应，对引物和探针进行评估，分别检测EXHA、EXHB、EXHC和EXHD四组引物和荧光探针单独检测的特异性。实验采用培养分离的阳性株进行，阳性株HZ-2株、ExhB1-2007株、ZC-2株和GZ-3株于2012年由陈亚强（陈亚强，郝永清，张乐宜，等.猪葡萄球菌脱落毒素多重PCR检测方法的建立与初步应用.中国兽医学报,2012,32(10）:1452-1456)、张乐宜（张乐宜.华南地区猪群中葡萄球菌的分离鉴定及猪葡萄球菌EXHC毒素基因的原核表达.2012，内蒙古农业大学硕士论文）等分离保存，这些菌株分别产生脱落毒素EXHA、EXHB、EXHC和EXHD。分别选择副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，HPS)、大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）、猪链球菌(Streptococcus suis)各1株。实验分别取100μL上述培养物标本，通过常规DNA提取，得到50μL核酸产物，用PCR缓冲液进行试剂配制（所用PCR缓冲液来自TaKaRa公司的Premix Ex Taq试剂盒中），其中加入表1中的各条引物的量为5-15pmol，加入表1中的各种探针的量为2-10pmol，PCR缓冲液，Premix溶液10μL（包含TaKaRa Ex Taq0.5U、dNTPs和Ex Taq Buffer），加水至总体积20μL，其中检测样品提取的DNA溶液体积为2μL，最后置于荧光定量PCR仪中反应，反应条件如下：95℃30秒，热循环为95℃1秒，60℃20秒，共40个循环，实验结果见表2。单重反应的特异性检测结果。

表2单重荧光PCR反应的特异性检测结果

表2的实验结果表明，利用本发明的引物和探针对阳性培养物进行对照检测筛查，所设计的引物和探针特异性高，与其它常见细菌性病原体无交叉反应，所检测的4种EXHA、EXHB、EXHC和EXHD之间亦无交叉反应，检测方法特异性高。

实施例2：多重荧光PCR检测试剂的特异性试验

多重检测试剂使用TaKaRa公司的Premix Ex Taq试剂盒中的PCR缓冲液进行试剂配制，其中加入表1中的各条引物的量为5-15pmol，加入表1中的各种探针的量为2-10pmol，Premix溶液10μL（包含TaKaRa Ex Taq0.5U、dNTPs和Ex Taq Buffer），加水至总体积20μL，其中检测样品提取的DNA溶液体积为2μL，最后置于荧光定量PCR仪中反应，反应条件如下：95℃30秒，热循环为95℃1秒，60℃20秒，共40个循环。

分别使用单阳性模板（分别为菌株HZ-2株、ExhB1-2007株、ZC-2株和GZ-3株的培养物，这些菌株分别产生脱落毒素EXHA、EXHB、EXHC和EXHD）和四阳性模板（为上述4种菌株培养物的等量混合）对多重检测试剂进行试验，

同时使用单重荧光PCR试剂进行对比。实验结果见表3。

表3为引物和探针的单重和多重反应的特异性检测结果

表3实验结果表明，多重检测试剂的特异性与单检测试剂的特异性完全一致。

实施例3：猪葡萄球菌脱落毒素多重荧光PCR检测试剂的灵敏性试验

为了进一步检验试剂的灵敏性，对猪葡萄球菌脱落毒素阳性样品进行10倍梯度稀释，为稀释度1～6，分别表示猪葡萄球菌脱落毒素阳性样品稀释10～10⁶倍，然后用猪葡萄球菌脱落毒素多重及单重PCR检测进行对比，结果见表4。表4为多重及单重PCR检测试剂对10倍梯度稀释的阳性样品的对比实验结果数据表。

表4

实施例4：猪葡萄球菌脱落毒素多重荧光PCR检测试剂临床标本检测试验

使猪葡萄球菌脱落毒素多重及单重PCR检测试剂同时对210份临床样本（样本来源于养猪场），检测获得EXHA阳性4株，EXHB阳性9株、EXHC阳性12株和EXHD阳性6株，结果见下表5。

表5猪葡萄球菌脱落毒素多重及单重荧光PCR检测结果

从上面的实验表明，本发明猪葡萄球菌脱落毒素多重荧光PCR检测试剂，可以用于科研及临床应用，达到灵敏、快速准确，成本低廉的检测猪葡萄球菌4种脱落毒素。

最后应当说明的是，上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。