利用重组慢病毒诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化的方法

摘要

本发明涉及一种生物工程技术，具体地说是一种利用基因重组病毒诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化的方法：重组慢病毒载体构建；神经干细胞的分离、培养及鉴定；重组病毒转染NSCs；重组慢病毒转染NSCs的鉴定；重组病毒转染NSCs：取传代3次后的NSCs消化制备成单细胞悬液，接种至培养板中；转染TH+Brn4基因重组慢病毒；加入慢病毒和ploybrene，摇晃混匀后将培养板置培养箱中培养，12小时后更换新鲜分化培养基；同时用嘌呤霉素进行筛选，以获得稳定转染的细胞；本发明的优点在于：通过构建目的基因TH和Brn4的慢病毒载体，转染NSCs后外源性基因能在细胞内稳定表达；分化后产生高比例的TH阳性多巴胺能神经元；Brn4能促进神经营养因子的高表达，且具有抑制细胞凋亡的功能。

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用重组慢病毒诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化的方法。 

背景技术

帕金森病(Parkinson’s Disease，PD)是一种常见的中枢神经系统退行性疾病，其基本病理改变是特异性的中脑黑质多巴胺能神经元因各种原因渐行性退变坏死，数量减少，致使纹状体内多巴胺神经递质释放减少，从而产生震颤、肌肉强直等一系列运动障碍症状。 

传统的药物治疗和外科治疗仅限于改善症状，但并不能阻止病情发展，不能从根本上解决问题。由于此病变主要侵犯中脑黑质多巴胺能神经元，且黑质多巴胺能神经元投射的靶区纹状体定位明确，所以在黑质-纹状体系统内移植能够分泌多巴胺的细胞，恢复多巴胺的神经环路是一个针对病因治疗的理想方法。 

近三十年来，PD的脑内移植研究取得了较大的进展，有许多PD患者接受了流产胎儿中脑组织的移植，移植组织中的多巴胺神经元能够长期存活，并不断释放多巴胺，使病人的运动症状得以明显改善。这表明细胞移植替代治疗是治疗PD较有希望的方法。但因胚脑移植物来源有限、异体免疫排斥及伦理等问题，胚脑组织移植在实际应用中受到很大限制。 

神经干细胞(Neural stem cells，NSCs)是当前国际上研究的热点之一，它不仅存在于胚胎脑组织中，在成年脑内也已被发现。NSCs不仅具有分裂增殖和自我更新的能力，还具有多分化潜能，可以分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等神经系统多种类型的细胞，包括多巴胺能神经元。因此，NSCs作为细胞移植替代治疗的供体细胞治疗PD等神经系统退行性疾病具有巨大的潜力和优越性。然而，研究表明体外培养的NSCs一般情况下大多分化为胶质细胞，很少分化为神经元，特别是特异性的多巴胺能神经元，这给临床应用NSCs移植治疗PD造成了极大的障碍。同时，目前的研究表明单独NSCs移植后细胞存活率只有5％-10％，且不能有效地迁移分化并整合到宿主的神经环路中，从而不能很好的释放神经递质发挥生理功能。 

所以探讨诱导NSCs分化为多巴胺神经元的方法以及促进移植的细胞在体内存活，较长时间地分泌多巴胺是NSCs移植治疗PD研究中迫切需要解决的问题。 

酪氨酸羟化酶(Tyrosine Hydroxylase，TH)是细胞内酪氨酸合成多巴胺过程中的限速酶，通常作为多巴胺能神经元的特异性标志，其表达情况是NSCs能否转化为多巴胺能神经元的关键。研究发现，脑内TH含量与中脑多巴胺含量呈线性正相关，PD患者脑内TH及TH mRNA的水平明显低于正常人，提示补充脑内TH基因可促进多巴胺的生物合成。将人或鼠TH 基因作为目的基因转入多种细胞的体内和体外实验证明，经TH遗传改造的细胞具有分泌多巴胺的能力。因此，设法提高NSCs的TH活性，促进多巴胺的生成和释放是NSCs移植联合转基因治疗PD的新方法。 

Brn-4是转录因子POU蛋白家族第三类成员之一。许多资料表明，多种同源盒基因，如HOX、POU、LIM、PAX等，编码的转录因子在胚胎发育过程中对神经细胞的分化、迁移和某些组织特异性基因的表达起着重要的调控作用。其中，POU同源盒基因在中枢神经系统发育过程中扮演着重要角色。根据POU区的全部氨基酸序列同源程度，哺乳动物POU蛋白分为Class I～ClassVI共六类，Brn-4和Brn-1、Brn-2、Tst-1同属于第III类，在胚胎早期Brn-1、Brn-2、Brn-4即在神经系统中出现，且分布广泛，提示这些因子可能参与早期神经发生。近期在《Nature》上的一篇报道中，将三个转录因子Ascl1、Brn-2、Mytl1导入来自成年大鼠尾部的皮肤细胞，一周后，约有20％的实验鼠皮肤细胞转化为神经细胞，这些神经细胞不但可以表达神经蛋白，而且可与其他神经细胞形成突触联系，表明POU蛋白家族成员Brn-2在神经发育中的关键作用。可见，POU蛋白家族的第III类因子对NSCs分化命运可能起着决定性的作用。Le Moine等的研究还发现，阻断成年哺乳动物黑质向纹状体的多巴胺能神经投射，会引起纹状体内Brn-4表达上调。表明Brn-4可能和成年哺乳动物去多巴胺能神经支配后纹状体内的神经再生与修复有关。 

前期研究中，通过切割大鼠穹窿海马伞阻断自隔区向海马投射的胆碱能神经纤维建立去神经支配海马模型，将NSCs移植到海马内，植入的NSCs在去神经支配的海马内更容易存活，并且更多地分化为神经元，同时，存在于齿状回的内源性NSCs在去神经支配损伤刺激下也出现明显增生、迁移和神经元分化。上述结果表明，去神经支配损伤后，海马内局部微环境的改变为NSCs的存活、再生和向神经元分化提供了良好的条件。我们进一步利用原位杂交、RT-PCR、免疫组织化学和Western blot等多种方法检测发现，Brn-4的转录和表达水平在去神经支配的海马内均明显上调。在获得的去神经支配海马提取液中加入过量的Brn-4抗体中和其中的Brn-4，再与NSCs共培养，结果发现，抗体中和后，去神经支配海马提取液促进神经元分化的效应显著减弱。利用RNA干扰技术将针对Brn-4的小RNA片段转入NSCs中，下调细胞内Brn-4的水平，结果NSCs分化为神经元的比例明显下降。相反，过表达Brn-4的NSCs分化为神经元的比例明显升高，而且新生神经元的成熟度明显增加。这些结果说明Brn-4在NSCs向神经元分化成熟过程中起着十分重要的作用。进一步研究还发现，转染Brn-4基因的NSCs在体外分化7天后，Western blot检测发现凋亡相关蛋白Caspase-3的表达明显低于对照组，提示Brn-4可能具有抑制细胞凋亡的作用。Shimazaki等的研究发现，在体外用脑源性神经生长因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)和胰岛素样生长因子-1 (Insulinlike growth factor-1，IGF-1)刺激来源于小鼠胚胎纹状体的NSCs分化过程中，Brn-4表达迅速上调，且Brn-4蛋白主要表达于新生的神经元内；应用反义寡核苷酸技术阻断Brn-4的功能，NSCs分化为成熟神经元的比例则下降。说明Brn-4可能通过一些神经营养因子的介导来调控NSCs向神经元的分化及其成熟。然而，Brn-4促进NSCs向成熟神经元分化并且维持移植细胞存活的分子机制在国内、外没有研究。如果能通过TH和Brn-4基因有效地诱导NSCs向成熟的多巴胺能神经元分化，并且通过Brn-4维持移植后细胞的存活，使之长时间地分泌多巴胺，纠正PD的病理和生化异常，改善临床症状，这将为多基因联合NSCs移植治疗PD提供新的方法和实验依据。 

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的不足之处，提供一种利用重组慢病毒诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化的方法。 

为了实现本发明的目的，我们将采用如下技术方案予以实施： 

利用重组慢病毒诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化的方法，所述的方法包括如下实施步骤： 

一、pLV5-TH+Brn4重组慢病毒载体构建： 

根据pLV5-EFla-GFP慢病毒表达载体的要求和GenBank大鼠TH和Brn4的cDNA功能全长序列分别为NM_012740和NM_017252的基因，合成目的基因并构建pLV5-TH、pLV5-Brn4和pLV5-TH+Brn4慢病毒表达载体，包装滴度后进行测序鉴定和滴度鉴定； 

二、神经干细胞的分离、培养及鉴定： 

神经干细胞的培养方法：在无菌条件下取孕14d的SD胎鼠腹侧中脑组织，用吸管反复吹打直至为细胞悬液，并经200目尼龙网过滤，收集过滤后的细胞悬液，用基础培养基清洗3遍后重悬于NSCs培养液中，经细胞计数和活力观察后，按1×105/ml细胞密度接种于含有10ml NSCs培养液的细胞培养瓶中，置于5％、37℃的C02培养箱中培养，3天后可见培养瓶内形成悬浮的NSCs球，7天后进行传代培养； 

神经干细胞的分离方法：神经干细胞在培养瓶中培养3天后，用低速离心收集NSCs球，清洗3遍后用Accutase酶进行消化，约10min钟后用含10％FBS的基础培养液终止消化，通过机械吹打的方式使其分散成单细胞悬液，进行细胞计数后培养瓶中继续培养； 

神经干细胞的鉴定方法：取P3代NSCs在传代时培养液中加入终浓度为5μmol/L的BrdU进行标记，使BrdU整合到神经干细胞DNA中，7天后进行BrdU免疫荧光检测；另取P3代以后的NSCs亚克隆球用Nestin免疫荧光检测证明其胚胎源性；将P10代NSCs球接种于预先置入涂有多聚赖氨酸盖玻片的24孔培养板中，加入含10％FBS的DMEM/F12分化培养液进行分化， 2周后分别进行MAP-2、GFAP和CNP免疫荧光检测以证明NSCs的多分化潜能； 

重组慢病毒转染NSCs的鉴定，包括： 

转染效率检测是将转染后的NSCs球接种至预涂有多聚赖氨酸圆盖片的24孔板中，加入含2％FBS的DMEM/F12分化培养液，分化培养1周后终止培养，吸去培养液，加入4％多聚甲醛固定30min，PBS清洗后用Hochest33342染色，在荧光显微镜下观察结果； 

TUNEL法细胞凋亡检测是将各组NSCs分化培养2W后，吸去各孔中的培养液，用0.01MPBS清洗3遍，然后用含4％多聚甲醛的0.1PBS室温下固定20min，吸去多聚甲醛，PBS清洗3遍，用Roche公司TUNEL凋亡检测试剂盒按操作说明进行细胞凋亡检测，最后PBS洗片3遍后，在避光条件下，加入Hoechst33342，室温湿盒孵育30min。PBS洗片3遍后，中性甘油封片；在正置荧光显微镜下观察TUNEL、Hoechst阳性细胞核并摄片；用Stata10.0统计软件对各组数据进行方差分析和组间比较； 

高效液相色谱法检测分化培养液中DA含量是将各组取NSCs分化培养液1ml，加入0.1mol/L过氯酸酸化培养液，14000rpm离心15min，取上清过滤后按吴燕琼等报道的方法行高效液相色谱测定； 

其特征在于：该方法实施步骤还包括： 

三、重组病毒转染NSCs： 

所述的重组病毒的转染方法：取P3代NSCs消化制备成单细胞悬液，细胞计数后接种至24孔培养板中，每孔接种4×104个细胞，加入500μl基础培养液悬浮细胞；细胞共分4组进行转染，每组6孔：Mock组转染pLV5-GFP慢病毒阴性对照；TH组转染pLV5-TH重组慢病毒；Brn4组转染pLV5-Brn4重组慢病毒；TH+Brn4组转染pLV5-TH+Brn4重组慢病毒；每孔加入20μl1×108TU/ml感染复数为50的慢病毒和5μg/ml ploybrene，轻轻摇晃混匀后将培养板置培养箱中培养，12小时后更换新鲜分化培养基；感染72小时后，在倒置荧光显微镜下观察荧光表达情况，同时在培养基中加入1μg/ml嘌呤霉素进行筛选，以获得稳定转染的细胞；7天后对各组形成的NSCs球进行传代培养； 

四、重组慢病毒转染NSCs的鉴定。 

利用所述的利用重组慢病毒诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化的方法获得一种转染pLV5-TH+Brn4重组慢病毒的神经干细胞：是将所述的方法中所述的实施步骤三中获得的稳定转染pLV5-TH+Brn4病毒的NSCs制成单细胞悬液，用基础培养液将细胞配成2×106/ml，加入1.5ml细胞冻存管中，同时加入0.4ml小牛血清和0.1ml二甲基亚枫，混匀后密封，置4℃1小时，-20℃2小时，然后直接放入-80℃超低温冰箱中保存获得。 

所述的重组慢病毒转染NSCs的鉴定还包括：Western Blot检测、免疫荧光细胞化学检 测： 

所述的Western Blot检测是将各组转染后的NSCs球接种至24孔板中进行分化，另设一组未转染的NSCs作为对照组，分化培养2周后终止培养，按RIPA裂解液说明书的要求，提取各组中细胞的蛋白，用10％SDS-PAGE垂直电泳对蛋白进行分离，Bio-Rad半干转印系统转膜15V，50min，5％脱脂奶粉封闭后分别加入下列一抗：小鼠抗β-actin抗体、小鼠抗TH抗体、兔抗Brn4抗体、兔抗GDNF抗体、兔抗GFRα-1抗体、兔抗RET抗体，室温孵育2h，4℃过夜，次日分别加入辣根过氧化物酶结合的羊抗小鼠IgG和羊抗兔IgG二抗，室温孵育4h，然后进行曝光、显影并用所采集图像，用图像分析软件对Western blot结果进行平均光密度分析，并用统计的方法对各组数据进行方差分析和组间比较； 

所述的免疫荧光细胞化学检测是各组NSCs分化2周后终止培养，对阴性对照组和各重组病毒转染组中细胞进行免疫荧光检测，简述如下：所用一抗分别为：小鼠抗TH、大鼠抗DAT；二抗为：结合有Alexa Fluor568的山羊抗鼠IgG；一抗于4℃孵育过夜，二抗室温下孵育2h，随后用Hoechst33342进行细胞核染色30min，中间各步骤之间均用0.01M PBS进行常规洗片，最后用20％甘油缓冲液封片，并在FVlOi智能型激光共聚焦显微镜下观察TH或DAT的表达情况，并计算GFP/TH和GFP/DAT双标细胞占Hoechst标记细胞的百分比，并用统计方法对各组数据进行方差分析和组间比较； 

所述的高效液相色谱法检测分化培养液中DA含量的色谱条件：色谱柱为4.6×250mm，颗粒度5μm的Inertsil ODS-SP型十八烷基硅烷腱合硅胶柱，柱温40℃，流动相为磷酸盐缓冲液与甲醇的混合液，流速为1.0ml/min，检测器为SPD-20A型紫外检测器，检测波长280nm；定性分析：以样品峰的保留时间与标准品保留时间对照定性；定量分析：先利用DA标准品绘制标准曲线，然后在相同条件下依次进行样品测定，用外标法定量，以峰面积表示含量。 

所述的磷酸盐缓冲液是由磷酸二氢钾6.742g，磷酸氢二钾0.0114g，加水定溶至1000ml，用磷酸调节pH值至4.2，并用0.12μm纤维素脂膜过滤获得的。 

所述的流动相为磷酸盐缓冲液与甲醇的混合液，其比例为97∶3。 

所述的NSCs培养液由DMEM/F12、2％B27、20ng/mlEGF、20ng/ml bFGF组成。 

所述的慢病毒的感染复数为50。 

有益效果 

一、我们从鼠胚中脑组织中分离得到的细胞具有不断增殖和自我更新能力，并具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的多分化潜能，是中枢神经系统的干细胞； 

二、成功构建带有目的基因TH和Brn4的慢病毒载体，转染NSCs后外源性基因能在 细胞内稳定表达，得到大鼠NSCs-TH+Brn4细胞株； 

NSCs-TH+Brn4在体外分化后能产生较高比例的TH阳性多巴胺能神经元，且这些神经元在形态、表型和功能上均较为成熟。Brn4能促进神经营养因子GDNF及其受体GFRα-1和Ret的高表达，同时还具有抑制细胞凋亡的功能，这些对于多巴胺神经元的分化、成熟以及维持其存活可能起到了重要的作用。 

附图说明

图1为慢病毒载体的构建及慢病毒包装试验结果图； 

图2为NSCs的培养、分离及鉴定结果图； 

图3为重组病毒转染NSCs的效率检测结果图； 

图4为Western blot检测结果图； 

图5为免疫荧光检测结果图； 

图6为细胞凋亡检测结果图。 

具体实施方式

结合附图，对本发明做进一步地说明： 

第一部分体外实验 

转染重组慢病毒的神经干细胞的制备和该神经干细胞的鉴定 

实验材料 

1.1、实验动物 

孕14d Sprague-Dawley(SD)大鼠，清洁级，由南通大学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK(苏)2002-0019。 

1.2实验仪器 

(1)SPD-20A型紫外检测器(日本Shimadzu公司)； 

(2)C02培养箱(法国Jouan公司)； 

(3)超净工作台(SW-CJ-1F，苏州安泰空气技术有限公司)； 

(4)低温冷冻离心机(德国Beckman公司)； 

(5)Leica DMR正置荧光显微镜(德国Leica公司)； 

(6)Leica DMIRB倒置荧光显微镜(德国Leica公司)； 

(7)超低温冰箱(美国Nuaire公司)； 

(8)SDS-PAGE电泳槽及转膜装置(Bio-Rad公司)； 

(9)LeicaQwin图像分析系统(Leica公司)； 

(10)Molecular Imager ChemiDoc XRS System采集图像(Bio-Rad公司)； 

(11)FVlOi智能型激光共聚焦显微镜(Olympus公司)； 

(12)TUNEL凋亡检测试剂盒(Roche公司)； 

(13)细胞培养瓶(BD公司)； 

(14)200目尼龙网(BD公司)； 

(15)细胞冻存管(BD公司)； 

(16)纤维素脂膜(BD公司)； 

(17)Inertsil ODS-SP型十八烷基硅烷腱合硅胶柱(Shimadzu公司)； 

(18)Quantity One图像分析软件(Bio-Rad公司)。 

1.3实验试剂 

1.3.1慢病毒构建试剂 

(1)pLV5-EFla-GFP慢病毒(Genepharma公司)； 

(2)限制性核酸内切酶BamHI(MBI)； 

(3)限制性核酸内切酶NotI(MBI)； 

(4)T4DNA Ligase(NEB公司)； 

(5)DNA纯化试剂盒(Axygen公司)； 

(6)DH5α感受态细胞(TransGen Biotech公司)； 

(7)氨苄抗生素溶液(Invitrogen公司)； 

(8)包装质粒Packaging Mix(Genepharma公司)； 

(9)293FT细胞(Invitrogen公司)； 

(10)DMEM+10％FBS(Invitrogen公司)； 

(11)Lipofectamine2000(Invitrogen公司)； 

(12)Opti-MEM培养液(Invitrogen公司)； 

(13)0.05％Trypsin(Invitrogen公司)。 

1.3.2细胞培养主要试剂 

(1)DMEM培养基(Dulbecco’s Modified EagleMedium，Cat.No.12100-038，Gibco公司)； 

(2)F12培养基(F12Nutrient Mixture，Cat.No.21700-026，Gibco公司)； 

(3)无血清培养添加剂B27(B27Supplement，Cat.No.17504-044，Gibco公司)； 

(4)胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS，Cat.No.16140-087，Gibco公司)； 

(5)表皮生长因子(Epidermal Growth Factor，EGF，Cat.No.E4127，Sigma公司)； 

(6)碱性成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor-Basic，bFGF，Cat.No.F0291，Sigma公司)； 

(7)细胞消化液Accutase(Sigma公司)； 

(8)BrdU(5-Bromo-2-deoxyUridine,sigma公司)； 

(9)RIPA裂解液(碧云天，P0013B)； 

(10)二甲基亚枫(dimethyl sulfoxide，sigma公司)。 

(11)嘌呤霉素(puromycm，sigma公司)。 

1.3.3主要抗体 

(1)小鼠抗TH(1∶200，Millipore公司)； 

(2)大鼠抗DAT(1∶5000，Millipore公司)； 

(3)结合有Alexa Fluor568的山羊抗鼠IgG(1∶500，Invitrogen公司)； 

(4)小鼠抗β-actin抗体(1∶2000，Sigma公司)； 

(5)小鼠抗TH抗体(1∶200，Millipore公司)； 

(6)兔抗Bm4抗体(1∶1000，Santa Cruz公司)； 

(7)兔抗GDNF抗体(1∶200，Abcam公司)； 

(8)兔抗GFRα-1抗体(1∶500，Abcam公司)； 

(9)兔抗RET抗体(1∶5000，Abcam公司)； 

(10)辣根过氧化物酶结合的羊抗小鼠IgG(1∶1000，Pierce公司)； 

(11)羊抗兔IgG(1∶1000，Pierce公司)； 

(12)Hoechst33342(1∶2000，sigma公司)。 

1.4实验方法 

一、重组慢病毒载体构建 

(1)目的基因获取 

1)引物设计 

根据Genepharma公司pLV5-EF1a-GFP慢病毒表达载体的要求和GenBank大鼠TH(NM_012740)和Bm4(NM_017252)的cDNA功能全长序列设计合成PCR引物，上游引物5’端加BamHI位点序列，下游引物5’端加NotI位点序列，引物序列TH-1F、TH-1R、Brn4-1F、Brn4-1R、TH+Brn4、TH+Brn4如序列表： 

2)扩增目的基因片段并且胶回收 

(1)PCR体系如下： 

(2)PCR条件如下： 

95℃  3min 

(94℃ 30sec，58℃30sec，68℃30sec)循环30次 

68℃  10min； 

(3)琼脂糖凝胶电泳，并使用DNA纯化试剂盒回收目的基因片段。 

3)重组质粒的构建和测序鉴定 

(1)用BamHI和NotI酶切目的基因片段，37℃酶切30min，所用酶切体系为： 

(2)用BamHI和NotI酶切pLV5-EF1a-GFP质粒，酶切体系为： 

(3)37℃酶切30min后对酶切产物进行电泳并行胶回收； 

(4)连接目的基因片段和载体16℃连接2h，连接体系为： 

(5)取5μl连接产物转化DH5α感受态细胞； 

(6)挑取阳性克隆，并测序验证。 

(2)慢病毒的包装和病毒滴度的测定 

用构建的慢病毒载体pLV5-EF1a-GFP和包装质粒(pGag/Pol、pRcv、pVSV-G)共转染293T细胞并进行慢病毒包装，收集病毒原液，超速离心浓缩，并测定滴度。 

1)慢病毒包装 

(1)取细胞状态良好，处于对数生长期的293T细胞，细胞计数后，按照每个10cm的培养皿6×10⁶个细胞数接种于培养皿中，37℃、5％CO₂的培养箱中培养过夜； 

(2)第2天转染前移去培养液，换上5ml Opti-MEM培养液； 

(3)取9μg Packaging Mix和3μg慢病毒质粒加入37℃预热1.5ml Opti-MEM中，轻轻混匀； 

(4)取36μl lipofectamine2000加入1.5ml Opti-MEM中，轻轻混匀，室温放置5min； 

(5)混合质粒溶液(3)和lipofectamine2000稀释液(4)，置室温20min； 

(6)将3ml质粒脂质体复合物(5)小心地加入到细胞培养皿中，轻轻混匀，37℃、5％CO₂的培养箱中孵育4～6h后，更换完全培养液DMEM+10％FBS； 

(7)48h后收集细胞培养上清，3000rpm离心10min，去除细胞和碎片，并用0.45μm的滤器过滤； 

(8)将pLV5-TH、pLV5-Brn4或pLV5-TH+Bm4病毒原液在50000g下超速离心2h，去除上清，重悬于2ml DMEM培养液中，分装200μl每管，放置于-80℃保存备用。 

2)慢病毒活性滴度测定 

(1)慢病毒稀释用培养基的配制：DMEM中加入2％FBS，再添加8μg/ml的Polybrene，混合均匀后备用。 

(2)慢病毒液稀释：慢病毒原液用慢病毒稀释用培养基10倍比例稀释后，各取100ul感染96孔板中的HEK293细胞，具体步骤如下： 

①1号稀释液：5μl慢病毒液+245μl病毒稀释用培养基，每100μl中含慢病毒液2×10^-3ml； 

②2号稀释液：25μl1号稀释液+225μl病毒稀释用培养基，100μl中含慢病毒液2×10^-4ml； 

③3号稀释液：25μl2号稀释液+225μl病毒稀释用培养基，100μl中含慢病毒液2×10^-5ml； 

④4号稀释液：25μl3号稀释液+225μl病毒稀释用培养基，100μl中含慢病毒液2×10^-6ml； 

⑤5号稀释液：25μl4号稀释液+225μl病毒稀释用培养基，100μl中含慢病毒液2×10^-7ml； 

…… 

(3)小心吸去96孔板中的培养基，轻轻混匀各管慢病毒稀释液，各取100μl加入每孔细胞中，每个稀释度两个重复。放入37℃的细胞培养箱中培养过夜； 

(4)计算慢病毒滴度：72h后，在荧光显微镜下观察各孔中荧光细胞数量，病毒滴度为各孔中表达荧光的细胞数平均数除以每孔中含有的慢病毒液体积。 

二、神经干细胞的分离、培养及鉴定 

无菌条件下取孕14d的SD胎鼠(南通大学实验动物中心提供)腹侧中脑组织，用吸管反复吹打直至为细胞悬液，并经200目尼龙网过滤，收集过滤后的细胞悬液，用基础培养基清洗3遍后重悬于NSCs培养液中(由DMEM/F12、2％B27、20ng/mlEGF、20ng/ml bFGF等组成)，经细胞计数和活力观察后，按1×105/ml细胞密度接种于含有10ml NSCs培养液的细胞培养瓶中，置于5％、37℃的CO2培养箱中培养。3天后可见培养瓶内形成悬浮的NSCs球，7天后进行传代培养。低速离心收集NSCs球，清洗3遍后用Accutase酶进行消化，约10min钟后用含10％FBS的基础培养液终止消化，通过机械吹打的方式使其分散成单细胞悬液，进行细胞计数后培养瓶中继续培养。取P3代NSCs在传代时培养液中加入BrdU(终浓度为5μtmol/L)进行标记，使BrdU整合到神经干细胞DNA中，7天后进行BrdU免疫荧光检测。另取P3代以后的NSCs亚克隆球用Nestin免疫荧光检测证明其胚胎源性。将P10代NSCs球接种于预先置入涂有多聚赖氨酸盖玻片的24孔培养板中，加入含10％FBS的DMEM/F12分化培养液进行分化，2周后分别进行MAP-2、GFAP和CNP免疫荧光检测以证明NSCs的多分化潜能。 

三、重组病毒转染NSCs 

取P3代NSCs消化制备成单细胞悬液，细胞计数后接种至24孔培养板中，每孔接种4×104个细胞，加入500μl基础培养液悬浮细胞。细胞共分4组进行转染，每组6孔：Mock组转染pLV5-GFP慢病毒阴性对照；TH组转染pLV5-TH重组慢病毒；Brn4组转染pLV5-Brn4重组慢病毒；TH+Brn4组转染pLV5-TH+Brn4重组慢病毒。每孔加入20μl1×108TU/ml慢病毒(MOI＝50)和Sμg/ml ploybrene，轻轻摇晃混匀后将培养板置培养箱中培养，12小时后更换新鲜分化培养基。感染72小时后，在倒置荧光显微镜下观察荧光表达情况，同时在培养基中加入1μg/ml嘌呤霉素进行筛选，以获得稳定转染的细胞。7天后对各组形成的NSCs球进行传代培养。将稳定转染pLV5-TH+Bm4病毒的NSCs制成单细胞悬液，用基础培养液将细胞配成2×106/ml，加入1.5ml细胞冻存管中，同时加入0.4ml小牛血清和0.1ml二甲基亚枫，混匀后密封，置4℃1小时，-20℃2小时，然后直接放入-80℃超低温冰箱中保存。 

四、转染效率检测 

由于报告基因GFP可分别与目的基因TH和Brn4融合表达，因此可通过观察绿色荧光来检测目的基因TH和Brn4在NSCs中是否表达。将转染后的NSCs球接种至预涂有多聚赖氨酸圆盖片的24孔板中，加入含2％FBS的DMEM/F12分化培养液，分化培养1周后终止培 养，吸去培养液，加入4％多聚甲醛固定30min，PBS清洗后用Hochest33342(1∶2000，sigma公司)染色，在荧光显微镜下观察结果。每张盖玻片随机选取5个视野，分别摄取同一视野内GFP和Hochest阳性的细胞照片，将照片导入LeicaQwin图像分析系统进行重叠处理，计数荧光阳性细胞数和总细胞数，两者的比值即为转染效率。 

五、Western Blot检测 

将各组转染后的NSCs球接种至24孔板中进行分化，另设一组未转染的NSCs作为对照组，分化培养2周后终止培养，按RIPA裂解液(碧云天，P0013B)说明书的要求，提取各组中细胞的蛋白，根据本课题组报道的方法，用10％SDS-PAGE垂直电泳对蛋白进行分离，Bio-Rad半干转印系统转膜15V，50min，5％脱脂奶粉封闭后分别加入下列一抗：小鼠抗β-actin抗体(1∶2000，Sigma公司)、小鼠抗TH抗体(1∶200，Millipore公司)、兔抗Brn4抗体(1∶1000，Santa Cruz公司)、兔抗GDNF抗体(1∶200，Abcam公司)、兔抗GFRα-1抗体(1∶500，Abeam公司)、兔抗RET抗体(1∶5000，Abcam公司)，室温孵育2h，4℃过夜。次日分别加入辣根过氧化物酶(HRP)结合的羊抗小鼠IgG(1∶1000，Pierce)和羊抗兔IgG(1∶1000，Pierce)二抗，室温孵育4h，然后进行曝光、显影并用Molecular Imager ChemiDoc XRS System采集图像(Bio-Rad公司)，用Quantity One图像分析软件(Bio-Rad公司)对Western blot结果进行平均光密度分析，用Stata10.0统计软件对各组数据进行方差分析和组间比较。 

六、免疫荧光细胞化学检测 

各组NSCs分化2周后终止培养，按本课题组的报道，对阴性对照组和各重组病毒转染组中细胞进行免疫荧光检测，简述如下：所用一抗分别为：小鼠抗TH(1：200，Millipore公司)、大鼠抗DAT(1：5000，Millipore公司)；二抗为：结合有Alexa Fluor568的山羊抗鼠IgG(1：500，Invitrogen公司)；一抗于4℃孵育过夜，二抗室温下孵育2h，随后用Hoechst33342进行细胞核染色30min，中间各步骤之间均用0.01M PBS进行常规洗片，最后用20％甘油缓冲液封片，并在FVlOi智能型激光共聚焦显微镜(Olympus公司)下观察TH或DAT的表达情况，并计算GFP/TH和GFP/DAT双标细胞占Hoechst标记细胞(细胞总数)的百分比，用Stata10.0统计软件对各组数据进行方差分析和组间比较。 

七、TUNEL法细胞凋亡检测 

各组NSCs分化培养2W后，吸去各孔中的培养液，用0.01M PBS清洗3遍，然后用含4％多聚甲醛的0.1PBS室温下固定20min；吸去多聚甲醛，PBS清洗3遍，用Roche公司TUNEL凋亡检测试剂盒按操作说明进行细胞凋亡检测。最后PBS洗片3遍后，在避光条件下，加入Hoechst33342(1：2000)，室温湿盒孵育30min。PBS洗片3遍后，中性甘油封片。 在正置荧光显微镜(Leica DMR，德国)下观察TUNEL、Hoechst阳性细胞核并摄片。用Stata10.0统计软件对各组数据进行方差分析和组间比较。 

八、高效液相色谱法(HPLC)检测分化培养液中DA含量 

各组取NSCs分化培养液1ml，加入0.1mol/L过氯酸酸化培养液，14000rpm离心15min，取上清过滤后按吴燕琼等报道的方法行高效液相色谱测定。色谱条件：色谱柱为Inertsil ODS-SP型十八烷基硅烷腱合硅胶柱(4.6×250mm，颗粒度5μm)，柱温40℃；流动相为磷酸盐缓冲液(磷酸二氢钾6.742g，磷酸氢二钾0.0114g，加水定溶至1000ml，用磷酸调节pH值至4.2，并用0.12μm纤维素脂膜过滤)与甲醇的混合液(97∶3)；流速为1.0ml/min；检测器为SPD-20A型紫外检测器，检测波长280nm。定性分析：以样品峰的保留时间与标准品保留时间对照定性。定量分析：先利用DA标准品绘制标准曲线，然后在相同条件下依次进行样品测定，用外标法定量，以峰面积表示含量。 

1.5实验结果 

慢病毒载体的构建及慢病毒包装 

如图1A所示，以大鼠中脑mRNA作为模板，PCR扩增TH和Bm4基因全长，与pLV5-EF1a-GFP慢病毒表达载体进行连接，并且转化DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆并经测序验证，慢病毒载体pLV5-TH、pLV5-Brn4和pLV5-TH+Brn4构建成功。用构建的慢病毒载体和包装质粒共转染293T细胞包装病毒，收集病毒原液，超速离心浓缩，并测定滴度。慢病毒载体和包装质粒转染293T细胞24h后，在荧光显微镜下见病毒的绿色荧光，如图1B所示，48h后收集病毒原液，超速离心浓缩，所得慢病毒做梯度稀释后感染HEK293细胞，在⑤号稀释液孔(100ul中含慢病毒液2×10-7ml)中观察到表达绿色荧光的细胞分别为16个和24个，病毒滴度为各孔中表达荧光细胞数平均数除以每孔中含有的慢病毒液体积，因此病毒滴度为：(16+24)/2＝20TU，20TU/(2×10-7)ml＝1.0×108TU/ml。 

NSCs的培养、分离及鉴定 

如图2所示，本发明所述的NSCs在培养最初1-2天，可见培养瓶底有许多小圆形死亡细胞及其碎片和少量贴壁的胶质样细胞，培养液中悬浮很多未贴壁的单细胞和小细胞团。从第3天开始，可见悬浮的细胞团中出现胞体较大，胞浆颜色较深，胞核/胞浆比例较大的未成熟细胞，可见许多细胞正在分裂。如图2A所示，随后细胞团中的细胞数目迅速增加，第4天左右即形成含有数十个细胞的细胞球。如图2B所示，此后细胞球中的细胞数目继续增加，细胞球继续增大，至1周左右细胞球增大已不明显，每个神经球约含数百个细胞，组成神经球的细胞大小基本一致，形态规则，无突起生长。传代后的细胞增殖生长情况和原代相似，约1周左右即形成大小恒定的神经球。如图2C所示，BrdU标记及免疫荧光检测显示新形成 的细胞克隆球中的大多数细胞胞核呈现强绿色荧光，呈BrdU免疫反应阳性，表明这些克隆细胞是由所接种的细胞不断分裂增殖而来。如图2D所示，Nestin免疫荧光检测显示细胞克隆球内的细胞均呈现强红色荧光，表明神经干细胞均呈Nestin抗原阳性，为胚胎源性细胞。如图2E所示，NSCs球分化2周后可见每个神经球周围约有100～150个呈红色荧光的MAP-2阳性神经元，细胞胞体较小，呈圆形、椭圆形或三角形，胞核明显，不着色，突起少而细长，以双突起为主；如图2F所示，呈绿色荧光的GFAP阳性星形胶质细胞数目最多，每个神经球周围约有500～800个，细胞扁平、胞体较大、形态不规则，圆形胞核明显，从胞体伸出许多分枝状的突起；如图2G所示，呈红色荧光的CNP阳性少突胶质细胞最少，每个神经球周围只有30～50个，常成群分布。这些细胞胞体较小，从胞体发出许多短小而细长的突起。以上结果表明我们分离培养的神经细胞具有胚胎源性、分裂增殖能力和多分化潜能，是神经系统的干细胞。 

重组病毒转染NSCs的效率检测 

如图3所示，NSCs感染病毒后倒置显微镜下未见明显的细胞死亡，细胞活力较好、折光性很强并可见细胞增殖分裂。转染36h后，在荧光显微镜下可见细胞内出现绿色荧光，其中对照组荧光较强、其它各组荧光较弱，说明导入目的基因的重组病毒转染效率有所降低。随着时间延长荧光逐渐增多增强，转染后72h荧光细胞数量及荧光强度达高峰，其中TH、Brn4、和TH+Brn4三组之间没有明显差异，细胞经Hochest33342复染后在荧光显微镜下摄像，经Leica Qwin图像分析得出四组转染效率相似，分别为89.12％、92.36％、91.81％。重组病毒在NSCs中表达时间较长，细胞传代培养后绿色荧光没有明显减弱。经传代3次后我们将稳定转染pLV5-TH+Brn4病毒的NSCs冻存保种，得到大鼠NSCs-TH+Brn4细胞株。 

四、Western blot检测结果 

如图4A所示，Western Blot结果显示各组在分子量为62kD和39kD处可见较弱的内源性TH及Brn4阳性条带。在重组慢病毒转染后，TH组及TH+Brn4组中TH蛋白的相对表达量较对照组和Mock组明显增高，而Brn4组及TH+Brn4组中Brn4蛋白的相对表达量明显增高，如图4B所示，蛋白条带平均光密度值具有统计学差异(*P＜0.01)，说明外源性TH和Brn4基因已成功导入NSCs中并能特异性地增强细胞内相应蛋白的表达。同时，各组NSCs中还检测到微弱的内源性GDNF及其受体GFRα-1、Ret蛋白的表达，其分子量分别为24kD、50kD、124kD。在慢病毒转染后，Brn4组及TH+Brn4组中GDNF、GFRα-1和Ret蛋白的相对表达量较其它各组明显增高，蛋白条带平均光密度值具有统计学差异(*P＜0.01)，提示NSCs中Brn4蛋白的过表达能诱导GDNF、GFRα-1和Ret蛋白的表达增高。 

五、免疫荧光检测结果 

如图5所示，TH免疫荧光检测结果显示分化培养2周后，在对照组、Mock组和Brn4组中TH阳性神经元很少，统计学结果表明TH阳性细胞分化率分别为3.05％、2.97％、4.59％，三组之间无显著差异。如图5K所示，TH组和TH+Brn4组中TH阳性神经元明显增多，细胞分化率分别达到54.5％、65.71％，两组之间存在统计学差异，且如图6E所示TH+Brn4组中TH阳性神经元形态较为成熟，细胞胞体较大，突起细长丰富，局部交织成网状。如图5L所示，DAT免疫荧光检测结果显示，对照组、Mock组和Brn4组中很少检测到DAT阳性神经元，DAT阳性细胞分化率分别为1.41％、1.64％、1.58％；TH组中DAT阳性神经元明显增多，DAT阳性细胞分化率为16.12％，而TH+Brn4组中DAT阳性神经元最多，DAT阳性细胞分化率达到32.28％，两组之间差异具有统计学意义。说明转染慢病毒pLV5-TH后，能够促进NSCs向多巴胺能神经元分化，而转染pLV5-Brn4不能诱导NSCs向TH阳性的多巴胺能神经元分化，但同时转染TH+Brn4基因则能促进NSCs分化为形态更为成熟，并且表达DAT的成熟多巴胺能神经元。 

六、细胞凋亡检测结果 

如图6所示，TUNEL法检测凋亡细胞核显示红色荧光，其中Brn4组和TH+Brn4组TUNEL阳性凋亡细胞数量明显少于其它各组。各组凋亡细胞百分率经方差分析和两两比较结果显示，Brn4组和TH+Brn4组TUNEL阳性细胞百分率远远低于与对照组，而Mock组、TH组与对照组之间无显著性差异。提示Bm4蛋白高表达能抑制细胞凋亡，提高细胞的存活率。 

七、高效液相色谱检测结果 

经高效液相色谱法检测分析，对照组、Mock组和Brn4组的培养液中多巴胺含量很低，TH组多巴胺含量略有升高，而TH+Brn4组多巴胺含量最高，达到6.78±1.58μg/ml。提示Brn4和TH基因共转染后能促进NSCs分化发育为功能成熟的多巴胺能神经元。各组数据经方差分析和两两比较结果显示，对照组、Mock组和Brn4组之间无显著性差异，其余各组间均存在显著性差异(表1)。 

表-1HPLC检测各组分化培养液中多巴胺含量结果

*P＜0.01，与对照组相比，#P＜0.01，与TH组相比。