核受体相关因子1基因转染骨髓源性神经干细胞体外诱导向多巴胺能神经元分化的实验研究

摘要

目的:
　　观察核受体相关因子1(Nurr1)基因转染骨髓源性神经干细胞在体外诱导分化为多巴胺能神经元的作用，拟探讨提高神经干细胞向多巴胺能神经元分化的比例。
　　方法:
　　1.通过全骨髓贴壁法分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞，流式细胞术检测细胞免疫表型。
　　2.取P4～6生长良好的骨髓间充质干细胞，接种于6孔板中，培养液改为无血清神经干细胞培养基(DMEM/F12+20μg/L bFGF+20μg/L EGF+2％B27)，诱导骨髓间充质细胞向神经干细胞分化，采用免疫荧光法和流式细胞术鉴定。
　　3.采用脂质体法将pcDNA3.1-hygro-Nurr1转染骨髓源性神经干细胞，RT-PCR观察Nurr1基因的表达情况，并进行G418筛选。
　　4.将骨髓源性神经干细胞分为4组进行分化实验:其中将未转染的骨髓源性神经干细胞随机分为对照组，脑源性神经营养因子组;将筛选出的重组质粒转染阳性的神经干细胞分为核受体相关因子1组和核受体相关因子1+脑源性神经营养因子组，分化培养后，免疫荧光法和RT-PCR检测酪氨酸羟化酶的表达量。
　　结果:
　　1.通过贴壁法分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞，5代后细胞呈均一梭形漩涡样生长，高表达CD90及CD29，几乎不表达CD45及CD34。
　　2.在无血清培养条件下诱导出的骨髓源性神经干细胞均表达Nestin抗原，流式细胞仪检测P4神经干细胞，Nestin阳性率达到(96.7±2.1)％。
　　3.RT-PCR显示重组质粒转染的骨髓源性神经干细胞4d后核受体相关因子1高表达，分化结果显示:核受体相关因子1+脑源性神经营养因子组细胞内酪氨酸羟化酶在mRNA水平上的表达量最高，神经干细胞贴壁分化后各组的酪氨酸羟化酶阳性细胞比例均明显高于对照组，其中以核受体相关因子1+脑源性神经营养因子组分化比例最高，为(52.44±15.9)％。
　　结论:
　　1.利用全骨髓贴壁培养法可迅速高效地分离和纯化大鼠骨髓间充质干细胞，并在无血清神经干细胞培养基中诱导出神经干细胞，作为下一步实验的种子细胞。
　　2.利用脂质体介导重组Nurr1质粒可以成功转染骨髓源性神经干细胞，外源性Nurr1基因可以在BM-NSCs中表达。
　　3.核受体相关因子1基因转染可促进骨髓源性神经干细胞向多巴胺能神经元分化，并通过脑源性神经营养因子的诱导作用，在体外可获得大量的多巴胺能神经元。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 研究背景

1．2 研究目的

1．3 研究内容

2 大鼠骨髓间充质干细胞向神经干细胞分化的实验研究

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

2．4 结论

3 核相关受体因子1基因转染骨髓源性神经干细胞

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

3．4 结论

4 骨髓源性神经干细胞向多巴胺能神经元分化

4．1 材料与方法

4．2 结果

4．3 讨论

4．4 结论

参考文献

综述 神经干细胞向多巴胺能神经元定向分化的研究进展

致谢

附录一 缩写词中英文对照表

附录二 硕士在读期间科研情况